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문제 정의
- 그람음성세균의 내독소(endotoxin)로 알려진 LPS를 대식세포에 처리하게 되면 NO, PGs, 염증성 사이토카인과 같은 물질들이 생성되어 염증반응을 조절하는 다양한 병리학적 반응이 유도된다(28). 따라서 본 연구에서는 생약 향기추출물의 항염증작용을 검토하고자, Raw 264.7 세포에 염증 유발물질인 LPS(100 ng/mL)와 함께 다양한 농도의 생약 향기추출물을 동시에 처리한 후 NO 및 PGE2의 생성 억제효과를 관찰하였다. Fig.
- 본 연구는 생약의 휘발성 향기추출액을 이용한 염증치료용 기능성 신소재를 개발하기 위해 대식세포주인 Raw 264.7세포를 이용한 모델시스템에서 천궁 및 당귀의 휘발성 향기 추출물의 항염증 효과를 검정하였으며, 아울러 이들 향기추출물의 향기성분을 GC-MS 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 8가지 생약(노간주, 목향, 천궁, 당귀, 정향, 고본, 박하, 애엽)의 향기추출물 중 천궁 및 당귀가 LPS 처리에 의한 NO의 생성을 가장 크게 억제하였으며 PGE2의 생성도 현저히 억제시키는 것으로 나타났다.
제안 방법
- 24시간 배양한 후 배양액에 함유된 IL-6 및 TNF-α를 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
- 8가지 생약의 휘발성 향기추출물의 세포증식 능력을 측정하기 위해 Raw 264.7 세포를 96 well plate에 well당 1×104세포가 되도록 분주한 후 18시간 배양하였다.
- GC-MS 기기는 HP 5973 Mass selective detector(Agilent technologies Inc., Chandler, AZ, USA)가 장착된 Agilent 5975C Series gas chromatography(Agilent technologies Inc.)를 사용하였으며, 분리용 칼럼은 HP-5MS 5% phenyl methyl silox nonpolar(30 m×0.25 mm, i.d., 0.25 μm film thickness, J & W, Folsom, CA, USA)를 사용하였고, 이때 oven의 온도는 50℃에서 3분간 유지한 다음 5℃/min의 속도로 300℃까지 상승시켰으며, carrier gas의 유속은 1 mL/min(He)로 유지하였다.
- GC-MS에 의해 total ionization chromatogram(TIC)에 분리된 각 peak의 휘발성향기성분 분석은 mass spectrum library(Wiley 275 & 7N, NBS 75K)(23)와 mass spectral data book의 spectrum과 비교하여 확인하였다.
- 분리된 화합물의 이온화는 electron impact ionization(EI mode) 방법으로 행하였으며 ionization voltage와 ion source의 온도는 각각 70 eV와 230℃로 설정하였고, 분석할 분자량의 범위는 40∼400(m/z)으로 설정하였으며, GC injector의 온도는 250℃로 설정하였다. SDE추출법으로 추출된 향기추출물을 split ratio 1:20으로 주입하여 분석하였다.
- iNOS와 COX-2 발현 양은 horseradish peroxidase(HRP)가 붙어있는 2차 항체로 실온에서 2시간 반응 후 chemiluminescence reagents(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 가시화하였다. 각 단백질 밴드의 강도는 GelDoc-It TS imaging system(Ultra-Violet Products Ltd, Cambridge, UK)을 사용하여 수치화하였다.
- 따라서 8가지 생약 중 세포독성이 있는 목향 및 고본과 100μg/mL의 농도에서 NO 생성 저해효과가 낮은 정향(데이터 생략)을 제외한 5가지 생약 즉 노간주, 천궁, 당귀, 박하 및 애엽의 향기추출물을 0∼50 μg/mL 농도로 조정하여 실험을 진행하였다.
- 먼저 8가지 생약(노간주, 목향, 천궁, 당귀, 정향, 고본, 박하, 애엽)의 향기추출물의 처리에 의한 Raw 264.7 대식세포에의 증식에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 생약 향기추출물을 0, 10, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 배양 후 Raw 264.7 세포의 증식을 측정하였다.
