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문제 정의
- 본 연구에서는 민간 및 한방에서 이용되고 있는 결명자의 효능을 검정하고, 소재화 하는 연구의 일환으로 결명자가 간 기능에 미치는 영향을 검토하고자 결명자 에탄올 추출물이 D-galactosamine으로 간 손상을 유발한 흰쥐에서 간기능 관련 효소 활성도 및 과산화 지질함량에 미치는 영향을 조사하였다.
가설 설정
- 1. 체중증가량 및 간 중량에는 각 군간 유의차가 나타나지 않았다.
제안 방법
- D-Galactosamine 투여 대조군과 0.25% 추출물 투여군, 0.5% 추출물 투여군에는 멸균증류수에 녹여 조제한 D-galactosamine을 800 ㎎/㎏ B.W.의 농도로 해부 20시간 전에 복강 내 투여하였으며, 투여 전후 4시간씩 절식시켰다.
- 간 조직 1 g에 1.15% KCl 9 ㎖를 가하여 homogenizer(Teflon Potter-Elevehjem)로 마쇄한 후 600×g에서 10분간 원심분리하여 그 상층액을 얻은 후 과산화지질 분석을 위한 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용된 결명자는 경북 고령에서 생산된 것을 구입하여 사용하였다. 결명자는 이물질을 골라내고, 물로 씻어 30℃ 건조기에서 건조시킨 후, 40 mesh로 분쇄하여 70% 에탄올 용액을 시료 중량의 10배를 가하여 16시간 동안 shaking한 다음 Toyo No. 2 여지를 사용하여 여과하였다. 여액은 감압농축시킨 후 동결건조하여 추출물 시료로 사용하였으며, 추출물의 수율은 11.
- 5% 추출물 투여군으로 나누어 5주간 사육하였으며, 물과 실험식이는 자유롭게 공급하였다. 본 실험에 사용한 식이는 AIN-76 diet 조성(corn starch 45%, casein 20%, sucrose 20%, corn oil 5%, cellulose 5%, mineral mix 3.5%, vitamin mix 1%, methionine 0.3%, choline chloride 0.2%)에 준하였고, 0.25% 추출물 투여군과 0.5% 추출물 투여군에는 결명자 에탄올 추출물을 각각 0.25%, 0.5%가 되도록 기본식이에 더하여 공급하였다. 식이 섭취량은 격일에 한 번 측정하였으며, 체중은 매주 측정하였다.
- 본 연구에서는 결명자의 에탄올 추출물이 D-galactosamine을 투여한 흰쥐의 간 손상에 미치는 영향을 알아보기 위하여 정상군, D-galactosamine 대조군, 결명자 에탄올 추출물 0.25% 첨가군 및 0.5% 첨가군으로 나누어 5주간 사육한 후 혈청 중간 기능 관련효소의 활성변화, 혈청 및 간 조직의 지질 및 지질과산화물의 함량, 간 조직의 SOD, catalase, GPX의 활성 변화를 관찰하였다. 이에 대한 연구 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 5%가 되도록 기본식이에 더하여 공급하였다. 식이 섭취량은 격일에 한 번 측정하였으며, 체중은 매주 측정하였다.
- 이 상층액을 다시 10,000×g에서 30분간 원심분리하여 post mitochondrial fraction을 얻어 이를 superoxide dismutase(SOD)와 glutathione peroxidase(GPX)의 활성 측정에 사용하였다.
- 혈청 중 aspartate transaminase(AST), alanine transaminase (ALT), gamma glutamyl transferase(γ-GTP), alkaline phosphatase(ALP)의 활성 측정은 (주)신양화학의 kit을 이용하여 분석하였다.
- 혈청 중 콜레스테롤과 중성지방 함량은 (주)신양화학의 kit을 사용하여, 콜레스테롤은 Cholestezyme-V, 중성지방은 Triglylzyme-V로 함량을 측정하였다. Foch법(Folch 등 1957)으로 간 조직 중의 지질을 추출한 후 분석 kit을 사용하여 콜레스테롤과 중성지방 함량을 측정하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 6주령 된 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐를 대한 바이오링크(주)로부터 구입하여 1주일간 기본식이로 적응시킨 후, 난괴법에 의해 정상군, D-galactosamine 투여 대조군, 0.25% 추출물 투여군, 0.5% 추출물 투여군으로 나누어 5주간 사육하였으며, 물과 실험식이는 자유롭게 공급하였다. 본 실험에 사용한 식이는 AIN-76 diet 조성(corn starch 45%, casein 20%, sucrose 20%, corn oil 5%, cellulose 5%, mineral mix 3.
