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문제 정의
- 갓모양이 우수한 계통과 대길이가 길고 속성형질을 가진 계통을 모본으로부터 교배육종으로 두 가지 형질을 모두 가진 우수품종을 육성하고자 하였다. 낮은 갓명도 형질의 동형접합체를 만들기 위하여 KNR2312 유래 단핵균사들로 자가교배를 실시하여 갓명도가 45.
- 선발된 애린이와 표준균주인 큰느타리3호를 대치배양하여 고유성을 검사하고자 하였다. gDNA 수준에서의 다형화는 URP 프라이머와 RAPD방법을 사용하여 확인하였다.
- 품종의 다양성과 고유성 문제를 해결하고, 잘 부서지지 않는 갓모양을 가진 품종을 육성하기 위하여 본 보고서에서 단핵균사의 교배를 통하여 갓 끝이 두껍고 색이 진한 새로운 품종을 육성하고자 하였다.
제안 방법
- KNR2312계통에서 채취한 단핵균사끼리 교배(자식)를 시킨 후 화합성 계통만을 선발하여 자실체를 발생시키고 주요계통의 특징을 조사하였다(Table 1). 갓의 명도는 56.
- , 2012)을 참고하여 KNR2312과 A8B10 두 계통을 모본으로 사용하였다. KNR2312는 단핵균사의 자식에 의해서 생산된 계통 중 갓색이 진하고 갓모양이 우수한 계통이 있다는 사실을 바탕으로 선택되었고, A8B10은 대길이가 긴 형질을 보유해서 모본으로 활용하기로 결정하였다. 단핵균사의 다양성을 유지하기 위하여 희석배수가 높은 페트리 디쉬에서 균사 속도에 상관없이 모든 단핵균사를 채취하여 교배에 사용하였다.
- 갓색이 진한 계통인 가5나5를 육종모본으로 사용하고 품질구성요소를 향상시키기 위하여 KNR2312에서 유래한 단핵균사들을 반복친으로 활용하여 여교배를 실시하기로 하였다. 가5나5에서 유래한 단포자 20개를 KNR2312에서 유래된 100개와 교배를 실시하여 자실체의 특성을 조사하였다(Table 4). 계통들 중 −4 × 7은 특이하게도 갓뿐만 아니라 대에도 검은색깔이 들어 있었다(Fig.
- 각 계통의 단핵균사가 만연된 MCM 배지를 메스를 이용하여 1 × 1 cm 크기로 잘라서 페트디쉬의 중앙부분에 서로 맞닿도록 치상한 후 25°C에 배양하여 두 균주의 균사가 충분히 섞인 후에 대치부분과 수평 연장선에 따라 MCM배지를 1/5 가량 반달모양으로 잘라내고 다시 2-3일 배양한 후 페트디쉬바닥으로 자란 균사를 현미경(400 ×)으로 관찰하여 클램프컨넥션이 형성된 교잡주만 선발하였다.
- 갓색이 진한 계통인 가5나5를 육종모본으로 사용하고 품질구성요소를 향상시키기 위하여 KNR2312에서 유래한 단핵균사들을 반복친으로 활용하여 여교배를 실시하기로 하였다. 가5나5에서 유래한 단포자 20개를 KNR2312에서 유래된 100개와 교배를 실시하여 자실체의 특성을 조사하였다(Table 4).
- 낮은 갓명도 형질의 동형접합체를 만들기 위하여 KNR2312 유래 단핵균사들로 자가교배를 실시하여 갓명도가 45.2, 품질이 6.5인 중간모본 KNR2312-2636-10 × 18을 선발하였고, 이를 A8B10(나) 유래 단핵균사와 이종교배 하였다.
