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문제 정의
- 위에서와 같이 서양의학과 한의학 모두 감정과 정신적인 여러 변화들이 결과적으로 육체의 질병을 야기시킬 수 있다고 보았으므로, 본 연구에서는 한의학에서의 병인인 氣鬱이나 氣逆에 대해 行氣散結 및 降逆化痰하는 처방을 활용하여 스트레스로 인한 직접적인 생체의 병리적 변화를 관찰하는 것이 의미 있는 일이라고 생각되어, 생쥐에 심리적 스트레스 부하 장치를 이용하여 인위적인 심리적 스트레스를 유발하여 그 결과를 살펴보았다.
- 이에 저자는 半夏厚朴湯이 심리적 스트레스에 미치는 영향을 확인하기 위해 스트레스 부하 장치에서 일정 시간 동안 스트레스를 유발한 후 스트레스와 관련 있는 지표인 혈청 중 corticosterone, 뇌 조직 내의 noradrenaline, 뇌 조직 내지질 과산화물, elevated plus-maze로 야기한 스트레스에 대한 항불안 효과를 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1-butanol 4㎖을 첨가하여 완전히 섞은 다음 800×g에서 25 분간 원심분리 한 후, 상층액의 흡광도를 534 ㎚와 510 ㎚에서 측정하였다.
- 半夏厚朴湯 2 첩 분량인 96 g을 증류수 1,500 ㎖과 함께 전기 약탕기 (DWP-1800T, 대웅, 한국)로 100℃에서 2 시간 전탕한 후 추출액을 부직포를 이용하여 찌꺼기를 제거한 후 동결 건조기 (SFDSM06, 삼원, 한국)를 이용하여 5.1 g의 건조 추출물을 얻었다. 이를 냉동실에 신선하게 보관하였다가 실험 직전에 필요한 농도로 증류수에 녹여 시료로 사용하였다.
- 半夏厚朴湯이 심리적 스트레스를 얼마나 해소시킬 수 있는 지를 확인하기 위하여 심리적 스트레스를 부하하면서 半夏厚朴湯 추출물을 100 ㎎/㎏로 5일간 투여하면서 스트레스 및 이로 인한 병리적 지표들을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 간략히 기술하면, 희생된 생쥐의 뇌를 적출하여 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.4)로 된 냉장 보관 용액을 혈관 내로 주입하여 혈액을 제거한 다음 Stadie-Riggs microtome(Tomas, U.S.A.)을 사용하여 가로 및 세로의 길이는 각각 1㎝, 두께는 약 0.3～0.5 ㎜ 되도록 절편을 제작하였다.
- 노르아드레날린의 형광물질은 형광광도계를 사용하여 excitation 380 ㎚, emission 495 ㎚에서 측정하였다. 노르아드레날린 표준물질은 100 ㎍/㎖ 농도로 준비하여 표준검량선에 의거 노르아드레날린의 분비량(ng/g brain)을 정량하였다.
- 추출한 후 요오드(iodine) 시약 2 ㎖을 첨가하여 형광화합물로 전환시킨다. 노르아드레날린의 형광물질은 형광광도계를 사용하여 excitation 380 ㎚, emission 495 ㎚에서 측정하였다. 노르아드레날린 표준물질은 100 ㎍/㎖ 농도로 준비하여 표준검량선에 의거 노르아드레날린의 분비량(ng/g brain)을 정량하였다.
- 생쥐를 ether로 가볍게 마취시키고 3 ㎖ 용량의 일회용 주사기 (삼우, 한국)로 혈액을 복부 대정맥으로부터 1.0 ㎖ 취하여 실온에 30 분 방치한 후 냉장원심분리기 (VS6000CFN, Vision, 한국)로 1,300×g로 20 분간 원심분리시켜 상층의 혈청을 얻었다.
- 스트레스 부하 실험은 Ogawa 등18)이 개발한 것을 Shibasaki 등19)이 보완하여 개발한 심리적 스트레스 부하 장치를 사용하여 Fig. 1과 같이 동물 실험을 통해서도 사람의 일상적인 심리적 스트레스를 대신할 수 있도록 고안․제작된 communication box를 사용하여 ICR mouse를 실험 동물로 하여 사회․심리적 스트레스 상태를 유발한 다음 半夏 추출물을 실험군에 투여하여 스트레스의 해소에 어느 정도 영향을 미치는가를 평가하였다.