- 실험에 사용된 결명자는 경북 고령에서 생산된 것을 구입하여 사용하였다. 결명자는 이물질을 골라내고, 물로 씻어 30℃ 건조기에서 건조시킨 후, 40 mesh로 분쇄하여 70% 에탄올 용액을 시료 중량의 10배를 가하여 16시간 동안 shaking한 다음 Toyo No.
데이터처리
- 1) Values are mean±S.E.(n=8) and those in the same row not sharing common superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Values are mean±S.E.(n=8) and those on the bar not sharing common superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 실험결과는 SAS를 이용하여 실험군당 평균±표준오차로 나타내었으며, 각 군의 유의차 검정은 분산분석을 한 후 α=0.05 수준에서 Duncan의 다중비교법에 의해 검증하였다.
이론/모형
- AST와 ALT는 Reitman-Frankel법에 준한 혈청지오티 지피티 측정세트를 사용하였고, γ-GTP는 γglutamyl-p-nitroanilide 기질법에 의한 γ-GTP-S로, ALP는 King-king법을 변경 개량한 뉴-케어-포스를 사용하여 활성을 측정하였다.
- 조제된 시료는 분석 시까지 -70℃에서 냉동보관하였다. Catalase의 활성 측정은 기질인 hydroxide peroxide가 분해되는 정도를 측정하는 Abei LH(1974)의 방법에 준하였고, SOD 활성은 Marklund와 Marklund(1974)의 방법, GPX 활성은 Lawrence와 Burk(1976)의 방법에 의하여 측정하였다. 각 효소원의 단백질 량은 Lowry 법(1951)에 의해 정량하였고, 표준 단백질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 혈청 중 콜레스테롤과 중성지방 함량은 (주)신양화학의 kit을 사용하여, 콜레스테롤은 Cholestezyme-V, 중성지방은 Triglylzyme-V로 함량을 측정하였다. Foch법(Folch 등 1957)으로 간 조직 중의 지질을 추출한 후 분석 kit을 사용하여 콜레스테롤과 중성지방 함량을 측정하였다.
- Catalase의 활성 측정은 기질인 hydroxide peroxide가 분해되는 정도를 측정하는 Abei LH(1974)의 방법에 준하였고, SOD 활성은 Marklund와 Marklund(1974)의 방법, GPX 활성은 Lawrence와 Burk(1976)의 방법에 의하여 측정하였다. 각 효소원의 단백질 량은 Lowry 법(1951)에 의해 정량하였고, 표준 단백질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
- 15% KCl 9 ㎖를 가하여 homogenizer(Teflon Potter-Elevehjem)로 마쇄한 후 600×g에서 10분간 원심분리하여 그 상층액을 얻은 후 과산화지질 분석을 위한 시료로 사용하였다. 과산화지질의 분석은 Ohkawa 등(1979)의 방법에 따라 분석하였으며, 표준물질로는 1,1,2,2,-tetraethoxypropane을 사용하였다.
성능/효과
- γ-GTP도 침윤성 간질환 및 알코올에 의한 간 손상 지표 효소의 하나로서 이러한 병변 시 유의하게 증가하는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서도 D-galactosamine 투여로 인해 유의하게 증가하였고, 결명자 추출물 첨가군에서 다소 증가하였다.
- 2. D-Galactosamine 투여로 혈청 및 간 조직의 콜레스테롤과 중성지방이 감소했으며, 결명자 에탄올 추출물은 이러한 지질 감소를 억제하는 효과를 나타냈다.
- 3. D-Galactosamine 투여로 간 조직의 AST, ALT, γ-GTP 및 ALP의 활성이 유의하게 증가하여 간 손상이 유발되었음을 알 수 있었으며, 결명자 에탄올 추출물은 D-galactosaine에 의해 증가된 AST와 ALT의 활성도를 유의하게 감소시켰다.
- 4. 결명자 에탄올 추출물은 D-galactosamine 투여로 인해 증가된 TBARS 함량을 유의하게 감소시켰다.
- 5. 간 조직의 SOD 활성은 D-galactosamine 투여에 의해 유의하게 감소되었다가 결명자 에탄올 추출물 투여군에서 농도의존적으로 유의하게 증가하였으며, catalase 활성도 같은 경향을 나타내었다. GPX 활성은 결명자 추출물 첨가군에서 유의하게 낮아짐을 볼 수 있었다.
- D-galactosamine 투여로 인해 증가된 간 기능 관련 각종 효소의 활성 및 지질과산화물의 생성이 결명자 에탄올 추출물을 공급함으로써 개선되었다. 이상의 결과를 볼 때 결명자 에탄올 추출물이 흰쥐에 있어서 D-galactosamine 투여로 인한 간 손상을 감소시키는 효과가 있으며, 이러한 결명자 추출물의 간 보호효과의 일부는 항산화기능에 기인하는 것으로 사료된다.