- KNR2312는 단핵균사의 자식에 의해서 생산된 계통 중 갓색이 진하고 갓모양이 우수한 계통이 있다는 사실을 바탕으로 선택되었고, A8B10은 대길이가 긴 형질을 보유해서 모본으로 활용하기로 결정하였다. 단핵균사의 다양성을 유지하기 위하여 희석배수가 높은 페트리 디쉬에서 균사 속도에 상관없이 모든 단핵균사를 채취하여 교배에 사용하였다. 우수한 형질을 고도로 동형접합체(homozygote)화 하기 위하여 자가교배를 실시하였고, 대길이 형질을 도입하기 위하여 이종교배, 품질향상을 위하여 여교배를 실시하였다(Fig.
- 대 전체에 검은색이 들어 있는 −4 × 7계통을 2차 여교배의 모본으로 사용하여 자실체를 조사하고 주요계통의 특성을 나타내었다(Table 5).
- 1,500 ppm 이하로 맞춘 배양실에서 35일 배양시켰다. 배양 후 발이를 유도하기 위하여 종균과 기존배지를 깊이 1 cm 가량 제거하는 균긁기를 하고 생육실에 엎어서 치상하였다. 상대습도는 초음파가습기(Duru co.
- 배양 후 발이를 유도하기 위하여 종균과 기존배지를 깊이 1 cm 가량 제거하는 균긁기를 하고 생육실에 엎어서 치상하였다. 상대습도는 초음파가습기(Duru co., Korea)로 발이기까지 90%, 솎기까지(자실체크기 2.5~3 cm 정도) 85%, 솎기 후 수확기까지 80%로 유지하였다. 온도는 균긁기부터 솎기까지 15°C, 솎기 후부터 수확까지 14°C로 유지하였다.
- 선발된 계통은 “애린이”라고 명명하고 국립종자원에 품종보호등록을 하였다.
- 선발된 계통을 “애린이”로 명명하고 기존 품종인 큰느타리3호와 비교재배시험을 실시하였다.
- 소비자의 선호도가 높은 긴 대길이와 진한갓색을 가진 복합우수품종을 육종하기 위하여 갓색형질의 동형접합체인 KNR2312-26 × 36-10 × 83(이하 가)계통과 대길이가 긴 특성을 가진 A8B10(이하 나)계통을 단포자 교배하여 주요계통의 자실체 특성을 조사하였다(Table 3).
- 단핵균사의 다양성을 유지하기 위하여 희석배수가 높은 페트리 디쉬에서 균사 속도에 상관없이 모든 단핵균사를 채취하여 교배에 사용하였다. 우수한 형질을 고도로 동형접합체(homozygote)화 하기 위하여 자가교배를 실시하였고, 대길이 형질을 도입하기 위하여 이종교배, 품질향상을 위하여 여교배를 실시하였다(Fig. 1).
- 육성된 계통의 체세포 불화합성을 검사하기 위하여 애린이, 큰느타리3호를 가로 세로 1 × 1 cm 크기로 잘라서 MCM 배지위에 각각 4-5 cm 떨어진 위치에 옮겨서 25°C에서 서로의 균사가 자라서 접촉면이 커질 때까지 배양하여 저해선이 생기는지 관찰하였다.
- 육성된 품종의 고유성검사를 위하여 신품종(애린이), 큰 느타리3호의 gDNA를 DNeasy plant mini kit(Qiagen, 미국)을 이용하여 추출하였고, 30 ng의 주형 DNA, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 50 ng of URP primers(Seoulin, Korea), and 0.5 unit Taq polymerase(Solgent, Korea)가 포함된 25 ul PCR mixture를 이용하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다.
- 2 g으로 바로 품종화가 가능할 수준이었다. 이 계통에서 나온 단핵균사를 채취하여 2차 자식을 하면 갓색이 더 진한 동형접합계통을 얻을 수 있을 것으로 예상하고 추가적인 자가교배를 실시하였고, 주요계통의 결과를 Table 2에 나타내었다. 갓의 명도는 45.
