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문제 정의
- 본 연구에서는 piceatannol의 항염증 기전을 염증반응에서 중요한 NF-κB를 포함한 다양한 신호전달경로를 통해 밝히고자 한다.
- 이는 LPS가 세포막의 Toll-like receptor 4 (TLR4)에 결합하여 PKC를 포함한 다양한 신호전달경로를 활성화시키기 때문으로 사료된다. 본 연구에서는 LPS로 염증반응을 유도한 Raw264.7 세포에서 piceatannol의 항염증기전을 조사하였다.
제안 방법
- 그 후, LPS(1 mg/L)와 다양한 농도(0～10 μmol/L)의 piceatannol이 포함된 SDM으로 세포를 24시간 배양한 후, MTT(2.4 mmol/L)가 포함된 배양액으로 교체하였다.
- Piceatannol의 농도에 따른 Raw264.7 세포의 독성을 조사하기 위하여 MTT assay를 통해 살아있는 세포의 수를 조사하였다. Raw264.
- 7 세포를 10% FBS가 포함된 배지에 희석하여 50,000 cells/well의 밀도로 24-well plate에 분주하였다. 24시간 후, 1% FBS가 함유되어 있는 DMEM(serum-deprivation medium, SDM)으로 24시간 serum deprivation 하였다. 그 후, LPS(1 mg/L)와 다양한 농도(0～10 μmol/L)의 piceatannol이 포함된 SDM으로 세포를 24시간 배양한 후, MTT(2.
- 핵분획을 준비하기 위하여 scraper를 사용하여 모은 세포에 hypotonic buffer[10 mmol/L HEPES, pH 7.9, 1.5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L KCl, 0.2 mmol/L PMSF, 0.5 mmol/L dithiothreitol(DTT), 0.5% NP-40, 10 mmol/L iodoacetic acid, 20 mg/L aprotinin, 15 μmol/L antipain, 21 μmol/L leupeptin, 0.5 mmol/L benzamidine HCl]를 첨가하여 얼음에서 10분간 용해하였다.
- 핵은 PI(1.5 μmol/L)로 염색한 후, 봉합하여 형광현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 관찰하였다.
- Transcriptional activity는 luciferase assay system(Promega)를 이용하여 측정하였고 β-galactosidase activity로 normalize 하였다.
- 먼저 Nucleofector-II(Amaxa, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 ARE reporter plasmid를 pCMV-β-galactosidase control vector와 co-transfection 하였다.
- 각각의 항체를 5% milk/TBST(iNOS, COX-2, β-actin, p65, Lamin-B, HO-1) 혹은 5% BSA/TBST(IκB-α, P-SAPK/JNK, P-STAT3, STAT3)로 희석(1:1,000)한 후, membrane을 1시간 incubation하고 TBST로 10분간 3회 헹구었다.
- 원심분리(2,300×g, 15 min, 4 ºC)하여 상층액(세포질분획)을 수집한 후, NP-40가 포함되지 않은 hypotonic buffer로 pellet를 한차례 헹구었다.
- Cell lysates(50 μg protein)를 4～20% gradient sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDSPAGE)에서 크기에 따라 분리한 뒤, polyvinylidene fluoride membrane(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 이동시켰다. Membrane은 5% milk-TBST(20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5)로 1시간 incubation 한 후, TBST로 10분간 3회 헹구었다. 각각의 항체를 5% milk/TBST(iNOS, COX-2, β-actin, p65, Lamin-B, HO-1) 혹은 5% BSA/TBST(IκB-α, P-SAPK/JNK, P-STAT3, STAT3)로 희석(1:1,000)한 후, membrane을 1시간 incubation하고 TBST로 10분간 3회 헹구었다.
- 위에서 언급한 바와 같이 Raw264.7 세포를 LPS와 piceatannol를 첨가한 배양액에서 배양한 후, RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 total RNA를 분리하였다. Oligo dT와 superscript II reverse transcriptase를 이용하여 template RNA로부터 cDNA를 합성하고 HO-1(12)의 primer(sense: 5'-TTACCTTCCCGAACATCGAC-3', antisense: 5'-GCATAAATTCCCACTGCCAC-3') 혹은 β-actin(13)의 primer(sense: 5'-GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3', antisense: 5'-GTGGCCATCTCCTGCTCGAAGTC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다(annealing temperature: 60ºC).
- 7 세포는 실험 당일에 배양 접시를 80%로 덮도록 분주하고, P/S이 첨가되지 않은 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. Antioxidant response elements(ARE)의 transcriptional activity는 mouse HO-1의 enhancer 2와 minimal promoter region을 포함하는 ARE reporter plasmid(14)를 이용하여 측정하였다. 먼저 Nucleofector-II(Amaxa, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 ARE reporter plasmid를 pCMV-β-galactosidase control vector와 co-transfection 하였다.
- 따라서 이후의 실험에서는 세포독성을 나타내지 않은 농도인 10 μmol/L 이내로 piceatannol을 처리하였다.
