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문제 정의
- cereus 성장 특성에 대한 연구는 매우 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 단체급식에서 많이 사용되는 전처리 식재료 중 삶은 나물류 5가지(고사리, 도라지, 숙주나물, 시금치, 콩나물)에서 B. cereus의 성장 패턴을 조사하였다. 또한 broth에서 B.
- 본 연구에서는 단체 급식에서 많이 사용되는 전처리 농산물 중 삶은 나물류 5가지(고사리, 도라지, 숙주나물, 시금치, 콩나물)에서 B. cereus의 성장 패턴을 조사하고, broth에서 개발된 B. cereus의 성장 모델과 비교하여 broth 모델의 활용 가능성을 검증하였다. B.
제안 방법
- 온도에 따라 일정시간 후 미생물 배지에서 균의 성장을 조사하기 위해서 NB 1 mL를 취하여 멸균된 0.1% peptone water에 단계별로 희석하여 희석배수당 50 μL씩 취하여 nutrient agar(NA, Difco, USA) 배지에 무균적으로 분주하였다.
- 또한 데친 나물에는 희석액 100 μL를 각각의 시료 10 g에 골고루 접종하여 초기 농도가 103 CFU/g이 되도록 하였다.
- cereus의 성장 패턴을 조사하였다. 또한 broth에서 B. cereus 성장에 미치는 시간과 온도의 영향을 예측할 수 있는 1차, 2차 성장 모델을 개발하여 5가지 나물류를 대상으로 B. cereus의 성장 예측 broth model의 적합성을 검증하였다.
- Broth와 나물에 균을 접종하기 위해 전배양액을 여러 단계로 희석한 후 희석액 1 mL를 nutrient broth(NB) 24 mL에 접종하여 초기 농도가 103 CFU/g이 되도록 하였다. 또한 데친 나물에는 희석액 100 μL를 각각의 시료 10 g에 골고루 접종하여 초기 농도가 103 CFU/g이 되도록 하였다.
- 또한 데친 나물에는 희석액 100 μL를 각각의 시료 10 g에 골고루 접종하여 초기 농도가 103 CFU/g이 되도록 하였다. 접종된 NB는 13, 17, 24, 30, 35℃에 각 나물 시료들은 13, 24, 35℃에 각각 저장하여 균의 성장을 조사하였다. 온도에 따라 일정시간 후 미생물 배지에서 균의 성장을 조사하기 위해서 NB 1 mL를 취하여 멸균된 0.
- 나물 시료는 각 시료 10 g에 멸균된 0.1% peptone water 90 mL로 희석시킨 후 이 중 1 mL를 시험원액을 0.1% peptone water에 단계별로 희석하여 희석 배수 당 50 μL씩 취하여 B. cereus의 선택 배지인 Mannitol Egg Yolk Polymyxin agar(MYP, Difco, USA)에 무균 적으로 분주하였다.
- 각 온도에서 B. cereus의 성장 특성을 표현하기 위해 다음의 modified Gompertz 공식을 이용하였으며(Gibson et al 1987), GraphPad Prism V4.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 프로그램을 사용하여 성장 예측 1차 모델(primary mo-del)을 개발하고 유도기(Lag time, LT)와 최대 증식 속도(Ma- ximum specific growth rate, SGR)를 도출하였다.
- 각 온도에서 개발된 1차 모델에서의 유도기(LT)와 최대 증식 속도(SGR)는 Davey(1989) model과 Square-root model(Ratkowsky et al 1982)을 이용하여 각각의 성장 예측 2차 모델(Secondary growth model)을 개발하였다.
- 실험값을 통해 얻어진 모델의 성장 예측 모델로서의 적합성을 평가하기 위해 Bias factors(Bf), Accuracy factors(Af) 값을 유도기 (LT), 최대 증식 속도 (SGR) 각각에 대해 모델 개발 실험에 사용하지 않은 독립적인 변수에서 얻어진 실험값으로 다음의 식을 이용하여 구하였다(Ross T 1996, Abou-Zeid et al 2009).
