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문제 정의
- 이에 본 연구는 CT의 혈관형성저해기전을 HIF-1α와 STAT3 신호와 연계하여 연구하였던 바 유의한 결과가 있어 보고하는 바이다.
제안 방법
- . Fig. 3에서의 결과를 토대로 CT의 처리로 인한 pSTAT3의 감소가 세포의 핵내의 축적에도 영향을 주는지를 알아보기 위해 세포를 세포질과 핵으로 분리하여 확인하였다. 그 결과, Hypoxia에 의해 HIF-1α와 pSTAT3의 핵내로 축적의 증가가 CT처리에 의해 감소됨을 확인하였다(Fig.
- Fig. 3에서의 결과를 토대로 CT의 처리로 인해 pAKT의 감소가 HIF-1α의 억제와 관련이 있는지를 알아보기 위해, siRNA transfection을 통해 연관성을 검증 하였다.
- 그러므로, CT의 처리에 의해 HIF-1α가 억제 되어 질 수 있는지를 알아보기 위해 저산소 환경에서 CT를 시간별 처리하였다.
- Louis, MO) 4℃에서 하루동안 반응 시킨다. 그후, 2차 항체로 반응한 후 ECL (enchanced chemiluminescence: GE Health care bio-sciences. NJ)를 이용하여 단백질 발현정도를 확인한다.
- 세포를 100 mm 배양접시에 1.5×106 cells/dish가 되게 배양한 후, CT를 정상배양조건과 저산소환경조건에서 4시간동안 배양한 후 1% formaldehyde 과 0.125 M glycine을 처리한 후, Soluble chromatins은 EZ-Zyme chromatin prep kit (Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 분리하고 normal rabbit IgG (EMD biosciences, Gibbstown, NJ), HIF-1α or STAT3의 항체를 이용하여 특정 단백질을 침전시키는 immunoprecipition을 진행한다.
- 암세포주에 저산소환경을 유도하기위해 Hypoxia chamber (Thermo scientific, Rockford, IL)를 이용하여 94% N2, 5% CO2, and 1% O2의 혼합 가스를 공급하여 저산소환경을 만들었다.
- 에 signaling pathway와 관련성이 깊은 것으로 알려져 있다. 우리는 CT의 처리로 인한 HIF1-alpha의 감소가 어떠한 signal과 연관성을 알아보기 위해, Hypoxia와 CT를 24시간동안 처리 후 연관성 있는 signal의 대표적 factor들의 발현량을 western blotting을 통해 확인하였다. 확인 결과, Fig.
대상 데이터
- CT는 단삼으로부터 분리된 것으로 한국화학연구원 유시용 박사님께 받아 실험 하였으며, 구조는 Fig. 1에 나타내었다.
- In vitro 실험에 사용된 세포주는 안드로젠 비의존형 전립선암 세포주인 PC-3 (human prostate cancer cell line)을 사용하였다. PC-3세포주는 RPMI 1640 (Welgene, Korea) 배지에 10% FBS, 1% antibiotic solution (100×, penicillin 10,000 units/ml, streptomycin 10 mg/ml, amphotericin B in 0.
- PC-3세포주는 RPMI 1640 (Welgene, Korea) 배지에 10% FBS, 1% antibiotic solution (100×, penicillin 10,000 units/ml, streptomycin 10 mg/ml, amphotericin B in 0.85% NaCl, Wellgene, Korea)을 첨가하여 T75 plate에서 37℃, 5% CO2 상태에서 배양하였으며, 70∼80% confluence 상태가 되었을 때 실험에 사용하였다.
- 0), protease inhibitor cocktail 타블렛 (Roche Applied Science, Inndianapolis, IN))를 사용하여 단백질을 분리하였다. 핵과 세포질의 단백질은 NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo scientific, Rockford, IL)을 사용하여 분리하였다. 분리된 단백질 시료들은 10% SDS-PAGE gel로 전기영동하여 분리한 후 nitrocellulose membrane으로 이동시킨후 그 membrane을 5% 탈지분유로 블로킹 시키고 1차 항체들로 (HIF-1α:GenTeX, Irvine, CA.
데이터처리
- 통계적 유의성은 student's t-test를 통해 분석하여 나타내었다.
이론/모형
- 5A에 대한 결과에서 CT는 pSTAT3의 핵내로의 축적을 억제 시켰다. 핵내로의 감소된 STAT3의 축적이 활성에도 영향을 미치는지 알아보기 위해 ChIP assay 시행하였다. STAT3의 활성이 직접적으로 VEGF promoter에 결합하여 VEGF의 전사적조절과 관련이 있다17,18).
성능/효과
- 6시간 저산소환경과 정상 환경에서의 CT 농도별 처리에 의한 HIF-1α 발현량을 조사한 결과 CT의 처리가 농도 의존적으로 HIF-1α의 발현량이 감소됨을 확인하였다(Fig. 2B).
- AKT siRNA transfection에 의해 HIF-1α의 발현이 감소되었음을 확인 하였으며, CT 단독 처리 및 동시처리에서도 HIF-1α 발현이 저해 됨을 확인하였다.
- CT 처리군에서는 대조군에 비해 HIF-1α의 발현이 현저히 감소 되었으며, 시간별에서는 6시간에서 높은 발현량을 보였다(Fig. 2A).
- STAT3의 활성이 직접적으로 VEGF promoter에 결합하여 VEGF의 전사적조절과 관련이 있다17,18). Fig. 5B에서 보여주는 것과 같이, 대조군인 저산소 환경에서는 STAT3가 VEGF promoter로의 결합이 보였지만, CT 처리에 의해 VEGF promoter에 결합이 감소됨을 확인하였다.
- 그 결과, CT를 처리하지 않은 대조군에서 6시간 까지는 시간에 따라 HIF-1α의 발현이 증가되다가 8시간 이후로 감소되는 경향을 보였다.
- 그 결과, Hypoxia에 의해 HIF-1α와 pSTAT3의 핵내로 축적의 증가가 CT처리에 의해 감소됨을 확인하였다(Fig. 5A).
- 또한 Hypoxia에서도 활성화 되는 STAT3를 CT의 처리에 의해 감소함을 하였으며, 이 감소가 핵내 축적의 감소에 의한 것임을 확인하였다. 더불어, 이 억제가 VEGF promoter 결합에 영향을 미쳐 직접적 전사조절에도 영향에 있음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 단삼에서 유래된 Cryptotanshione이라는 단일 물질이 HIF-1α를 억제 함을 보여 주었으며, 이 HIF-1α 의 억제가 AKT를 통한 조절임을 확인 하였다. 또한 Hypoxia에서도 활성화 되는 STAT3를 CT의 처리에 의해 감소함을 하였으며, 이 감소가 핵내 축적의 감소에 의한 것임을 확인하였다. 더불어, 이 억제가 VEGF promoter 결합에 영향을 미쳐 직접적 전사조절에도 영향에 있음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 단삼에서 유래된 Cryptotanshione이라는 단일 물질이 HIF-1α를 억제 함을 보여 주었으며, 이 HIF-1α 의 억제가 AKT를 통한 조절임을 확인 하였다.
- 이로써 CT의 HIF-1α의 억제효과는 AKT signaling과 관련이 있음을 확인 하였다(Fig. 4).
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