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문제 정의
- 이에 저자는 반하후박탕에 행기관중(行氣寬中)하는 효능을 가진 지각(枳殼)과 선폐거담(宣肺祛痰)하는 효능을 가진 길경(桔梗)21)을 가(加)한 반하후박탕가미(半夏厚朴湯加味)를 이용하여 강제수영 검사(forced swimming test), 신경전달물질 분석, 뇌 내 serotonin 양 측정, 뇌조직손상 분석, 뇌 면역조직화학염색 분석 등을 시행하여 약간의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 21일간 2시간씩 별도로 제작한 conical tube에서 구속시키고, 구속스트레스를 가하기 2시간 전에 증류수 경구투여.
- 강제수영 검사는 윗면이 개방된 원통모양의 아크릴실린 더(지름 20 cm, 높이 40 cm)에 깨끗한 수돗물(수온 25±2℃)을 실린더 바닥에서부터 15 cm까지 부은 후, 우울증 생쥐 모델을 15분 동안 강제로 수영시키고, 물에서 건져 올려 마른 수건으로 닦고 사육상자로 돌려보냈다(pretest session).
- 그리고 실린더 주위를 수평 방향으로 움직이는 행동으로 Immobility behavior 보다도 더 적극적으로 움직이는 행동(swimming behavior)과 벽을 향해 앞발을 물 밖으로 차올리는 다소 격렬하게 움직이는 행동(climbing behavior)으로 구분하였다. 검사 회기(test session)동안 각 행동을 측정하거나 혹은 검사 전 회기(pretest session) 15분 중 마지막 5분과 검사회기 5분의 측정치를 비교하였다.
- 24시간 후에 동물을 동일한 장비에 5분 동안 빠뜨렸다(test session). 검사시행 전체를 캠코더 등의 기록 장치를 이용하여 기록하고, 기록된 영상을 통하여 test session(5분) 동안 다음의 동물의 행동이 나타나는 시간을 측정하였다. 또는 5초에 한 번씩 sampling 하는 방식으로 3종류의 동물 행동의 시간(time)과 빈도(frequency)를 측정하였다.
- 강제수영 검사는 동물이 발버둥치지 않고 물위에 떠 있는 행동으로 수면 밖으로 머리를 내놓는 데 필요한 움직임 이외에 아무 움직임이 없는 상태인 부동성의 증가를 절망행동의 지표로 삼았다(immobility behavior). 그리고 실린더 주위를 수평 방향으로 움직이는 행동으로 Immobility behavior 보다도 더 적극적으로 움직이는 행동(swimming behavior)과 벽을 향해 앞발을 물 밖으로 차올리는 다소 격렬하게 움직이는 행동(climbing behavior)으로 구분하였다. 검사 회기(test session)동안 각 행동을 측정하거나 혹은 검사 전 회기(pretest session) 15분 중 마지막 5분과 검사회기 5분의 측정치를 비교하였다.
- 2 ml로 가압 농축한다. 농축된 메탄올 추출액을 HPLC 분석을 통하여 serotonin, melatonin의 함량을 분석하였다.
- 뇌 메탄올 추출물 분석을 위한 HPLC는 Agilent 1200 series로서 autosampler, column oven, binary pump, DAD detector, degasser를 사용하였으며, software는 Agilent사의 Chemstation software (Agilent Technologies, Avondale, CA, U.S.A.)를 사용하였다. HPLC 조건으로 컬럼 오븐의 온도는 25℃, 분석파장은 220 nm, 유속은 0.
- 다음으로 HPLC를 이용하여 생쥐의 뇌 내 신경전달 물질 분석을 시행하였다. 그 결과, serotonin과 melatonin이 감소한 대조군에 비해, 양성대조군인 Fluoxetine 투여군은 melatonin이 증가를 나타내었고, 반하후박탕가미 투여군은 180 mg/kg, 540 mg/kg 모두에서 serotonin이 증가하였다 (Fig.
- 다음으로 면역조직화학 염색을 이용하여 생쥐 시상하부실방핵(paraventricular nucleus, PVN)에서 CRF 수용체의 양을 측정하였다.
- 대조군과 동일하게 구속스트레스를 가하고, 구속 2시간 전에 반하후박탕가미를 180 mg/kg 경구 투여.
- 대조군과 동일하게 구속스트레스를 가하고, 구속 2시간 전에 반하후박탕가미를 540 mg/kg 경구 투여.
- 동결뇌조직을 Cryostate (Reichert-Jung Co. 2800)를 이용하여 절편을 제조하여 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하고 광학현미경상에서 관찰하였다.