- pH와 수분 활성도(Aw)는 B. cereus 성장 및 발육에 영향을 미치는 주요인으로서 각 나물을 대상으로 균을 접종하기 전의 상태에서 측정하였다. pH 측정은 pH 측정기(pH meter; IQ Scientific Instruments, USA)를 이용하여 시료 5 g에 3차 증류수 10 mL를 사용하여 균질화한 후 측정하였다.
- pH 측정은 pH 측정기(pH meter; IQ Scientific Instruments, USA)를 이용하여 시료 5 g에 3차 증류수 10 mL를 사용하여 균질화한 후 측정하였다. 수분 활성도의 측정은 시료 2.5 g을 채취하여 수분 활성도 측정기(AquaLab Lite, Decagon, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 1과 같다. 12℃ 이하에서는 B. cereus의 증식이 관찰되지 않았으므로, 13, 17, 24, 30, 35℃에서 각각 B. cereus에 대한 1차 성장 모델을 구축하였다. 이는 B.
- 각 온도별로 초기균수 약 3.0 log CFU/mL에서 최대 개체군밀도(Maximum population density, MPD)까지의 증식을 관찰하였으며, 1차 성장 모델에서 온도에 따른 유도기와 최대 증식 속도를 산출하였다(Fig. 1). 13℃에서는 B.
- 나물류에서 온도의 영향에 따라 변화하는 유도기와 최대 증식 속도의 실험값과 broth 2차 모델에 의해 예측된 수치를 예측값으로 하여 Bf와 Af를 식을 이용하여 나물류에서 broth 모델의 적합성을 평가하였다(Fig. 2와 Table 2). Bf와 Af 모두 가장 이상적인 값은 1이며, 두 값 모두 1에 가까울수록 실험 수치와 식에서 유도된 예측 수치 간의 차이가 적음을 나타낸다(Ross T 1996, Skandamis & Nychas 2000, Oscar TP 2005).
- cereus의 성장 모델을 개발한다는 것은 매우 어려운 일이다. 따라서 Broth에서 B. cereus의 성장 모델이 전처리 나물류에서 B. cereus의 성장을 예측하는데 활용할 수 있는가를 검증하기 위하여 broth 모델 개발을 위해 사용한 5가지 온도(13, 17, 24, 30, 35℃) 중 13, 24, 35℃를 선택하여 나물류(숙주나물, 콩나물, 도라지, 시금치, 고사리)에서 B. cereus의 증식 패턴을 조사하였다. 각각의 온도에서 나물류에서 B.
대상 데이터
- B. cereus(ATCC 11778)는 한국종균협회(Korean Federation of Culture Collections; KFCC) 로부터 구입하여 80℃에 보관하였다. 10 mL의 멸균상태의 Nutrient Broth(NB, Difco, USA)를 담은 삼각 플라스크에 해동된 B.
- cereus 10 μL를 접종하여 24시간 동안 30℃의 Rotary shaker(VS-1203P3V, 비전 과학)에서 전 배양하였다. 전 배양된 균은 멸균된 0.1% peptone water(Peptone, Difco, USA)에 희석하여 모델 개발을 위한 접종 균주로 사용하였다.
- 본 연구에서는 학교 급식에서 섭취 빈도가 가장 높은 나물류로 고사리, 도라지, 숙주나물, 시금치, 콩나물을 선정하였다. 실험에 사용된 나물류는 서울시 동대문구에 위치한 대형마트에서 당일 입고된 신선한 농산물을 구입 후 1시간 이내에 바로 세척하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 학교 급식에서 섭취 빈도가 가장 높은 나물류로 고사리, 도라지, 숙주나물, 시금치, 콩나물을 선정하였다. 실험에 사용된 나물류는 서울시 동대문구에 위치한 대형마트에서 당일 입고된 신선한 농산물을 구입 후 1시간 이내에 바로 세척하여 사용하였다. 세척된 각각의 나물은 100℃에서 2분간 가열한 후 멸균된 집게와 가위를 사용하여 무균 작업대(Clean bench) 안에서 수분을 제거한 후 petri dish에 10 g씩 채취하여 냉장고에 보관하였다.