- 결명자 에탄올 추출물을 공급하였을 때 혈청 중성지방이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였고, 통계적 유의성은 없었으나 혈청 콜레스테롤도 다소 증가하는 경향을 보였다. 간 조직의 콜레스테롤 및 중성지방의 함량도 혈청과 마찬가지로 정상군에 비해 D-galactosamine 투여 대조군에서 유의적으로 감소하였고, 결명자 추출물을 공급하였을 때 콜레스테롤은 유의적으로 증가하였고, 통계적 유의성은 없었으나 중성지방도 다소 증가하는 경향을 보였다. D-Galactosamine으로 간 손상을 유발한 흰쥐에서 혈청 콜레스테롤은 감소하고 중성지방은 증가하였다고 한 Cho 등(2006)의 보고에서는 본 연구 결과와 다소 다른 결과를 보였다.
- 혈청 콜레스테롤과 중성지방은 D-galactosamine 투여 대조군에서 정상군에 비해 크게 감소하였다. 결명자 에탄올 추출물을 공급하였을 때 혈청 중성지방이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였고, 통계적 유의성은 없었으나 혈청 콜레스테롤도 다소 증가하는 경향을 보였다. 간 조직의 콜레스테롤 및 중성지방의 함량도 혈청과 마찬가지로 정상군에 비해 D-galactosamine 투여 대조군에서 유의적으로 감소하였고, 결명자 추출물을 공급하였을 때 콜레스테롤은 유의적으로 증가하였고, 통계적 유의성은 없었으나 중성지방도 다소 증가하는 경향을 보였다.
- 간, 담도계 질환의 지표효소로 알려진 ALP는 담즙 울체시, 답즙을 통한 간 유래 ALP의 배설장애와 담관 내압 항진에 의한 간에서의 생성 증가로 혈중 활성이 현저히 증가하는 것으로 알려져 있으며, 다른 연구 결과(Choi 등 2006; Kim 등 2007)와 유사하게 본 연구에서도 D-galactosamine 투여로 혈청 ALP 활성이 정상군에 비해 유의적으로 증가하였다. 결명자 추출물 첨가군에서 다소 ALP의 감소 경향이 나타났으나 통계적 유의성은 없었다.
- 그 중 간 조직에 가장 많이 존재하며, 효소 내부의 이러한 금속의 산화·환원작용으로 인하여 superoxide radical에 전자를 전달하여 독성을 가지는 superoxide radical을 H2O2로 전환시켜 해독하는 역할을 한다(Mates 등 1999). 결명자 추출물 첨가군의 경우, D-galactosaine 투여로 인해 감소한 SOD 활성이 농도의존적으로 증가하여 0.5% 추출물 첨가군에서는 정상군의 활성도에 가깝게 증가됨을 볼 수 있었고, 따라서 결명자 추출물이 간독성으로 인한 SOD 효소활성 저하를 억제하는 효과를 나타낸다고 판단되었다.
- D-Galactosamine 등 독성물질을 생체 내 투여하여 생성되는 oxygen radical은 세포막을 구성하는 불포화지방산의 산화적 반응에 의해 지질과산화를 초래하여 혈액 및 조직 내 과산화지질 함량을 증가시키고, 결국은 연쇄적인 조직의 괴사를 초래한다(Adzharov 등 1989). 결명자 추출물을 공급하였을 때 0.25%, 0.5% 추출물 첨가군 모두 D-galactosamine 대조군에 비해 TBARS 함량이 유의하게 감소하였다. 사염화탄소로 간 손상을 유도한 본 연구진의 선행 연구에서도 결명자 에탄올 추출물은 TBARS의 생성을 억제하여 본 연구와 유사한 결과를 보였다(Ha 등 2001b).
- 2에는 결명자 에탄올 추출물이 D-galactosamine으로 처리한 흰쥐 간 조직의 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) 함량에 미치는 영향을 나타내었다. 과산화지질의 지표로 TBARS량을 측정한 결과, D-galactosamine으로 간 손상을 유발시켰을 때 정상군에 비해 154% 정도 증가하였다. 이는 D-galactosamine을 투여함으로써 간 조직의 지질과산화물 함량이 현저하게 증가했다고 보고한 Kim 등(2004)과 Choi 등(2006)의 연구 결과와도 일치하였다.
- 간 중량의 경우, 모든 군에서 통계적 유의성은 나타나지 않았으나, D-galactosamine을 투여한 군에서 정상군에 비해 다소 증가하는 경향을 보여, 사염화탄소로 간독성을 유발했을 때 간 중량이 증가한 선행 연구(Ha 등 2001b)와 유사한 결과를 보였다. 본 실험 조건하에서는 결명자 추출물은 간 중량에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 사료되었다.