- 실험동물을 신체적 스트레스군, 대조군 및 실험군의 3 개그룹으로 나누어 신체적 스트레스군은 전기적 충격을 부하하였고, 대조군은 신체적 스트레스군을 옆에서 지켜보는 것으로써 정신적 스트레스를 부하한 후 증류수를 투여하였고, 실험군에는 정신적 스트레스를 부하한 후 半夏厚朴湯 추출물을 100 ㎎/㎏로 투여하였다. 투여 시기와 방법은 각각 1일 1 회5 일간 스트레스 부하 30 분 전에 경구 투여하였다.
- 중심 platform은 가로 10 ㎝ 및 세로 10 ㎝로 하였다. 실험을 시작할 때 생쥐는 maze의 open arm에 머리를 밖으로 향하게 놓은 다음 maze를 자유롭게 탐색하도록 하였다. 행동은 5 분간 관찰하였으며, 생쥐가 open arm과 closed arm에 머문 시간, 각 arm의 출입 횟수 및 총 이동거리 등을 측정하였다.
- 약물 투여가 종료된 후 항불안 효과의 측정은 합판으로 제작된 elevated plus-maze를 이용하였다. 이 장치는 바닥에서 50 ㎝ 높이에 설치된 십자형 미로로서, 길이 50 ㎝ 폭 10 ㎝의 4개의 통로 가운데 마주보는 2 개는 개방되어 있고, 크기가 동일한 다른 2 개의 통로는 높이 40 ㎝의 벽으로 둘러싸여 있다.
- 원심분리하여 상층액을 제거하고 세척한 chloroform 층 9 ㎖를 취하여 3 ㎖의 형광시약 (H2SO4 : 50% C2H5OH = 2.4 : 1)을 가하고 진탕한 뒤, 800×g에서 5분간 원심분리하고 chloroform층을 제거하고 잔류액을 2 시간 동안 실온에 방치한 다음 형광광도계를 사용하여 excitation 470 ㎚, emission 520 ㎚에서 측정하였다.
- 제작된 뇌 조직 절편을 1% phosphoric acid 3 ㎖과 0.6% thiobarbituric acid 용액 1 ㎖을 첨가하여 끓는 물에서 60 분간 중탕하였다. 1-butanol 4㎖을 첨가하여 완전히 섞은 다음 800×g에서 25 분간 원심분리 한 후, 상층액의 흡광도를 534 ㎚와 510 ㎚에서 측정하였다.
- 2)에서 측정하였는데, 일반적 사항은 저자들의 선행 연구 방법15)에 준하여 수행하였다. 즉, 半夏厚朴湯 추출물을 100 ㎎/㎏ body weight/day 용량으로 5 일 동안 경구 투여하였으며, 최종 약물 투여는 실험 시작 1시간 전에 투여가 종료되도록 하였다. 대조군은 음용수를 경구투여 하였으며 각 군은 10 마리 내외로 하였다.
- 실험동물을 신체적 스트레스군, 대조군 및 실험군의 3 개그룹으로 나누어 신체적 스트레스군은 전기적 충격을 부하하였고, 대조군은 신체적 스트레스군을 옆에서 지켜보는 것으로써 정신적 스트레스를 부하한 후 증류수를 투여하였고, 실험군에는 정신적 스트레스를 부하한 후 半夏厚朴湯 추출물을 100 ㎎/㎏로 투여하였다. 투여 시기와 방법은 각각 1일 1 회5 일간 스트레스 부하 30 분 전에 경구 투여하였다.
- 실험을 시작할 때 생쥐는 maze의 open arm에 머리를 밖으로 향하게 놓은 다음 maze를 자유롭게 탐색하도록 하였다. 행동은 5 분간 관찰하였으며, 생쥐가 open arm과 closed arm에 머문 시간, 각 arm의 출입 횟수 및 총 이동거리 등을 측정하였다.
대상 데이터
- Foot shock mice were placed individually in the eight shaded areas (foot shock compartments). Psychological mice were placed in the eight solid areas (nonfoot shock compartment). Foot shocks were delivered in shaded areas.
- 4 : 1)을 가하고 진탕한 뒤, 800×g에서 5분간 원심분리하고 chloroform층을 제거하고 잔류액을 2 시간 동안 실온에 방치한 다음 형광광도계를 사용하여 excitation 470 ㎚, emission 520 ㎚에서 측정하였다. 검량선은 표준 코티코스테론을 99% 에탄올에 용해시켜 표준 용액으로 사용하였다.