- 천궁 및 당귀를 포함한 8가지 생약의 휘발성 향기추출물은 SDE법에 의해 다음과 같이 제조하였다. 먼저, Schultz 등(22)의 방법에 따라 분쇄한 생약 50 g에 초순수 1 L를 혼합하고 SDE 장치에서 재증류한 diethyl ether 500 mL를 사용하여 상압 하에서 4시간 동안 추출한 후 무수황산나트륨을가하여 -4℃에서 하룻밤 방치시켜 탈수시키고 유기용매층은 rotary vacuum evaporator(Eyela, Tokyo, Japan) 및 질소 purger를 이용하여 농축 후 향기추출물을 제조하였다.
- 7 세포를 48 well plate에 2×105 cells/well이 되도록 분주하고 18시간 배양한 후, 천궁 및 당귀 휘발성 향기추출물 1∼50 μg/mL의 농도가 되도록 전처리하고 1시간 후에 LPS 100 ng/mL 처리하여 20시간 배양하였다. 배양액 중에 함유된 NO의 양을 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였고, PGE2는 PGE2 ELISA kit을 사용하여 측정하였다.
- 본 연구에서는 생약의 휘발성 향기추출물의 항염증활성을 검증하기 위해 먼저 천궁 및 당귀를 포함한 8가지 생약을 수증기증류추출법(steamed distillation extraction, SDE)을 이용하여 휘발성 향기성분을 추출한 후 마우스의 대식세포 주인 Raw 264.7 세포를 이용한 모델시스템에서 생약 향기추출물의 항염증 효과를 측정하였으며, 아울러 항염증 활성이 높은 천궁 및 당귀 향기추출물의 휘발성 향기성분을 GC-MS 분석을 통해 확인하였다.
- 분리된 화합물의 이온화는 electron impact ionization(EI mode) 방법으로 행하였으며 ionization voltage와 ion source의 온도는 각각 70 eV와 230℃로 설정하였고, 분석할 분자량의 범위는 40∼400(m/z)으로 설정하였으며, GC injector의 온도는 250℃로 설정하였다.
- 이때 향기추출물은 10∼200 μg/mL의 농도가 되도록 150 μL/well을 세포에 처리하여 24시간 배양한 후, CellTiter 96 AQueous One solution assay를 이용하여 20 μL/well의 one solution을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포증식에 미치는 효과를 측정하였다(24).
- 천궁 및 당귀 향기추출물 1, 10, 25, 50 μg/mL와 LPS(100 ng/mL)를 동시처리 또는 LPS 단독처리 하여 20시간 배양한 후 세포를 수집하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음, 용해 완충액(lysis buffer)을 첨가하여 세포를 용해시킨 후 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하고 세포 내 단백질을 얻었다.
- 천궁 및 당귀 향기추출물의 휘발성 향기성분의 분석은 GC-MS를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. GC-MS 기기는 HP 5973 Mass selective detector(Agilent technologies Inc.
- 한편, 염증반응의 또 다른 체내 매개물질 중 하나인 PGE2생성에 미치는 천궁 및 당귀 향기추출물의 억제 효과를 측정하였다. Fig.
- BCA assay reagent(Pierce, Rockford, IL, USA)로 단백질을 정량한 후 20∼50 μg의 lysate를 8% sodium dodecylsulfate(SDS)가 포함되어 있는 polyacrylamide gel에서 전기영동 후, nitrocellulose transfer membrane으로 옮겼다. 항체의 비특이적 결합을 억제시키기 위해 membrane을 5% 탈지 분유액이 포함된 TBST(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)로 1시간 실온에서 배양한 후 iNOS 와 COX-2의 항체를 이용하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. iNOS와 COX-2 발현 양은 horseradish peroxidase(HRP)가 붙어있는 2차 항체로 실온에서 2시간 반응 후 chemiluminescence reagents(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 가시화하였다.
대상 데이터
- CellTiter 96 AQueous One Solution과 Griess reagent system은 Promega(Madison, WI, USA), PGE2 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit은 ParameterTM R&D사(Minneapolis, MI, USA), Tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 Interleukin-6(IL-6) ELISA kit는 eBioscience사(San Diego, CA, USA)로부터 각각 구입하여 사용하였다.