데이터처리
- 결과값은 평균(Means) ± 표준편차(Standard deviation, SD)로 표현하였고, 각 그룹들 평균값 간의 유의적인 차이는 ANOVA(The analysis of variance)를 이용하여 분석하였고, Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 그룹간의 유의적 차이를 나타내었다.
- 모든 실험은 2회 반복으로 수행되었으며, 관찰된 실험 결과는 SAS(Statistical Analysis system) 통계 프로그램을 이용하여 분석되었다. 결과값은 평균(Means) ± 표준편차(Standard deviation, SD)로 표현하였고, 각 그룹들 평균값 간의 유의적인 차이는 ANOVA(The analysis of variance)를 이용하여 분석하였고, Duncan's multiple range test를 이용하여 p<0.
이론/모형
- Broth에서 B. cereus의 1차 성장 모델의 유도기 값(LT: Fig. 2A)과 최대 증식 속도 값(SGR: Fig. 2B)에 대해 온도 변화에 따른 B. cereus의 2차 성장 모델(secondary growth model)을 Davey 모델과 square root 모델을 이용하여 각각 개발하였다. 미국 USDA의 Pathogen Modeling Program(PMP)의 pH 7.
성능/효과
- cereus가 8과 10℃에서 증식하지 않았다는 선행 연구결과와 일치하였다(Kang et al 2010). Modified Gompertz mo- del을 이용하여 온도별 성장 곡선을 구축한 결과, 일차 식의 적합성을 나타내는 R2 값이 모두 0.99 이상으로 나타나, 배지 중의 B. cereus 성장에 관한 1차 모델로 modified Gompertz model에 적합함을 알 수 있었다.
- 5 log CFU/mL까지 성장하였다. 13과 17℃ 사이에서 B. cereus의 유도기가 가장 급격하게 감소하는 것으로 나타났으며, 최대로 성장하는 데까지 걸리는 시간 또한 13℃에서는 150시간이 소요된 반면 17℃에서 66시간으로 급격하게 감소하여 B. cereus의 성장을 저지하기 위해서는 13℃ 이하로 온도를 관리하는 것이 매우 중요한 것으로 나타났다.
- 그러나 24℃와 30℃의 경우, 두 온도에서 B. cereus의 성장 패턴이 매우 유사하고, 유도기도 각각 6.61, 5.53시간으로 비슷한 수준인 것에 반해 최대 증식 속도는 2배에 가까운 차이를 보여, 24℃ 이상의 온도에서는 온도에 따른 최대 증식 속도가 더 유의적인 영향을 받는 것으로 나타났다(p<0.05).
- 또한 최대 증식 속도(SGR)도 13℃에서 0.069 log CFU/hr로 가장 낮은 것으로 나타났으며, 17℃(0.184 log CFU/hr), 24℃(0.340 log CFU/hr), 30℃(0.750 log CFU/hr), 35℃(0.845 log CFU/hr)로 온도가 증가함에 따라 최대 증식 속도도 증가하는 것을 알 수 있었다. 13℃와 17℃ 사이에서의 유도기는 2배 이상의 변화가 있었으나, 최대 증식 속도에 있어서는 유의적인 차이가 나타나지 않은 것으로 보아, 이 범위에서는 유도기가 온도에 따라 영향을 더 받는 것으로 나타났다.
- 845 log CFU/hr)로 온도가 증가함에 따라 최대 증식 속도도 증가하는 것을 알 수 있었다. 13℃와 17℃ 사이에서의 유도기는 2배 이상의 변화가 있었으나, 최대 증식 속도에 있어서는 유의적인 차이가 나타나지 않은 것으로 보아, 이 범위에서는 유도기가 온도에 따라 영향을 더 받는 것으로 나타났다. 그러나 24℃와 30℃의 경우, 두 온도에서 B.
