LPS로 유도된 RAW 264.7세포에 대한 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 에탄올 추출물의 항염증 효과 Anti-inflammatory Effect of Oxya chinensis sinuosa Ethanol Extract in LPS-induced RAW 264.7 Cells원문보기
본 연구에서는 벼메뚜기 에탄올 추출물의 항염증 효능을 분석하기 위해 LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 세포를 이용하였다. OCE의 항염증 효능을 확인 하기 위해서, 염증 유도된 RAW 264.7 세포에 대해 OCE 농도 의존적으로 염증성 사이토카인인 TNF-${\alpha}$와 IL-6의 유전자발현 및 단백질 생성을 감소시킴을 real-time PCR과 ELISA로 확인하였다. 또한, NF-${\kappa}B$ p65의 핵으로 이동이 차단됨을 면역형광염색으로 확인하였으며, iNOS와 COX-2 단백질 발현을 감소시키는 것을 Western blot 분석으로 확인하였다. 이상의 연구결과를 통해 벼메뚜기는 염증에 의한 NF-${\kappa}B$ p65의 활성과 TNF-${\alpha}$와 IL-6의 생성과 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하는 항염증 효능을 갖고 있는 것을 확인하였다.
본 연구에서는 벼메뚜기 에탄올 추출물의 항염증 효능을 분석하기 위해 LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 세포를 이용하였다. OCE의 항염증 효능을 확인 하기 위해서, 염증 유도된 RAW 264.7 세포에 대해 OCE 농도 의존적으로 염증성 사이토카인인 TNF-${\alpha}$와 IL-6의 유전자발현 및 단백질 생성을 감소시킴을 real-time PCR과 ELISA로 확인하였다. 또한, NF-${\kappa}B$ p65의 핵으로 이동이 차단됨을 면역형광염색으로 확인하였으며, iNOS와 COX-2 단백질 발현을 감소시키는 것을 Western blot 분석으로 확인하였다. 이상의 연구결과를 통해 벼메뚜기는 염증에 의한 NF-${\kappa}B$ p65의 활성과 TNF-${\alpha}$와 IL-6의 생성과 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하는 항염증 효능을 갖고 있는 것을 확인하였다.
Although the grasshopper Oxya chinensis sinuosa has long been used as food in Korea, there is little data on its functional effects. In this study, we investigated the anti-inflammatory effect of O. c. sinuosa ethanol extract (OCE) in RAW 264.7 mouse macrophage cells treated with lipopolysaccharide ...
Although the grasshopper Oxya chinensis sinuosa has long been used as food in Korea, there is little data on its functional effects. In this study, we investigated the anti-inflammatory effect of O. c. sinuosa ethanol extract (OCE) in RAW 264.7 mouse macrophage cells treated with lipopolysaccharide (LPS) for induction of inflammation. First, we determined that there is no cytotoxicity at $2,000{\mu}g/ml$ or less of OCE in RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-inflammatory effects of OCE, we investigated expression levels of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ and interleukin (IL)-6, and pro-inflammatory enzymes such as inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclo-oxygenase-2 (COX-2) in LPS-induced RAW 264.7 cells. In addition, we examined whether OCE could inhibit translocation of NF-${\kappa}B$ p65 into the nucleus in LPS induced RAW 264.7 cells. As a result, we found that the mRNA and protein levels of TNF-${\alpha}$ and IL-6 decreased in LPS-induced RAW 264.7 cells after treatment with OCE in a dose-dependent manner. In addition, we confirmed a $2,000{\mu}g/ml$ concentration of OCE inhibited translocation of NF-${\kappa}B$ p65 by immunnostaining and Western blot analysis, and a decrease in the protein expression levels of iNOS and COX-2. Accordingly, we suppose that OCE has an anti-inflammatory effect through down-regulation of TNF-${\alpha}$, IL-6, iNOS, and COX-2 related to ${\kappa}B$ p65 inflammatory signaling pathways.
Although the grasshopper Oxya chinensis sinuosa has long been used as food in Korea, there is little data on its functional effects. In this study, we investigated the anti-inflammatory effect of O. c. sinuosa ethanol extract (OCE) in RAW 264.7 mouse macrophage cells treated with lipopolysaccharide (LPS) for induction of inflammation. First, we determined that there is no cytotoxicity at $2,000{\mu}g/ml$ or less of OCE in RAW 264.7 cells. To evaluate the anti-inflammatory effects of OCE, we investigated expression levels of pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ and interleukin (IL)-6, and pro-inflammatory enzymes such as inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclo-oxygenase-2 (COX-2) in LPS-induced RAW 264.7 cells. In addition, we examined whether OCE could inhibit translocation of NF-${\kappa}B$ p65 into the nucleus in LPS induced RAW 264.7 cells. As a result, we found that the mRNA and protein levels of TNF-${\alpha}$ and IL-6 decreased in LPS-induced RAW 264.7 cells after treatment with OCE in a dose-dependent manner. In addition, we confirmed a $2,000{\mu}g/ml$ concentration of OCE inhibited translocation of NF-${\kappa}B$ p65 by immunnostaining and Western blot analysis, and a decrease in the protein expression levels of iNOS and COX-2. Accordingly, we suppose that OCE has an anti-inflammatory effect through down-regulation of TNF-${\alpha}$, IL-6, iNOS, and COX-2 related to ${\kappa}B$ p65 inflammatory signaling pathways.