- Inducible NOS(iNOS)와 COX-2 항체는 Cell signaling사(Danvers, MA, USA)에서, β-actin 항체는 Sigma사로부터 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 8가지 생약[정향(Eugenia caryophyllata), 고본(Angelica tenuissima), 노간주(J uniperus ridiga), 박하(Mentha arvense), 당귀(Angelica gigeas), 목향(Saussurea lappa), 애엽(Artemisiae argyi) 및 천궁(Cnidium officinale)] 중 정향(인도네시아산)을 제외하고는 전부 국산으로 영천 약전시장에서 구입한 것을 사용하였으며, 건조된 상태로 저온(-5℃)에서 보관하면서 실험재료로 사용하였다. 실험에 사용한 시약인 lipopolysaccharide(LPS), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma사(St.
- 실험에 사용된 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포는 한국 세포주은행에서 분양 받아 사용하였으며, 10% FBS와 1% antibiotics(penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 시약인 lipopolysaccharide(LPS), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터, Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), penicillin 및 streptomycin은 Hyclone 사(Logan, UT, USA)로부터 구입하였다.
데이터처리
- Bars with different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan multiple range test.
- 본 연구의 실험 결과들은 3회 반복 측정하여 평균값±표준편차로 나타내었으며, 모든 자료의 통계분석은 SAS(Statistical Analysis System) software package(SAS 9.1.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 실시하였다.
- 이때 분산분석은 ANOVA test를, 각 시험구간의 평균차이에 대한 유의성 검정은 Duncan multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준일 때 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- Cells were treated with 0∼200 μg/mL of the volatile extracts from eight different crude drugs for 24 hr. Cell viability was determined using the CellTiter 96 AQueous One Solution Assay. The results are expressed as mean±SD from three independent experiments.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Green 등(25)의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.
- 앞서 관찰된 천궁 및 당귀 향기추출물의 NO와 PGE2의 생성억제 효과가 이들을 생성하는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현억제에 기인되는지의 여부를 이들 단백질에 대한 western blot 방법으로 조사하였다. Raw 264.
- 천궁 및 당귀를 포함한 8가지 생약의 휘발성 향기추출물은 SDE법에 의해 다음과 같이 제조하였다. 먼저, Schultz 등(22)의 방법에 따라 분쇄한 생약 50 g에 초순수 1 L를 혼합하고 SDE 장치에서 재증류한 diethyl ether 500 mL를 사용하여 상압 하에서 4시간 동안 추출한 후 무수황산나트륨을가하여 -4℃에서 하룻밤 방치시켜 탈수시키고 유기용매층은 rotary vacuum evaporator(Eyela, Tokyo, Japan) 및 질소 purger를 이용하여 농축 후 향기추출물을 제조하였다.
성능/효과
- COX-2단백질 발현 양의 변화를 관찰한 결과, 천궁 및 당귀 향기추출물의 첨가가 LPS 처리에 의해 유도된 COX-2 단백질 발현을 50 μg/mL의 농도에서만 저하시키는 것을 관찰하였다(Fig. 4).
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 Raw 264.7 세포에 LPS를 처리하여 증가된 NO의 생성은 5가지 생약 향기추출물 10 μg/mL 및 50 μg/mL 농도를 첨가함으로써 LPS 단독처리 군에 비해 유의적으로 억제되었다.
- 생성에 미치는 천궁 및 당귀 향기추출물의 억제 효과를 측정하였다. Fig. 3B에서 보는 바와 같이, LPS를 처리하여 증가된 PGE2의 생성은 천궁 및 당귀 향기추출물을 농도별로 첨가함으로써 모든 처리 농도에서 LPS 단독처리 군에 비해 유의적으로 억제하였으며, 농도의존적으로 PGE2의 생성이 억제되었다. 이와 같은 결과는 염증반응 시 천궁 및 당귀 향기추출물(1∼50 μg/mL)의 처리가 주요 염증성 매개물질인 NO 및 PGE2의 생성을 억제함으로써 항염증 활성이 나타남을 알 수 있었다.
- 의 생성억제 효과가 이들을 생성하는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현억제에 기인되는지의 여부를 이들 단백질에 대한 western blot 방법으로 조사하였다. Raw 264.7 세포에 LPS 단독처리 또는 LPS와 천궁 및 당귀 향기추출물을 동시에 처리한 후 iNOS와 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, Raw 264.7 세포에 LPS를 처리함으로써 iNOS 와 COX-2 단백질의 발현이 급격히 증가되었다. 그러나 천궁 및 당귀 향기추출물을 처리함으로써 iNOS 단백질 발현을 농도의존적으로 감소시킴을 관찰하였다(Fig.