- 검사시행 전체를 캠코더 등의 기록 장치를 이용하여 기록하고, 기록된 영상을 통하여 test session(5분) 동안 다음의 동물의 행동이 나타나는 시간을 측정하였다. 또는 5초에 한 번씩 sampling 하는 방식으로 3종류의 동물 행동의 시간(time)과 빈도(frequency)를 측정하였다. 강제수영 검사는 동물이 발버둥치지 않고 물위에 떠 있는 행동으로 수면 밖으로 머리를 내놓는 데 필요한 움직임 이외에 아무 움직임이 없는 상태인 부동성의 증가를 절망행동의 지표로 삼았다(immobility behavior).
- 반하후박탕가미 86 g에 증류수 2,000 ml을 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류 장치에서 감압 증류장치로 농축하여, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조한 반하후박탕가미 9 g을 냉동 보관(−84℃)하면서 생쥐 (25 g)에 180 mg/kg과 540 mg/kg 경구투여시 각각 증류수에 22.5 mg/ml과 67.5 mg/ml로 검액을 조제하여 0.2 ml씩 경구투여하였다.
- 반하후박탕가미의 항우울 효과를 알아보기 위하여 강제 수영 검사, 신경전달물질 분석, 뇌 내 serotonin 양 측정, 뇌조직손상 분석, 뇌 면역조직화학염색 분석 등을 시행한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 수컷 C57bl/6 생쥐를 윗면, 옆면, 마개에 여러개의 구멍이 나있는 50 ml conical tube (FALCON, BD)를 제작하여 구속 스트레스 우울증 생쥐모델 제작에 사용하였고, 하루 2시간씩 21일 동안 장기 구속 스트레스(chronic immobilization stress)에 노출된 마우스의 우울증 모델을 만들었다.
- 6 mm, particle size 5μm)를 사용하였다. 이동상은 A 용매로 100% 3차 증류수(0.1% TFA 함유)와 B 용매 100% 아세토니트릴로 각각 0.1% 포름산을 첨가하여 사용하였으며 용매계는 다음과 같다(Table 2). 표준성분 시료는 Serotonin과 Melatonin을 사용하였고, 뇌 메탄올 추출물에서 성분분석을 하였다.
- 이를 30% sucrose에 조직이 포화될 때 까지 4℃ 보관 뒤 OCT compound로 조직을 붙여 CO2 gas로 급속 동결하여 Cryostate로 30μm 두께로 free floating brain sections 하였다.
- 이에 저자는 반하후박탕에 행기관중하는 지각과 선폐거담하는 길경21)을 가한 반하후박탕가미가 항우울 효과가 있을 것이라는 판단 하에 구속 스트레스로 유발된 우울증 생쥐 모델의 행동학적, 생화학적 실험을 실시하였다.
- , diluted 1:10,000), anti-CRF-R1 (sc-1757, SANTA CRUZ, diluted 1:1,000)를 사용하였다. 일차항체는 4℃에서 48시간 Obital-shaker에서 반응시킨 후 PBS와 1% triton X-100을 함유한 PBS로 15분 씩 번갈아 세 차례 씻어낸 후 이차항체를 처리하였다. 이차항체는 Fluorescein goat anti-rabbit IgG (F-2765, Molecular probe, diluted 1:200)로 4℃에서 2시간 동안 Obital-shaker에서 반응시킨 후 PBS와 1% triton X-100을 함유한 PBS로 15분 씩 번갈아 네 차례 씻어낸 후 슬라이드에 조직을 6장씩 붙였다.
- 적출한 생쥐의 뇌를 4% paraformaldehyde 용액에서 12시간 고정후 15% sucrose 용액에서 침강시까지 담근 후 급속냉동에 의하여 조직을 동결하였다. 동결뇌조직을 Cryostate (Reichert-Jung Co.
- 이를 30% sucrose에 조직이 포화될 때 까지 4℃ 보관 뒤 OCT compound로 조직을 붙여 CO2 gas로 급속 동결하여 Cryostate로 30μm 두께로 free floating brain sections 하였다. 준비한 조직은 항체에 따라 서로 다른 10% Serum (S-5000, VECTOR)으로 1시간 동안 실온에서 전처리 한 후 일차항체를 처리하였다. 일차항체는 사용 부위에 따라 Rabbit anti-CRF (T-4037, Peninsula Lab.
