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문제 정의
- 본 연구에서는 식재료 및 약용으로 사용하고 있는 포공영을 이용하여, 그 추출물의 혈청 중금속 함량과 건강지표 농도의 변화에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다.
- 본 연구에서는 포공영의 에탄올 추출물의 중금속 중독에 의한 손상 억제 효과를 측정하였다. 현대 사회에서 환경으로부터 오염이 우려되는 납과 수은을 실험동물에 노출시켰고, 납과 수은에 노출된 흰쥐에서 포공영이 이러한 중금속 노출로 영향을 받는 체중변화, 간 및 신장에 미치는 영향을 혈액 세포분석 및 혈액 내의 생화학적 분자에 대한 조사하였다.
제안 방법
- 4%-EDTA용액으로 처리 후 사용하였다. Red blood cell(RBC), white blood cell(WBC), hemoglobin(Hb) 및 Hematocrit(Hct) 는 자동분석기(Express plus, Chiron, USA)를 이용하여 농도를 분석하였고, lymphocyte는 Turk solution을 이용하여 염색하여 수를 계수하였다(Blaxhall and Daisley, 1973). Bilirubin, Alkaline phosphatase (ALP), glutamic oxaloacetate transaminase(GOT), glutamic pyruvate transaminase(GPT), lactate dehydrogenase(LDH), ceatinine 및 blood urea nitrogen (BUN) 농도는 상업용 kit(Boehringer Mannheim)을 이용하여 enzymatic methods에 의해 측정하였다.
- 포공영은 2011년 대구의 약령시장에서 구입하였다. 건조된 포공영 1 ㎏을 가정용 분쇄기 (한일, HFM 394)로 마쇄하여 분말로 만들어 정제수로 세척 후 3 L의 ethanol을 가하여 90℃의 온도에서 환류조건하에서 12시간 추출을 3회 반복하여 추출 및 감압농축한 후, 동결건조 하여 포공영 추출물 (수득량, 39 g)을 수득하였다. 포공영 시료는 Dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹이고 4℃에 보관하면서 사용하였다.
- , lead acetate, Junsei, Japan) 국내 식품에서 가장 많이 오염이 보고된 중금속으로 보고되어 선정하였다(Lee and Lee, 2001). 두 중금속은 Junsei사의 특급시약을 사용하였고, 최종적으로 수은과 납의 농도는 50 ppm이 되도록 증류수에 혼합하여, 복강으로 17일간 투여하였다. 정상대조군 (NC)은 중금속 대신 saline 1 mL를 투여하였다.
- 납, 수은, 크롬 등과 같은 중금속의 노출은 체중 및 혈액세포에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 간 및 신장 등의 장기에 중독성 손상을 주는 것으로 알려져 있다(Lee and Lee, 2001). 본 실험에서도 납과 수은에 의한 노출 시 동물모델에서 간에서 상당한 손상을 주는 것을 Bilirubin, ALP, GOT, GPT, ceatinine 및 BUN 등의 간 손상에 의한 지표를 확인하여 관찰하였다. 납과 수은의 노출에 대하여 동물은 간 및 신장의 손상으로 인한 지표인자로 LDH을 제외하고 Bilirubin, ALP, GOT, GPT, ceatinine 및 BUN의 수치가 정상범위를 벗어났다.
- 본 연구에 사용된 동물은 127 g±7 g, albino 흰쥐(수컷, 4주령)를 (주)샘타코에서 분양받아 1마리씩 stainless steel cage(항온항습기, 온도 22±2℃, 습도 50±5%)에 넣어 사육하였다. 시험기간은 적응기간 7일, 중금속 투여 기간 17일 및 시료 투여 기간 30일로써 총 54일로 하였다. 적응 기간 중에는 일반고형사료 및 물을 자유로이 공급하였고, 중금속 투여 시부터는 탈이온수와 제조한 기본식이를 섭취시켰다.
- 식이 섭취량은 매일, 체중은 3일 간격으로 일정시간에 측정하였으며, 식이효율은 전체중 증가량을 시료 투여기간(30일) 동안의 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.