- 즉, 半夏厚朴湯 추출물을 100 ㎎/㎏ body weight/day 용량으로 5 일 동안 경구 투여하였으며, 최종 약물 투여는 실험 시작 1시간 전에 투여가 종료되도록 하였다. 대조군은 음용수를 경구투여 하였으며 각 군은 10 마리 내외로 하였다.
- 동물은 체중 20±2g의 ICR계 수컷 생쥐를 대한실험동물(대한실험동물, 한국)에서 구입하여 본 대학 동물사육실에서 고형사료 (삼양사료, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 2주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 半夏厚朴湯은 金匱要略17)에 수록된 내용에 준하여 환산된 용량을 사용하였으며, 본 실험에 사용된 약재는 동신대학교 부속광주한방병원 약제과에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다. 한 첩의 분량은 다음과 같다 (Table 1).
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준오차(mean±SE)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 student's t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SPSS(Ver. 12)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준오차(mean±SE)로 나타내었으며, 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 student's t-test로 검정하여 p-값이 0.
이론/모형
- 1-butanol 4㎖을 첨가하여 완전히 섞은 다음 800×g에서 25 분간 원심분리 한 후, 상층액의 흡광도를 534 ㎚와 510 ㎚에서 측정하였다. MDA 값은 단백질 1 ㎎ 당 pmoles로 표시하였으며, 단백질 농도는 Bradford의 방법23)으로 측정하였다.
- 뇌 조직 내 지질 과산화물은 대사산물인 malondialdehyde(MDA) 함량을 측정함으로써 평가하였는데 Uchiyama 등의 방법22)에 준하여 측정하였다. 간략히 기술하면, 희생된 생쥐의 뇌를 적출하여 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Tris-HCl(pH 7.
- 뇌세포에서 노르아드레날린의 분비는 Kohno의 방법21)에 따라 측정하였다. 뇌 조직 중 dorsal cortex 쪽을 분리하여 0.
- 항불안 효과는 생쥐를 이용하여 elevated plus-maze(Fig. 2)에서 측정하였는데, 일반적 사항은 저자들의 선행 연구 방법15)에 준하여 수행하였다. 즉, 半夏厚朴湯 추출물을 100 ㎎/㎏ body weight/day 용량으로 5 일 동안 경구 투여하였으며, 최종 약물 투여는 실험 시작 1시간 전에 투여가 종료되도록 하였다.
- 0 ㎖ 취하여 실온에 30 분 방치한 후 냉장원심분리기 (VS6000CFN, Vision, 한국)로 1,300×g로 20 분간 원심분리시켜 상층의 혈청을 얻었다. 혈청 중 코티코스테론 함량은 Zenker 등의 방법20)에 준해 측정하였다. 즉 혈청 0.
성능/효과
- 1. 혈청 중 corticosterone은 스트레스에 의해 증가되었으며, 半夏厚朴湯 추출물 투여로 감소되었다.
- 2. 뇌 조직 내 noradrenaline의 함량은 스트레스에 의해 감소되었으며, 半夏厚朴湯 추출물의 투여로 대조군에 비해 실험군에서 유의하게 증가하였다.
- 3. 뇌 조직 내 지질 과산화물의 함량은 스트레스에 의해 증가되었으며, 半夏厚朴湯 추출물의 투여로 감소의 경향을 보이기는 했으나 유의성은 없었다.
- 4. 半夏厚朴湯 추출물 투여로 Elevated plus-maze에서 open armdp 머무는 시간이 실험군에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 그러나 open armrhk closed arm 사이의 이동 횟수에는 변화가 없었다.
- Elevated plus-maze를 이용한 半夏厚朴湯 추출물의 항불안 효과를 관찰한 결과 (Fig. 6) open arm에서 머무는 시간이 정상군에서는 136.0±5.1초 인데 비해, 심리적 스트레스를 받은 대조군에서는 61.3±7.0초로 유의하게 증가하였으며, 실험군에서는 106.3±6.5초로 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
- Elevated plus-maze를 이용한 항불안 효과를 관찰한 결과는 (Fig. 6) open arm에 머무르는 시간은 실험군이 대조군에 비해 유의하게 감소하였으며, open arm과 closed arm 사이의 이동 횟수에는 별 차이가 없었다 (Fig. 7). 이로 볼 때 半夏厚朴湯은 심리적 스트레스로 발생한 불안을 줄이는 효과가 있는 것으로 추정된다.