- 1% 포름산을 첨가하여 사용하였으며 용매계는 다음과 같다(Table 2). 표준성분 시료는 Serotonin과 Melatonin을 사용하였고, 뇌 메탄올 추출물에서 성분분석을 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 분석용 시약은 formaldehyde, dopamine, serotonin, melatonin, epinephrine, norepinephrine, fluoxetine, dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), sucrose, spermine, spermidine, HEPES, MgCl2, KCl, DTT, PMSF, protease inhibitor, phosphatase inhibitor, NP-40는 Sigma사(U.S.A.) 제품을 사용하였으며, HPLC grade:MeOH, HPLC grade:CHCl3, HPLC grade:Water, HPLC grade:CH3CN등은 Merck사(Germany)제품을 사용하였고, Serotonin ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) kit는 Enzo life Sciences사(U.S.A.) 제품을, Fluorescein goat anti-rabbit IgG-conjugated secondary Ab(1:4000, Amersham, U.S.A.)와 ECL-Hybond film (Amersham, U.S.A.), Rabbit anti-mouse CRF, anti-mouse CRF-1 mAb는 Santa-Cruz사(California, U.S.A.) 제품을, LSAB kit는 DAKO 사(Glostrup, Denmark) 제품을 사용하였으며, 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 반하후박탕가미(BanHaHuBak-Tangkami, BHHBT)는 ≪의종금감(醫宗金鑑)≫22) 의 반하후박탕에 길경, 지각을 4.0 g 가미한 것으로, 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였다. 처방 1첩의 내용과 용량은 다음과 같다(Table 1).
- 수컷 6주령의 20~22 g C57bl/6 생쥐(대한바이오링크, 대한민국)를 공급받아 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃,습도 55±15%, 12시간의 light-dark cycle 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였고, 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대전대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인(승인번호 DJUARB2012-016)을 받았다.
- 실험군은 C57bl/6 생쥐 10마리를 한 그룹으로 하여 5군으로 다음과 같이 나누었다.
- 준비한 조직은 항체에 따라 서로 다른 10% Serum (S-5000, VECTOR)으로 1시간 동안 실온에서 전처리 한 후 일차항체를 처리하였다. 일차항체는 사용 부위에 따라 Rabbit anti-CRF (T-4037, Peninsula Lab., diluted 1:10,000), anti-CRF-R1 (sc-1757, SANTA CRUZ, diluted 1:1,000)를 사용하였다. 일차항체는 4℃에서 48시간 Obital-shaker에서 반응시킨 후 PBS와 1% triton X-100을 함유한 PBS로 15분 씩 번갈아 세 차례 씻어낸 후 이차항체를 처리하였다.
데이터처리
- 모든 측정치는 평균±표준편차를 구하였고, 계측치들은 실험의 성격을 감안하여 비모수 검증을 사용하였는데, 전체 군간 비교를 위하여 Kruskal-Wallis 검증을, 대조군과 실험군 간의 양군 비교를 위하여 Mann-Whitney 검증을 사용하였다.
- Mounting은 형광 전용액(H-1000, VECTOR)을 사용하였다. 형광현미경은 AXIO scope(CARL ZEIZZ)를 사용하였으며, program은 Meta Morph (ver. 6.1r6)로 분석하였다.
성능/효과
- 1. 구속 스트레스에 의한 부동시간이 증가된 생쥐의 부동 시간을 반하후박탕가미가 감소시켰다
- 2. 반하후박탕가미는 HPLC를 통한 신경전달물질 분석상 serotonin 양을 증가 시켰다.
- 3. 반하후박탕가미는 뇌내 serotonin 발현량을 유의하게 증가 시켰다.
- 4. 반하후박탕가미 540 mg/kg는 해마부위의 손상을 방지하였다.
- 5. 반하후박탕가미는 해마부위의 CRF 수용체 발현량을 감소시켰다.
- 강제수영 검사 결과, Fluoxetine 투여군은 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않았고, 반하후박탕가미 투여군(180 mg/kg, 540 mg/kg)은 대조군과 비교하여 부동시간이 유의성 있게 감소하였다(Fig. 1).
- 다음으로 HPLC를 이용하여 생쥐의 뇌 내 신경전달 물질 분석을 시행하였다. 그 결과, serotonin과 melatonin이 감소한 대조군에 비해, 양성대조군인 Fluoxetine 투여군은 melatonin이 증가를 나타내었고, 반하후박탕가미 투여군은 180 mg/kg, 540 mg/kg 모두에서 serotonin이 증가하였다 (Fig. 2).