- 색도는 색차계(Minolta, Japan)를 사용하여 갓 윗부분을 3번 측정하여 L(명도)값으로 표시하였다. 이들 중 수확소요일, 무게, 품질, 색상, 외형을 기준으로 우수계통을 선발하여 농가실증시험을 실시하였다.
- 단포자의 채취는 Im 등(2012)의 방법에 근거하여 수행하였고, KNR2312에서 100개, A8B10에서 20개의 단핵 균사를 채취하여 교배에 사용하였다. 이후 품질평가를 통하여 새로운 중간모본을 선발하고 앞서와 같은 방식으로 반복하여 수행하였다. 각 계통의 단핵균사가 만연된 MCM 배지를 메스를 이용하여 1 × 1 cm 크기로 잘라서 페트디쉬의 중앙부분에 서로 맞닿도록 치상한 후 25°C에 배양하여 두 균주의 균사가 충분히 섞인 후에 대치부분과 수평 연장선에 따라 MCM배지를 1/5 가량 반달모양으로 잘라내고 다시 2-3일 배양한 후 페트디쉬바닥으로 자란 균사를 현미경(400 ×)으로 관찰하여 클램프컨넥션이 형성된 교잡주만 선발하였다.
- 초기 melting을 위하여 95°C에서 4분, 95°C에서 20초간 melting, 55°C에서 40초간 annealing, 72°C에서 2분간의 증폭과정을 35회 반복한 뒤 마지막 증폭을 72°C에서 5분간 실시하였다. 증폭산물은 safeview(abm, Canada)가 첨가된 1.2% agarose에 로딩하고 UV에서 DNA의 다형성을 관찰하였다. 육성된 계통의 체세포 불화합성을 검사하기 위하여 애린이, 큰느타리3호를 가로 세로 1 × 1 cm 크기로 잘라서 MCM 배지위에 각각 4-5 cm 떨어진 위치에 옮겨서 25°C에서 서로의 균사가 자라서 접촉면이 커질 때까지 배양하여 저해선이 생기는지 관찰하였다.
- 초기 melting을 위하여 95°C에서 4분, 95°C에서 20초간 melting, 55°C에서 40초간 annealing, 72°C에서 2분간의 증폭과정을 35회 반복한 뒤 마지막 증폭을 72°C에서 5분간 실시하였다.
대상 데이터
- MCM(Mushroom Complete Media)배지를 사용하여 25°C에서 계대배양하며 사용하였고, 필요시 4°C에 저장하였다.
- , 2012)계통과 이로부터 유래한 중간모본으로 경상남도농업기술원 버섯연구실에서 수집 혹은 중간모본으로 육성하여 보관한 것이다. 대조품종으로는 큰느타리3호를 사용하였다. MCM(Mushroom Complete Media)배지를 사용하여 25°C에서 계대배양하며 사용하였고, 필요시 4°C에 저장하였다.
- 실험에 사용한 육종 모균주는 P. eryngii KNR2312, A8B10(Im et al., 2012)계통과 이로부터 유래한 중간모본으로 경상남도농업기술원 버섯연구실에서 수집 혹은 중간모본으로 육성하여 보관한 것이다. 대조품종으로는 큰느타리3호를 사용하였다.
- 따라서 교배를 통하여 갓 색이 진하고(명도가 낮은) 갓모양이 우수한 품종을 육성할 수 있는 가능성을 보여준다. 이전 연구보고서의 수집된 자실체의 생육특성(Son et al., 2004)과 연구논문(Im et al., 2012)을 참고하여 KNR2312과 A8B10 두 계통을 모본으로 사용하였다. KNR2312는 단핵균사의 자식에 의해서 생산된 계통 중 갓색이 진하고 갓모양이 우수한 계통이 있다는 사실을 바탕으로 선택되었고, A8B10은 대길이가 긴 형질을 보유해서 모본으로 활용하기로 결정하였다.