- 일반적으로 세포막 지질의 과산호는 세포막의 투과성을 변화시키고 물질 이동계에 관여하는 단백질들의 기능을 저해하기 때문에 세포 기능 손상의 주요한 원인으로 인정되고 있는 지표 중 하나이다42). 半夏厚朴湯을 투여한 결과 Fig. 5에서 보여지는 바와 같이 대조군의 뇌 조직 내 지질의 과산화물이 정산군에 비해 유의하게 증가하였으나 실험군에서는 대조군에 비해 차이가 관찰되지 않았다. 이는 半夏厚朴湯이 심리적 스트레스로 인한 뇌 조직 내 지질 과산화물의 생성 억제에는 관여하지 않음을 나타낸다.
- 뇌 조직 내 noradrenaline 함량을 측정한 결과 (Fig. 4) 정상군에서 209.2±12.6 ㎍/g brain 인데 비해 심리적 스트레스를 받은 대조군에서는 125.7±10.6 ㎍/g brain으로 유의하게 감소하였으며, 실험군에서는 182.5±6.0 ㎍/g brain으로 나타나 대조군에 비해 수치가 유의하게 증가하였다.
- 뇌 조직 내 지질 과산화물 함량을 측정한 결과 (Fig. 5) 정상군에서는 2.25±0.20 nmole MDA/㎎ protein인데 비해, 심리적 스트레스를 받은 대조군에서는3.70±0.21 nmole MDA/㎎ protein으로 정상군에 비해 유의하게 증가되었으며, 실험군에서는 3.20±0.31 nmole MDA/㎎ protein으로 대조군과의 유의성은 나타나지 않았다.
- 신체적 스트레스를 받은 스트레스 대조군에서의 결과는 5.95±0.36 nmole MDA/㎎ protein이었다.
- 3). 위와 같은 혈중 corticosterone 함량 측정을 통해 신체적 스트레스가 심리적 스트레스보다 더 심한 스트레스 반응을 일으키며, 半夏厚朴湯 추출물이 심리적 스트레스의 완화 효과가 있음을 확인하였다.
- 4에 나타난 바와 같이 신체적 스트레스를 받은 대조군의 경우 심리적 스트레스 부하 그룹에 비해 함량이 아주 적은 것을 알 수 있으며, 심리적 스트레스를 받은 대조군이 실험군에서보다 낮게 나타났다. 이는 신체적 스트레스가 정신적 자국에 의한 스트레스보다 훨씬 크게 noradrenaline의 분비에 영향을 미치며 半夏厚朴湯이 심리적 스트레스의 완화 효과가 있음을 실험을 통해 확인할 수 있었다.
- 혈청 중 corticosterone 함량을 측정한 결과 (Fig. 3) 정상군에서의 수치가 168.8±16.3 ng/㎖인데 비해 심리적 스트레스를 받은 대조군에서는 383.0±50.9 ng/㎖으로 유의하게 증가하였으며, 실험군에서는 253.2±15.1 ng/㎖로 나타나 대조군에 비새 다시 유의하게 감소하였다.
- 주로 혈청 중의 corticosterone이 스트레스 자극에 의해 분비가 증가되는 것으로 알려져 있다. 혈청 중의 corticosterone을 측정한 결과 신체적 스트레스를 받은 경우는 심리적 스트레스를 받은 경우보다 약 170% 정도 높은 혈중 수치를 보였으며, 이에 비해 실험군에서는 심리적 스트레스를 받은 대조군에 비해 유의하게 수치가 감소된 것을 알 수 있다 (Fig. 3). 위와 같은 혈중 corticosterone 함량 측정을 통해 신체적 스트레스가 심리적 스트레스보다 더 심한 스트레스 반응을 일으키며, 半夏厚朴湯 추출물이 심리적 스트레스의 완화 효과가 있음을 확인하였다.
후속연구
- 이상의 결과들을 종합하여 보면 심리적 스트레스가 부하된 5일 동안 半夏厚朴湯 추출물을 함께 투여하면 그 결과로 심리적 스트레스를 효과적으로 해소할 수 있다는 것을 알 수 있으며 아울러 스트레스로 인해 발생하는 여러 병리적인 지표들의 증가도 억제시키는 것을 확인할 수 있었는데 앞으로 半夏厚朴湯의 이러한 작용에 어떠한 기전들이 관여하는지 추가적인 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- 이상의 내용으로 미루어 半夏厚朴湯 추출물이 심리적 스트레스의 해소와 이로 인한 각종 질병 발생 억제에 효과가 있음을 알 수 있으므로 스트레스 관련 질환 치료 약물로 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
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