- 먼저 MTT assay를 통해 Raw264.7 세포에 독성을 나타내지 않는 piceatannol의 농도를 선정하고자 하였다. Fig.
- 대식세포는 NO와 PGE2 외에도 염증성 사이토카인을 분비하여 염증반응에 관여한다. Raw264.7 세포에서 LPS와 piceatannol이 염증성 사이토카인에 미치는 영향을 ELISA kit를 사용하여 조사하였다. Piceatannol의 처리는 LPS에 의해 증가된 TNF-α, IL-6, IL-1β의 분비를 유의적으로 감소시켰다(Fig.
- IL-6가 수용체에 결합하면 Janus family kinase와 SRC tyrosine kinase가 활성화되어 STAT3를 인산화 시킨다. Recombinant IL-6의 처리는 pSTAT3(Tyr705)를 증가시키고 STAT3의 핵으로의 이동을 증가시켰다. 그리고 piceatanol의 처리는 IL-6에 의해 유도된 STAT3의 Try705 잔기의 인산화를 억제하고 STAT3의 핵으로의 이동을 억제하였다(Fig.
- 그 후 24시간 conditioned medium을 수집한 후, 세포배양액에 분비된 NO의 양은 Griess reagent system(Promega, Madison, WI, USA)으로, TNFα, IL-6, IL-1β의 양은 각각의 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(eBioscience, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
- Oligo dT와 superscript II reverse transcriptase를 이용하여 template RNA로부터 cDNA를 합성하고 HO-1(12)의 primer(sense: 5'-TTACCTTCCCGAACATCGAC-3', antisense: 5'-GCATAAATTCCCACTGCCAC-3') 혹은 β-actin(13)의 primer(sense: 5'-GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3', antisense: 5'-GTGGCCATCTCCTGCTCGAAGTC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다(annealing temperature: 60ºC).
- Piceatannol이 HO-1의 발현에 미치는 영향을 Western blot과 RT-PCR을 통하여 조사한 결과, HO-1의 단백질 발현은 piceatannol 처리 4시간부터 증가하기 시작하여 처리 moter region을 포함한 ARE reporter plasmid를 사용하여 luciferase assay를 수행하였다. 5 μmol/L piceatannol의 처리에서부터 ARE-driven luciferase의 transcriptional activity가 증가하였다(Fig.
대상 데이터
- Raw264.7 세포를 100-mm 배양 접시에 1.5×106 세포를 분주한 후, 위에서 언급한 바와 같이 LPS와 piceatannol를 첨가한 배양액으로 배양하였다.
- 세포배양에 사용한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)은 Welgene(Daegu, Korea)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)과 penicillin-streptomycin(P/S)은 Lonza(Walkersville, MD, USA)에서 구입하였다.
- p65, Lamin-B, signal transducer and activator of transcription 3(STAT3), hemeoxygenase(HO)-1, NF-E2 related factor 2(Nrf2) 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, iNOS와 COX-2, P-STAT3(Ser727), P-STAT3(Tyr705) 항체는 BD Transduction Laboratories(Palo Alto, CA, USA)에서, 그리고 inhibitory κB(IκB)-α, P-stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase(SAPK/JNK) 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-rabbit IgG-Alexa488 항체는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에서 사용한 쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. Raw264.
- 7 세포는 DMEM을 사용하여 37℃ 습윤한 CO2 incubator(5% CO2/95% air)에서 배양하였다. 실험에 사용할 세포를 유지하기 위해서 DMEM에 10% FBS와 100 kU/L penicillin, 0.17 mmol/L streptomycin을 첨가하여 사용하였다. 세포가 80% confluent해지면 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.
- Piceatannol이 LPS에 의해 유도되는 NO 및 염증성 사이토카인의 분비에 미치는 영향을 조사하기 위하여 위에서 언급한 바와 같이 Raw264.7 세포를 LPS와 piceatannol를 첨가한 배양액으로 배양하였다. 그 후 24시간 conditioned medium을 수집한 후, 세포배양액에 분비된 NO의 양은 Griess reagent system(Promega, Madison, WI, USA)으로, TNFα, IL-6, IL-1β의 양은 각각의 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(eBioscience, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
- p65, Lamin-B, signal transducer and activator of transcription 3(STAT3), hemeoxygenase(HO)-1, NF-E2 related factor 2(Nrf2) 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, iNOS와 COX-2, P-STAT3(Ser727), P-STAT3(Tyr705) 항체는 BD Transduction Laboratories(Palo Alto, CA, USA)에서, 그리고 inhibitory κB(IκB)-α, P-stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase(SAPK/JNK) 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 본 연구의 모든 실험 분석 결과는 각 실험군의 평균과 표준오차로 계산하고 각 실험 군들의 평균치간의 유의성은 SAS statistical software, version 8.12(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 ANOVA 분석 후 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 핵분획은 원심분리(25,000×g, 30 min, 4ºC)하여 상층액을 수집한 후 -70ºC에 보관하였다. Total cell lysates, 세포질과 핵 분획의 단백질의 양은 BCA protein assay(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였다.