- cereus의 2차 성장 모델(secondary growth model)을 Davey 모델과 square root 모델을 이용하여 각각 개발하였다. 미국 USDA의 Pathogen Modeling Program(PMP)의 pH 7.5, 호기적 조건에서의 B. cereus 성장 모델과 비교했을 때, 본 연구에서 개발된 B. cereus의 broth 모델에서의 LT 값과 SGR 값은 PMP 모델에서 예측할 수 있는 값과는 차이가 있는 것으로 나타났다. PMP 모델에서 B.
- cereus의 broth 모델에서의 LT 값과 SGR 값은 PMP 모델에서 예측할 수 있는 값과는 차이가 있는 것으로 나타났다. PMP 모델에서 B. cereus의 LT 값은 13℃에서 35.62시간이었으며, 17℃에서 12.49시간, 24℃에서 3.24시간, 30℃에서 1.66시간, 35℃에서 1.34시간으로 나타나, 본 연구에서 개발한 B. cereus의 LT 값에 비해 전체적으로 짧은 유도기를 갖는 것으로 나타났다. 또한 PMP 모델에서 B.
- cereus의 LT 값에 비해 전체적으로 짧은 유도기를 갖는 것으로 나타났다. 또한 PMP 모델에서 B. cereus의 SGR 값은 13℃에서는 0.068 log CFU/hr로 본 연구에서 개발된 SGR 값과 유사하였으며, 17℃, 24℃, 30℃에서는 각각 0.131, 0.353, 0.708 log CFU/hr로 본 연구에서 개발된 모델보다 느리게, 35℃에서는 1.136 log CFU/hr로 본 연구에서 개발된 모델보다 빠르게 성장하는 것으로 나타났다. 이는 두 연구에서 사용한 균주의 차이 및 실험에 사용된 균주의 생리적인 특성의 차이에 기인한 것으로 사료된다.
- 이에 반해 35℃에서는 broth에서 0.84 CFU/hr로 가장 빠르게 증식하였으며, 콩나물, 시금치, 숙주나물, 도라지, 고사리 순으로 B. cereus의 성장이 느려졌으나, broth와 나물의 종류에 따라 성장률에 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.05).
- LT와 SGR의 Bf와 Af를 구하는 공식의 차이가 LT와 SGR 모두 Bf와 Af 값이 1보다 작을 때 LT와 SGR 2차 예측 모델은 사용하기에 안전한 모델임을 나타낸다(Abou-zeid et al 2009). 즉, 유도기와 최대 증식 속도 모델의 Bf가 1보다 작다는 것은 broth 모델에서 예측했던 것에 비해 나물류에서 B. cereus의 성장을 조사한 실험에서의 유도기도 더 길고 최대 증식 속도도 느려 결과적으로 개발된 broth 성장 모델은 나물류에서 실질적인 B. cereus 성장보다 더 빠를 것으로 예측하고 있다는 것을 의미한다.
- 2에 각각 보여진다. 나물류에서 B. cereus의 성장곡선도 Modified Gompertz model에 잘 적용되었으며, 모델의 적합성을 나타내는 R2는 0.94 이상인 것으로 나타났다.
- 나물류에서B. cereus의 성장에 미치는 온도의 영향을 보면 13℃에서 B. cereus의 LT는 도라지가 71.65시간으로 가장 길었고, broth, 숙주나물, 시금치, 콩나물 순으로 측정되어 나물의 종류에 따라 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났으며, 24℃에서는 고사리가 11.29시간으로 가장 긴 것으로 측정되어 유사한 LT 값을 갖는 broth, 시금치, 도라지, 숙주나물, 콩나물과 비교하였을 때 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다(Table 1). 그러나 35℃에서는 broth 및 나물의 종류에 따라 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다(p<0.