- 7세포를 이용한 모델시스템에서 천궁 및 당귀의 휘발성 향기 추출물의 항염증 효과를 검정하였으며, 아울러 이들 향기추출물의 향기성분을 GC-MS 분석을 통해 확인하였다. 그 결과 8가지 생약(노간주, 목향, 천궁, 당귀, 정향, 고본, 박하, 애엽)의 향기추출물 중 천궁 및 당귀가 LPS 처리에 의한 NO의 생성을 가장 크게 억제하였으며 PGE2의 생성도 현저히 억제시키는 것으로 나타났다. 또한, 천궁 및 당귀의 향기 추출물은 NO의 생합성 효소인 iNOS 단백질의 발현 또한 농도의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었으며, 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성 억제효과도 우수하였다.
- 7 세포의 증식을 측정하였다. 그 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이, 8가지 생약의 향기추출물 중 노간주, 당귀, 박하 및 애엽은 본 실험에 사용한 어떤 농도에서도 세포독성을 나타내지 않았다. 반면, 천궁 및 정향은 200 μg/mL 이상의 농도에서 세포독성을 나타내었고, 특히 목향 및 고본은 각각 50 μg/mL 및 100μg/mL 이상의 낮은 농도에서도 세포독성을 나타내었다.
- 이전의 in vitro 결과에서는 당귀가 COX-2 및 15-LO(15-lipoxygenase) 저해활성이 상당히 큰 것으로 보고한 바 있다(29). 따라서 5가지 생약 중 항염증 활성이 클 것으로 사료되는 천궁 및 당귀 향기추출물을 농도별로 처리한 결과, 모두 농도의존적으로 NO의 생성을 억제하였다(Fig. 3A)
- 그 결과 8가지 생약(노간주, 목향, 천궁, 당귀, 정향, 고본, 박하, 애엽)의 향기추출물 중 천궁 및 당귀가 LPS 처리에 의한 NO의 생성을 가장 크게 억제하였으며 PGE2의 생성도 현저히 억제시키는 것으로 나타났다. 또한, 천궁 및 당귀의 향기 추출물은 NO의 생합성 효소인 iNOS 단백질의 발현 또한 농도의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었으며, 염증성 사이토카인인 IL-6의 생성 억제효과도 우수하였다. 천궁 및 당귀 향기추출물의 휘발성 향기성분을 GC-MS로 분석한 결과, 천궁은 eugenol, 3-butylphthalide, butylidene phthalide 및 ligustilide를 확인하였으며 이들 향기성분 중 ligustilide가 천궁의 주된 휘발성 향기성분임을 확인하였고, 당귀는 eugenol, β-maaliene, β-eudesmol 및 9-tetradecenoic acid를 확인하였으며 이들 향기성분 중 β-eudesmol이 당귀의 주된 향기성분임을 확인하였다.
- 7과 같다. 먼저 Fig. 6에서 보는 바와 같이 천궁의 경우의 주요 향기성분은 eugenol(peak 1, M.W.=164.20), 3-butylphthalide(peak 2, M.W.=190.24), butylidene phthalide(peak 3, M.W.=188.23) 및 ligustilide(peak 4, M.W.=190.24)를 각각 확인하였으며, 이들 향기성분 중 ligustilide이 천궁의 주된 휘발성 향기성분임을 확인하였다. 이러한 결과는 butylidene phthalide, butyl phthalide, senkyunolide 및 ligustilide 등이 천궁의 주된 향기성분임을 보고한 Kim 등(11)과 Lee 등(12)의 연구결과와 유사하였다.
- 먼저 정향 향기추출물의 수율이 16,340.4 mg%로 8가지 생약 중 가장 높게 나타났으며, 그 다음으로 목향(428.3 mg%)>고본(419.8 mg%)>천궁(352.4 mg%)>박하(227.5 mg%)>당귀(196.4 mg%)>노간주(105.6 mg%) 순으로 낮은 수율을 나타내었고, 애엽의 경우 56.3 mg%으로 가장 낮은 수율을 나타내었다.