- Anti-rabbit 또는 anti-mouse HRP-conjugated antibody를 5% milk/TBST에 희석(1:5,000)하여 membrane을 1시간 동안 incubation 하고 TBST로 10분간 3회 헹구었다. Antibody에 결합된 단백질들의 signal은 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Pierce)를 사용한 chemiluminescence 방법을 통하여 가시화하였다.
- 또한 COX는 2가지 isoform (COX-1, COX-2)이 존재하며, 대부분의 조직에서 발현되어 PGs의 항상성에 관여하는 COX-1과 달리 COX-2의 발현은 성장인자, 사이토카인 등의 자극에 의해 유도된다(17). Piceatannol이 iNOS와 COX-2의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Western blot를 수행하였다. iNOS와 COX-2의 발현은 LPS 처리에 의해 유도되었으며, piceatannol은 iNOS 의 발현을 억제하였지만 COX-2의 발현에는 영향을 미치지 않았다(Fig.
성능/효과
- 3A). LPS와 piceatannol를 첨가한 배양액으로 세포를 배양하여 수집한 24시간 conditioned medium으로 세포가 분비한 NO의 양을 정량한 결과, piceatannol은 LPS 에 의해 증가된 NO의 생성을 농도 의존적으로 감소시켰다 (Fig. 3B). 이 결과를 통해 piceatannol은 iNOS의 발현 억제를 통해 NO의 생성을 억제함을 알 수 있다.
- 3B). 이 결과를 통해 piceatannol은 iNOS의 발현 억제를 통해 NO의 생성을 억제함을 알 수 있다. Peritoneal macrophages와 BV2 microglia를 이용한 실험에서 piceatannol 은 iNOS의 발현을 억제하여 NO의 생성을 억제함이 보고되었다(4,18).
- 이 결과를 통해 piceatannol은 C/EBP 뿐만 아니라 NF-κB와 AP-1의 신호전달경로의 억제를 통해 iNOS의 발현을 억제함을 알 수 있다.
- 또 다른 전사인자로서 AP-1은 c-Jun, c-Fos로 구성되며, 이들은 각각 SAPK/JNK와 extracellular signal-regulated kinase1/2의 영향을 받는다(25). c-Jun의 upstream 단백질로 작용하는 SAPK/JNK의 인산화는 LPS 처리에 의해 증가하였으며, 증가된 SAPK/JNK의 인산화는 piceatannol 처리에 의해 유의적으로 감소하였다(Fig. 4A). 이 결과를 통해 piceatannol은 C/EBP 뿐만 아니라 NF-κB와 AP-1의 신호전달경로의 억제를 통해 iNOS의 발현을 억제함을 알 수 있다.
- Mouse mesangial cells 에서 IL-1β와 LPS는 STAT3를 활성화시킨다고 보고되었다(30). Piceatannol의 처리는 LPS에 의해 유도된 STAT3의 Tyr705와 Ser727 잔기의 인산화를 억제하였다(Fig. 6A). LPS의 작용은 수용체인 TLR4를 통해 이루어지는데, 최근 LPS 가 TLR4의 adapter protein인 myeloid differentiation primary-response protein 88을 통해 STAT3를 활성화시킨다고 보고되었다(31).
- LPS의 작용은 수용체인 TLR4를 통해 이루어지는데, 최근 LPS 가 TLR4의 adapter protein인 myeloid differentiation primary-response protein 88을 통해 STAT3를 활성화시킨다고 보고되었다(31). 또한 LPS의 처리는 STAT3의 Tyr705 잔기의 인산화도 증가시켰으며, 이로써 LPS에 의해 증가된 사이토카인에 의해 STAT3의 Tyr705 잔기의 인산화가 이루어졌으리라 예상할 수 있다.
- Recombinant IL-6의 처리는 pSTAT3(Tyr705)를 증가시키고 STAT3의 핵으로의 이동을 증가시켰다. 그리고 piceatanol의 처리는 IL-6에 의해 유도된 STAT3의 Try705 잔기의 인산화를 억제하고 STAT3의 핵으로의 이동을 억제하였다(Fig. 6B, 6C). Yu 등(32)은 myocytes에서 IL-6에 의해 활성화된 STAT3가 iNOS의 발현을 증가시킴을 보고하였다.
- 또한 HO-1은 IL-10의 항염증효과를 매개한다고 보고되었다(37). 따라서 이 결과를 통해 piceatannol은 Nrf2-ARE를 통해 HO-1의 발현을 증가시킴으로 항염증 효과를 나타냄을 보여준다. 대표적인 stilbene으로서 화학적 암 예방 물질로 주목받는 resveratrol은 항암활성 외에도 항염증 효과가 있다고 보고되었다(38).
- 본 연구에서 piceatannol은 HO-1의 발현을 증가시켰으며, 이는 iNOS와 염증성 사이토카인의 발현 억제와 함께 piceatannol의 항염증 활성의 주요 요인으로 사료된다(Fig. 8).
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