- 05). 또한 13℃에서 SGR은 숙주나물이 0.08 log CFU/hr로 가장 빠른 것으로 나타났으며 broth, 시금치, 콩나물, 도라지 순으로 증식속도가 감소하였고, 24℃에서는 시금치가 0.52 log CFU/hr로 가장 빨랐으며, broth, 숙주나물, 도라지, 고사리, 콩나물 순으로 느리게 증식하는 것으로 나타났으나, broth 및 나물의 종류에 따른 최대 증식 속도에 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다. 이에 반해 35℃에서는 broth에서 0.
- 05). 온도에 따라 나물류에서 B. cereus의 증식 패턴은 13℃와 같은 저온에서는 LT 값이 나물의 종류에 따라 유의적인 차이를 보였고, 35℃와 같은 높은 온도에서는 SGR 값이 나물류에 따라 유의적인 차이가 있는 것으로 나타나 온도 및 나물의 종류에 따라 B. cereus의 증식 패턴에 영향을 받는 것으로 나타났다. 본 연구와 동일한 균주를 사용한 Kang et al(2010)의 연구 결과에 따르면 삶은 콩나물과 두부에서 B.
- 본 연구에서 조사한 각각의 나물류의 pH와 Aw는 Table 3과 같다. 각 나물의 pH는 도라지가 5.66으로 5가지 나물류 중에서 가장 낮았으며, 콩나물(6.48), 숙주나물(6.62), 시금치(6.79), 고사리(7.16)순으로 높았다. 수분 활성도(Aw) 또한 도라지가 0.
- 16)순으로 높았다. 수분 활성도(Aw) 또한 도라지가 0.95로 가장 낮았으며 콩나물(0.96), 숙주나물(0.97), 고사리(0.99), 시금치(1.00) 순으로 본 연구에서 사용한 나물류의 pH 와 Aw는 B. cereus가 성장하기에 매우 적합한 조건이었다. 특히 콩나물의 경우 13℃와 24℃에서 B.
- cereus의 유도기는 짧고 최대 증식 속도가 느린 것으로 나타났으나, 35℃에서는 매우 빠르게 증식하였다. 반면, 다른 나물들에 비해 상대적으로 낮은 pH와 Aw를 갖는 도라지의 경우 각 온도에서 모두 유도기가 길고 최대 증식 속도는 다소 느린 경향을 보였다. 농촌진흥청의 식품성분표(2006)에 제시된 삶은 나물의 일반성분 분석결과에 따르면 나물 종류에 따른 수분함량 및 영양성분의 차이는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보이나, 고사리의 경우, 다른 나물에 비해 식이섬유 함량이 5.
- Broth의 2차 성장 모델에서 데친 나물류의 성장 예측 적절성에 대한 검증 결과, 실험 수치와 예측 수치의 차이를 나타내는 Bf의 경우, LT 모델에서 도라지와 고사리가 적합하고 SGR 모델의 경우, 숙주나물이 모델 적합성 허용 범위(0.7～1.15)에 속하는 것으로 나타났다(Table 2). 이와 같은 결과는 도라지와 고사리에서의 LT값과 숙주나물에서의 SGR값은 B.
- 15)에 속하는 것으로 나타났다(Table 2). 이와 같은 결과는 도라지와 고사리에서의 LT값과 숙주나물에서의 SGR값은 B. ce-reus broth 모델을 적용할 수 있는 것으로 판단되며 본 연구에서 수행하지 않은 온도에서도 도라지와 고사리의 유도기 및 숙주나물의 최대 증식 속도를 예측하는 데 broth 모델을 활용할 수 있는 것으로 판단된다.
- cereus의 성장 모델과 비교하여 broth 모델의 활용 가능성을 검증하였다. B. cereus를 각 온도별(13, 17, 24, 30, 35℃)로 broth에 배양하면서 생육 변화를 측정한 결과, 13℃에서 증식을 하지 않는 고사리를 제외한 모든 나물에서 온도에 비례하여 유도기는 감소하고 최대 증식 속도는 증가하는 동일한 경향이 나타났다. 본 연구 결과에 따르면 B.