- 사염화탄소로 간 손상을 유도한 본 연구진의 선행 연구에서도 결명자 에탄올 추출물은 TBARS의 생성을 억제하여 본 연구와 유사한 결과를 보였다(Ha 등 2001b). 본 연구 결과를 볼 때 결명자 에탄올 추출물의 투여가 D-galactosamine 투여로 생성되는 free radical의 생성을 억제하거나 소거하여 간 조직의 지질과산화반응을 억제하여 간을 보호하는 것으로 사료된다.
- 의 무독화를 촉매하는 항산화 효소로써, 산화적 스트레스에 의해 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다(Mutanen & Mukkanene 1984). 본 연구에서 GPX 활성이 결명자 추출물을 공급한 군에서 대조군보다 유의하게 감소되었는데, 이는 결명차 추출물이 D-galactosamine에 의한 free radical의 생성을 저하시킨 것으로 추측된다. 체내 효소적 항산화계는 산화적 스트레스 유도물질의 종류와 농도, 조직에 따라 각 효소의 반응이 다르게 나타나는 것으로 생각된다.
- 손상된 간으로부터 혈액에 방출된 간의 효소 활성도 측정은 간기능 측정의 유용한 방법으로 D-galactosamine 등 유독 물질에 의한 간세포의 괴사와 간 조직의 파괴가 진행됨에 따라 transminase가 혈중으로 유리되어 AST, ALT의 효소 활성도가 현저하게 증가된다(Hayes AW 1982). 실제로 D-galactosamine 처리로 간 손상을 유발한 흰쥐에서 혈청 AST와 ALT가 급격히 상승하였다는 연구 결과들(Kim 등 2004; Choi 등 2006; Choi 등 2007)과 같이, 본 연구에서도 D-galactosamine 투여 대조군에서 정상군에 비하여 AST와 ALT 활성이 유의한 상승을 보여 간독성이 유발됨을 알 수 있었고, 결명자 에탄올 추출물을 공급하였을 때 대조군에 비하여 AST 및 ALT의 효소 활성은 각각 26～56%와 38～41%의 유의한 개선 효과가 나타났다.
- 이상과 같이 결명자 에탄올 추출물은 D-galactosamine에 의하여 증가된 AST, ALT 등 간질환 관련 효소의 활성을 유의하게 감소시키는 것으로 보아 D-galactosamine에 의해 유발되는 간 조직의 손상을 억제하여 간을 보호하는 작용이 있는 것으로 판단되었다.
- D-galactosamine 투여로 인해 증가된 간 기능 관련 각종 효소의 활성 및 지질과산화물의 생성이 결명자 에탄올 추출물을 공급함으로써 개선되었다. 이상의 결과를 볼 때 결명자 에탄올 추출물이 흰쥐에 있어서 D-galactosamine 투여로 인한 간 손상을 감소시키는 효과가 있으며, 이러한 결명자 추출물의 간 보호효과의 일부는 항산화기능에 기인하는 것으로 사료된다.
- 실험동물의 체중증가량, 사료섭취량 및 간 중량에 미치는 결명자 에탄올 추출물의 영향을 Table 1에 나타내었다. 체중증가량은 모든 군에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 결명자 에탄올 추출물을 공급한 군에서 정상군이나 D-galactosamine 투여 대조군에 비해 사료섭취량이 유의적으로 높았고, 그 결과 식이효율이 결명자 에탄올 추출물을 공급한 군에서 유의적으로 낮았다. 간 중량의 경우, 모든 군에서 통계적 유의성은 나타나지 않았으나, D-galactosamine을 투여한 군에서 정상군에 비해 다소 증가하는 경향을 보여, 사염화탄소로 간독성을 유발했을 때 간 중량이 증가한 선행 연구(Ha 등 2001b)와 유사한 결과를 보였다.
- 혈청 또는 간 조직의 콜레스테롤 및 중성지방 함량의 감소는 중증 간실질 장해와 같은 간장 장해가 발생하였을 때 나타난다고 보고되어 있어(Kim & Han 1998), 본 연구 결과 결명자 추출물 공급은 간 손상으로 인한 지질 감소를 어느 정도 억제하는 효과를 나타내는 것으로 보이며, 결명자 추출물이 D-galactosamine으로 인한 간 독성으로부터 간 조직을 보호하는 것으로 사료되었다.
- 혈청 중의 AST와 ALT 활성을 보면, 정상군에 비해 D-galactosamine 투여 대조군에서 급격하게 증가하였고, 결명자 추출물 첨가군에서는 대조군에서 증가되었던 활성이 유의하게 감소되어 결명자 추출물이 D-galactosamine에 의한 효소활성의 상승 억제효과를 보였다. 이러한 효과는 AST 활성의 경우 추출물의 첨가 농도가 높을수록 크게 나타나 농도의존성을 보였다.
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