- 천궁 및 당귀 향기추출물의 휘발성 향기성분을 GC-MS로 분석한 결과, 천궁은 eugenol, 3-butylphthalide, butylidene phthalide 및 ligustilide를 확인하였으며 이들 향기성분 중 ligustilide가 천궁의 주된 휘발성 향기성분임을 확인하였고, 당귀는 eugenol, β-maaliene, β-eudesmol 및 9-tetradecenoic acid를 확인하였으며 이들 향기성분 중 β-eudesmol이 당귀의 주된 향기성분임을 확인하였다. 이러한 연구결과로 미루어볼 때 천궁 및 당귀의 휘발성 향기추출물이 대식세포에 의해 생성되는 염증반응의 매개물질인 NO, PGE2, IL-6의 생성을 저해함으로써 항염증 활성을 가지는 것으로 생각되며, 이러한 항염증 활성은 천궁 및 당귀에 함유된 항염증성 향기성분인 ligustilide 및 β-eudesmol이 크게 기여했을 것으로 사료된다. 따라서 천궁 및 당귀의 휘발성 향기추출물은 천연 유래의 항염증 물질로서 잠재적인 가치가 있어 향후 염증질환 예방 및 치료용 기능성식품 및 화장품 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 4). 이상의 결과들을 종합해 보면, 염증반응 시 천궁및 당귀 향기추출물의 처리가 iNOS와 COX-2 단백질 발현을 감소시켜 NO 및 PGE2 생성을 억제함으로써 항염증 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 이와 같은 결과는 염증반응 시 천궁 및 당귀 향기추출물(1∼50 μg/mL)의 처리가 주요 염증성 매개물질인 NO 및 PGE2의 생성을 억제함으로써 항염증 활성이 나타남을 알 수 있었다.
- 천궁 및 당귀 향기추출물의 휘발성 향기성분을 GC-MS로 분석한 결과, 천궁은 eugenol, 3-butylphthalide, butylidene phthalide 및 ligustilide를 확인하였으며 이들 향기성분 중 ligustilide가 천궁의 주된 휘발성 향기성분임을 확인하였고, 당귀는 eugenol, β-maaliene, β-eudesmol 및 9-tetradecenoic acid를 확인하였으며 이들 향기성분 중 β-eudesmol이 당귀의 주된 향기성분임을 확인하였다.
- 천궁 및 당귀 향기추출물이 염증반응 시 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, IL-6의 경우 LPS 단독처리에 의해 크게 증가하였으나 10∼50 μg/mL 농도의 천궁 및 당귀 향기추출물 처리에 의해 그 생성이 유의적으로 감소하였으며 천궁이 당귀보다 감소 효과가 더 크게 나타났다(Fig. 5A).
후속연구
- 이러한 연구결과로 미루어볼 때 천궁 및 당귀의 휘발성 향기추출물이 대식세포에 의해 생성되는 염증반응의 매개물질인 NO, PGE2, IL-6의 생성을 저해함으로써 항염증 활성을 가지는 것으로 생각되며, 이러한 항염증 활성은 천궁 및 당귀에 함유된 항염증성 향기성분인 ligustilide 및 β-eudesmol이 크게 기여했을 것으로 사료된다. 따라서 천궁 및 당귀의 휘발성 향기추출물은 천연 유래의 항염증 물질로서 잠재적인 가치가 있어 향후 염증질환 예방 및 치료용 기능성식품 및 화장품 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 최근 본 연구진들은 천궁 및 당귀를 주 베이스로 제조한 한방복합처방제의 항염증 효능을 검증한 결과 천궁 및 당귀를 함유한 한방처방제의 휘발성 향기추출물이 우수한 항염증 활성을 나타내었다(21). 따라서 천궁 및 당귀의 휘발성 향기추출물의 항염증 효능을 보다 상세히 조사할 필요가 있었으며, 아울러 그들의 주된 휘발성 향기성분의 분석이 요구되었다.
- 이상의 결과로부터 천궁 및 당귀 향기추출물은 세포독성 없이 낮은 농도에서 다양한 염증반응물질의 생성 억제효과가 우수하였기에 향후 염증 치료용 기능성소재로서 개발할 가치가 있을 것으로 사료된다.
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