하지만, 벼메뚜기의 기능성에 대한 연구는 산화적 스트레스를 유도한 신경아종 세포주인 SH-SY5Y에 대한 항산화 활성과 COX-2 전사 억제에 대한 보고 외에는 전무한 실정이다[19]. 이에 본 연구에서는 식용으로 이용되는 벼메뚜기에 대한 기능성 연구의 일환으로 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에 벼메뚜기 에탄올 추출물을 처리하여 벼메뚜기의 항염증 효능을 검증하였다.
제안 방법
OCE 처리 후 LPS 및 TNF-α에 의해 활성화되며 신호전달 과정에서 염증매개물질의 상류에 존재하는 전사인자 NF-κB p65의 활성화 억제 여부를 확인하기 위해 LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 세포에 OCE를 농도별(100, 2,000 μg/ml) 처리 후 면역형광염색을 통해 NF-κB p65의 세포 내 위치를 확인하였다. NF-κB p65는 염증이 유도되지 않을 경우에는 IκBα와 결합된 상태로 세포질에 존재하여 염증매개물질관련 유전자 전사를 활성화시킬 수 없지만, LPS 및 TNF-α에 의한 신호전달이 활성화 되면 IκBα가 분해되고 NF-kB p65가 핵으로 이동하여 염증매개물질 유전자의 프로모터에 존재하는 NF-kB element에 결합하여 전사를 활성화 시킨다[9, 25]
대상 데이터
추출물 제조를 위해 사용된 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa)는 강원도 영월군 영월읍 영흥리에서 채집된 것을 사용하였고 양성대조군으로 사용한 강황은 시중에서 판매되고 있는 국내산 건조 강황(Curcuma longa)을 구매하였다. 벼메뚜기 및 강황은 흐르는 물에 2회 세척한 후, 동결 건조기(Eyela, Japan)를 이용하여 건조시켜 수분을 제거하고 다기능 분쇄기 (Korea Medi, Korea)로 분쇄하여 분말을 제조하였다.
이론/모형
합성된 cDNA는 Power SYBR® Green Maser Mix (Applied Biosystems, IL, USA)를 이용하여 7500 Real-time Thermal Cycler (Applied Biosystems, IL, USA)를 통해 TNF-α 및 IL-6 유전자를 증폭시켰으며, 이때 사용한 프라이머(primer)는 Table 1에 나타내었다. Glyceraldehyde 3-phospate dehydrogenase (GAPDH)를 endogenous control로 사용하여 GAPDH 대비 TNF-α 및 IL-6 mRNA의 발현량을 ddCT method를 통해 상대정량 분석하였다.
LPS 처리시 대식세포 표면에 있는 TLR-4 (toll like receptor-4)에 의해 활성화되어 발현되는 염증성 효소인 iNOS 와 COX-2의 발현 억제를 통한 항염증 효능을 확인하기 위해, LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 세포에 OCE를 100, 500, 1,000, 2,000 μg/ml의 농도로 처리한 후 iNOS와 COX-2 단백질 발현량을 Western blot 분석을 통해 확인하였다. iNOS와 COX-2 단백질 모두 2,000 μg/ml OCE 처리시 단백질 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다(Fig.
OCE의 항염증 효능을 분석하기 위해 RAW 264.7 세포에 LPS로 염증 유도 후 OCE를 처리하고 염증성 사이토카인의 발현을 전사체 및 단백질 수준에서 각각 real-time PCR 및 ELISA에 의해 확인하였다(Fig. 2, Fig. 3). PAMPS의 일종인 LPS 처리시 대식세포 표면에 존재하는 TLR-4가 이를 인식하고 활성화되어 염증매개물질을 발현시키므로[9, 22, 25], 우선 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6에 대한 발현량을 전사체 수준에서 확인하였다.
성능/효과
그 결과 OCE는 2,000 μg/ml의 농도까지 세포 생장에 영향을 주지 않아 독성이 없음을 확인하였다. 본 실험에서는 기존에 항염증 효능이 보고된 강황(C. longa)을 양성대조군으로 사용하였으며[1], 강황은 본 실험에서 사용한 벼메뚜기 시료와 동일한 방법으로 에탄올 추출물 (CLE) 제조 후 1,000 μg/ml의 농도까지 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(Fig. 1). 따라서, 본 연구에서 사용한 OCE 및 CLE의 최고 농도는 각각 RAW 264.