- cereus를 각 온도별(13, 17, 24, 30, 35℃)로 broth에 배양하면서 생육 변화를 측정한 결과, 13℃에서 증식을 하지 않는 고사리를 제외한 모든 나물에서 온도에 비례하여 유도기는 감소하고 최대 증식 속도는 증가하는 동일한 경향이 나타났다. 본 연구 결과에 따르면 B. cereus는 숙주나물과 시금치에서 빠르게 증식하고, 고사리와 도라지에서 느리게 증식하였다. 도라지는 다른 나물들에 비해 상대적으로 낮은 pH와 Aw를 가지며, 고사리는 다른 나물에 비해 식이섬유 함량이 높아 미생물 증식에 부적절한 세포 구조를 형성한다는 점에서 균의 성장 패턴에 영향을 미치는 것으로 판단된다.
- 도라지는 다른 나물들에 비해 상대적으로 낮은 pH와 Aw를 가지며, 고사리는 다른 나물에 비해 식이섬유 함량이 높아 미생물 증식에 부적절한 세포 구조를 형성한다는 점에서 균의 성장 패턴에 영향을 미치는 것으로 판단된다. 전반적으로 나물에서의 유도기(LT)와 최대 증식 속도(SGR)는 broth에서와 차이를 보였지만, 도라지와 고사리에서의 LT값과 숙주나물에서의 SGR값은 B. cereus 성장 예측을 위한 broth 모델을 적용하기에 안전한 모델인 것으로 나타났다. Broth는 B.
후속연구
- cereus 성장 예측을 위한 broth 모델을 적용하기에 안전한 모델인 것으로 나타났다. Broth는 B. cereus의 성장을 최적으로 지지할 수 있는 조건을 갖춘 영양 배지로 식품과는 다를 수 있으나, broth 모델과의 적합성 평가를 통해 균주의 성장 패턴을 예측할 수 있다는 점에서 유용하게 이용될 것으로 판단된다. 본 연구에서는 5가지 나물류만을 이용하여 실험을 수행했지만, 보다 많은 나물류와 더 다양한 온도 및 조건에서의 B.
- cereus의 성장을 최적으로 지지할 수 있는 조건을 갖춘 영양 배지로 식품과는 다를 수 있으나, broth 모델과의 적합성 평가를 통해 균주의 성장 패턴을 예측할 수 있다는 점에서 유용하게 이용될 것으로 판단된다. 본 연구에서는 5가지 나물류만을 이용하여 실험을 수행했지만, 보다 많은 나물류와 더 다양한 온도 및 조건에서의 B. cereus의 성장 예측 연구가 이루어지면 미생물의 증식을 억제하는 기준이나 규격을 정할 때 활용이 가능할 것이다. 단체 급식에서 전처리 식재료의 사용이 계속 증가하고 있으나, 전처리 나물류는 아직 HACCP 적용이 되지 않으나, 본 연구에서 개발된 모델은 나물류의 HACCP 공정에서의 CCP 및 CL을 설정하고 유통기한 설정 및 HACCP 계획의 적합성을 검증하는데 활용되어 HACCP의 효과를 극대화 하는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
- cereus의 성장 예측 연구가 이루어지면 미생물의 증식을 억제하는 기준이나 규격을 정할 때 활용이 가능할 것이다. 단체 급식에서 전처리 식재료의 사용이 계속 증가하고 있으나, 전처리 나물류는 아직 HACCP 적용이 되지 않으나, 본 연구에서 개발된 모델은 나물류의 HACCP 공정에서의 CCP 및 CL을 설정하고 유통기한 설정 및 HACCP 계획의 적합성을 검증하는데 활용되어 HACCP의 효과를 극대화 하는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
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