- 이후 낮은 품질을 개선하기 위하여 KNR2312 유래 단핵균사와 여교배를 실시하여 갓명도가 49.5, 품질이 7.3 수확량이 95.1 g 인 가5나5KNR2312-47KNR2312-12 × 38 계통을 선발하였다.
이론/모형
- 선발된 애린이와 표준균주인 큰느타리3호를 대치배양하여 고유성을 검사하고자 하였다. gDNA 수준에서의 다형화는 URP 프라이머와 RAPD방법을 사용하여 확인하였다. URP2를 이용하여 PCR을 하였을 때 400 bp 사이에서 다형성이 관찰되었다(Fig.
- 단포자의 채취는 Im 등(2012)의 방법에 근거하여 수행하였고, KNR2312에서 100개, A8B10에서 20개의 단핵 균사를 채취하여 교배에 사용하였다. 이후 품질평가를 통하여 새로운 중간모본을 선발하고 앞서와 같은 방식으로 반복하여 수행하였다.
- 배양 및 생육조건은 Ryu 등(2005, 2007)의 방법에 준하여 실시하였으며, 접종방법에 있어 톱밥종균 대신 균사가 만연된 MCM 배지조각 4개를 살균하여 방냉시킨 배지에 직접 접종하여 온도 20°C, 상대습도 65%, CO2 1,500 ppm 이하로 맞춘 배양실에서 35일 배양시켰다.
- 3~3 cm까지 커졌을 때 가장 건실한 1대만을 남기고 나머지는 살균된 칼로 제거하였다. 자실체의 갓이 충분히 개산되기 전에 수확하여 기저부의 균괴를 제거한 후 각 품질평가요소를 Ryu 등(2006)의 방법에 따라 갓색도, 갓직경, 대직경, 무게, 품질, 수확소요일수를 측정하였다. 색도는 색차계(Minolta, Japan)를 사용하여 갓 윗부분을 3번 측정하여 L(명도)값으로 표시하였다.
성능/효과
- gDNA 수준에서의 다형화는 URP 프라이머와 RAPD방법을 사용하여 확인하였다. URP2를 이용하여 PCR을 하였을 때 400 bp 사이에서 다형성이 관찰되었다(Fig. 4). 대치배양을 통한 체세포 불화합성을 측정하였을 경우는 새송이1호와 큰느타리3호와의 대치배양에서 생기는 대치선보다는 약하였지만 분명한 차이를 보였다(Fig.
- 그리고 갓의 두께가 24 mm 이어서 기존품종의 12 mm 보다 더 두꺼웠다. 갓끝의 모양도 기존 품종은 가장 자리로 갈수록 얇아지는데 비해 애린이는 갓 가장자리가 두껍고 안쪽으로 말려 있는 특징을 보였다(Fig. 3). 이 같은 특징은 버섯다듬기와 유통기간 중에 갓끝의 손상을 최소화 할 수 있는 장점으로 보인다.
- 두 품종의 자실체 발생적온과 균사생장최적온도는 동일하였지만, 15, 20, 25, 30°C에서 균사생장속도를 비교하였을 때 애린이는 15°C를 제외하고는 큰느타리3호보다 느린 생장속도를 보였고 특히 30°C에서는 큰느타리3호의 70.8%에 그쳤다(Table 6).
- , 2007), 이 결과는 갓색과 모양이 유전자에 의해서 조절되는 형질이라는 것을 암시한다. 따라서 교배를 통하여 갓 색이 진하고(명도가 낮은) 갓모양이 우수한 품종을 육성할 수 있는 가능성을 보여준다. 이전 연구보고서의 수집된 자실체의 생육특성(Son et al.
- 8%에 그쳤다(Table 6). 자실체의 생육특성을 살펴보면 수확소요일이 애린이가 18.5일, 큰느타리3호가 17.0일로 1.5일 늦었으며, 대길이도 106.3 mm 대 125.0 mm로 18.7 mm의 차이를 보였다(Table 7). 그러나 대의 두께는 애린이가 37.
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