2B). 양성대조군으로 사용된 CLE의 경우 세포 독성을 나타내지 않는 1,000 μg/ml의 농도로 LPS와 동시 처리시 LPS 단독처리군대비 TNF-α는 약 2.8배, IL-6는 약 1.7배 발현이 감소되었고, 동일농도의 OCE와 LPS 동시처리시 TNF-α는 약 3.1배, IL-6는 약 2.4배 발현이 감소되었으므로 염증이 유도된 대식세포에서 OCE가 CLE보다 염증성 사이토카인 발현을 보다 강하게 억제함을 확인할 수 있었다.
염증 유도된 RAW 264.7 세포에 2,000 μg/ml OCE 처리후 NF-κB p65 항체로 면역형광염색 결과 NF-κB p65는 대부분 핵으로 이동되지 않고 세포질에 존재하였으므로 OCE에 의해 NF-κB p65 활성화가 억제되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 4). 또한 NF-κB p65 활성이 억제되었으므로 IL-1β와 같은 다른 염증성 사이토카인이나 면역세포의 주화성을 증가시키는 chemokine 등의 생성도 추가로 차단할 것이라 추정된다.
후속연구
따라서 최근에는 천연물 유래의 COX-2 억제제가 NSAID에 비해 생체에 잘 흡수되고 대사되므로 부작용이 좀 더 적을 것으로 판단하여[6], 우유엉겅퀴 유래의 silymarin과 천연허브 6종을 혼합하여 만든 신바로 (shinbaro) 등과 같은 천연물에서 COX-2 억제제를 찾으려는 노력이 진행되고 있다[2, 13]. 따라서 본 연구에서 이용한 벼메뚜기 추출물(OCE)은 곤충 유래 천연물이며 TNF-α와 IL-6와 같은 염증성 사이토카인과 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하고 NF-kB p65의 활성화를 억제하므로 천연물 유래 항염증 물질로 개발될 수 있을 것이라 기대된다.
그러나 과도하게 분비된 TNF-α 및 IL-6는 면역계 항상성의 불균형을 초래하여 다양한 세포와 조직에 기능저해를 일으켜 제 2형 당뇨, 염증성 장질환, 류마치스 등과 같은 만성염증 및 자가면역질환을 유발할 수 있으므로 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 생성을 조절할 수 있는 물질은 만성염증 및 자가면역질환에 대한 치료제로 사용될 수 있다[4, 5, 22, 30]. 본 연구에서 사용한 OCE는 염증매개물 중 하나인 염증성 사이토카인을 강하게 억제하므로 항염증 효능을 갖고 있을 뿐만 아니라 OCE 처리시 기존에 항염증 효능이 보고된 강황을 동일한 농도로 처리한 경우 보다 TNF-α 및 IL-6 분비량이 감소됨을 확인할 수 있으므로 천연물 유래 항염증 물질로 사용될 수 있을 것이라 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증반응은 염증의 작용과 기간에 따라 어떻게 구분할 수 있는가?
염증반응은 상처와 외부 이물질의 침입 시 생체를 방어하기 위해 가장 먼저 일어나는 선천성 면역(innate immunity) 반응이며[8], 염증의 작용과 기간에 따라 급성염증과 만성염증 반응으로 나눌 수 있다. 급성염증 반응은 외부 이물질로 인한 자극에 의해 대식세포(macrophage)가 활성화되어 생성된 염증매개물질인 염증성 사이토카인(cytokine), chemokine, nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2) 등을 생성하여 이들에 의해 활성화된 백혈구와 대식세포에 의해 이물질을 제거한 후 조직재생을 통해 종료된다[22].
염증반응은 무엇인가?
염증반응은 상처와 외부 이물질의 침입 시 생체를 방어하기 위해 가장 먼저 일어나는 선천성 면역(innate immunity) 반응이며[8], 염증의 작용과 기간에 따라 급성염증과 만성염증 반응으로 나눌 수 있다. 급성염증 반응은 외부 이물질로 인한 자극에 의해 대식세포(macrophage)가 활성화되어 생성된 염증매개물질인 염증성 사이토카인(cytokine), chemokine, nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2) 등을 생성하여 이들에 의해 활성화된 백혈구와 대식세포에 의해 이물질을 제거한 후 조직재생을 통해 종료된다[22].
아라키돈산을 PGE2로 전환시키는 인자는 무엇에 의해 발현되는가?
TRAF-6는 IκK (I kappaB kinase)를 활성화시켜 세포질에 존재하는 전사인자인 NF-κB p50/p65에 결합되어 있는 IκBα가 분해되어 NF-κB p50/p65는 핵으로 이동된다. 핵으로 이동된 NF-κB p50/p65 전사인자는 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6와 염증성 효소인 iNOS 및 COX-2를 발현시킨다[3, 9, 12, 22, 25].
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