- 뇌 균질액에서 serotonin양을 측정한 결과, 대조군에 비해 Fluoxetine 투여군과 반하후박탕가미를 540 mg/kg 투여한 실험군은 대조군에서 serotonin 생성량이 유의성 있는 증가를 보였다. 반하후박탕가미 180 mg/kg 투여군 역시 serotonin 생성량이 증가 하였으나 통계학적으로 유의하지 않았다(Fig.
- 뇌 메탄올 추출액에서 정상 C57bl/6 생쥐(Fig. 2B)에서의 serotonin과 melatonin이 우울증 생쥐 대조군에서 감소 하였고(Fig. 2C), Fluoxetine 투여군은 대조군에 비하여 melatonin이 증가하였고(Fig. 2D), 반하후박탕가미 180 mg/kg, 540 mg/kg 투여군에서 대조군에 비하여 serotonin이 증가하였다(Fig. 2E, F).
- 뇌조직을 관찰한 결과, 대조군에서 해마부위의 조직손상이 관찰 되었고, 양성대조군인 Fluoxetine 투여군과 반하후박탕가미 540 mg/kg 투여군에서 pyramidal cell layer (CA1, CA3), neurons, dentate gyrus등이 회복된 것을 볼수 있었다(Fig. 4).
- 대조군에서는 만성 구속 스트레스로 인해 해마부위의 조직손상으로 stratum radiatum, oligodendrocytes-like cells, astrocytes-like cell, pyramidal cell layer (CA1, CA3), neurons 그리고 dentate gyrus (DG) 등이 정상군에 비하여 사라졌으나, Fluoxetine 투여군과 반하후박탕가미 540 mg/kg 투여군은 CA1, CA3, neurons 그리고 DG 등이 유지되고 있음을 볼 수 있었다(Fig. 4).
- 반하후박탕가미의 장기투여가 만성구속 스트레스 생쥐 모델에서의 뇌 균질액에서 serotonin 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군 66.9±9.17 ng/ml, 대조군 38.8±9.17 ng/ml, Fluoxetine 투여군 81.4±7.40 ng/ml, 반하후박탕 가미 180 mg/kg 투여군 53.4±2.52 ng/ml, 반하후박탕가미 540 mg/kg 투여군 98.2±7.69 ng/ml로 측정되었다.
- 반하후박탕가미의 투여가 만성구속 스트레스 생쥐 모델에서의 강제수영 검사에서 부동시간에 미치는 영향을 관찰한 결과 정상군 122.0±17.1 sec, 대조군 176.5±19.6 sec, fluoxetine 투여군 165.8±22.7 sec, 반하후박탕가미 180 mg/kg 투여군 126.8±6.3 sec, 반하후박탕가미 540 mg/kg 투여군 116.5±19.6 sec로 측정되었다.
- 본 실험에서 Fluoxetine 투여군과 반하후박탕가미 투여군(180 mg/kg, 540 mg/kg)은 대조군에 비하여 CRF 수용체의 발현량이 감소되었다(Fig. 5).
- 이상의 내용을 종합하여 보면 반하후박탕가미는 강제수영 검사에서 부동성을 감소시키고, HPLC를 이용한 신경전달물질 분석과 뇌 균질액 serotonin측정 결과 뇌 내 serotonin생성량을 증가시켰으며, 540 mg/kg 투여군의 경우 해마부위의 뇌 조직손상을 방지하였고, 시상하부 실방핵의 CRF 수용체 발현량을 감소시켰다. 따라서 반하후박탕가미는 항우울제로서의 가능성이 있다고 사료된다.
- 6 sec로 측정되었다. 정상군과 비교하여 대조군에서 강제수영 검사 상 부동시간이 증가하였고, 반하 후박탕가미 180 mg/kg 투여군(p＜0.001)과 540 mg/kg 투여군(p＜0.01)은 대조군에 비하여 부동시간이 유의성 있게 감소하였다(Fig. 1).
- 해마부위(hipocampus area)에서 corticotropin releasing factor (CRF) 수용체의 발현량을 면역조직화학염색으로 관찰한 결과, Fluoxetine 투여군과 반하후박탕가미 180 mg/kg, 540 mg/kg 투여군은 대조군에 비하여 CRF 수용체의 발현량이 감소되었다(Fig. 5).
후속연구
- 따라서 반하후박탕가미는 항우울제로서의 가능성이 있다고 사료된다. 향후 반하후박탕가미의 항우울효과에 대한 기전 연구, 임상 연구 등의 추가적인 연구가 필요하리라 사료되며, 이를 통해 새로운 항우울 한약제제의 개발을 기대하는 바이다.
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