- 실험 종료 시점에서 각 군들의 개체로부터 혈액을 채취하여 혈액학적 분석을 실시하였다(Fig. 1). 전혈의 성상 중 적혈구(RBC), 백혈구(WBC) 및 혈소판(Platelet)을 측정한 결과,포공영 투여군의 RBC 및 platelet은 유의적으로 개선효과를 나타내었고, WBC에 있어서는 HC 대비 개선효과가 나타나기는 했으나, 농도 역의존적인 현상은 관찰되었다.
- 포공영 추출물은 동결건조한 후 증류수에 녹여 100 mg/kg, 200 mg/kg 및 500 mg/kg의 농도가 되도록 조제하여 30일간 매일 경구투여 하였다. 실험군은 정상군(normal control, NC), 중금속 투여군(heavymetal control, HC), 포공영 100 mg/kg 투여군(TM 100), 포공영 200 mg/kg 투여군(TM 200) 및 포고영 500 mg/kg 투여군(TM 500)으로 하였다.
- 4% EDTA 용액으로 세척한 다음 탈이온 수로 헹구어 건조시킨 후 사용하였다. 일주일간 적응시킨 흰쥐를 난괴법에 의해 나누어 각 군당 12마리씩으로 하여 분류하였다. 즉 기본사료만 섭취한 정상대조군, 중금속을 투여 받은 중금속 대조군, 중금속 및 포공영을 투여 받은 군으로 하였다(동물윤리위원회 승인번호: 2012-0205).
- 시험기간은 적응기간 7일, 중금속 투여 기간 17일 및 시료 투여 기간 30일로써 총 54일로 하였다. 적응 기간 중에는 일반고형사료 및 물을 자유로이 공급하였고, 중금속 투여 시부터는 탈이온수와 제조한 기본식이를 섭취시켰다. 이때 사용한 물병, 식이그릇 및 cage 등 모든 기구는 중금속의 오염을 방지하기 위해 0.
- 정상대조군 (NC)은 중금속 대신 saline 1 mL를 투여하였다. 중금속 투여에 의한 중독여부는 17일 후에 각 군당 2마리씩 혈액을 취해 납과 수은의 농도가 각각 0.1 mg/dL, 0.2 mg/dL 이상 되는지를 확인하여 이를 중금속에 노출된 것으로 결정하였다. 이 농도는 간과 신장의 염증지표인 GOT의 수치가 정상군의 2배 이상이 되는 것을 기준으로 실험자가 예비시험을 통하여 정하였다.
- 이 농도는 간과 신장의 염증지표인 GOT의 수치가 정상군의 2배 이상이 되는 것을 기준으로 실험자가 예비시험을 통하여 정하였다. 포공영 추출물은 동결건조한 후 증류수에 녹여 100 mg/kg, 200 mg/kg 및 500 mg/kg의 농도가 되도록 조제하여 30일간 매일 경구투여 하였다. 실험군은 정상군(normal control, NC), 중금속 투여군(heavymetal control, HC), 포공영 100 mg/kg 투여군(TM 100), 포공영 200 mg/kg 투여군(TM 200) 및 포고영 500 mg/kg 투여군(TM 500)으로 하였다.
- 본 연구에서는 포공영의 에탄올 추출물의 중금속 중독에 의한 손상 억제 효과를 측정하였다. 현대 사회에서 환경으로부터 오염이 우려되는 납과 수은을 실험동물에 노출시켰고, 납과 수은에 노출된 흰쥐에서 포공영이 이러한 중금속 노출로 영향을 받는 체중변화, 간 및 신장에 미치는 영향을 혈액 세포분석 및 혈액 내의 생화학적 분자에 대한 조사하였다. 실험 결과, 포공영을 투여 받은 실험군은 중금속 투여로 인하여 발생하는 체중감소의 개선효과가 나타났고, 혈액세포의 변화에 있어서도 중금속 노출로 감소되었던 RBC의 수를 증가시켰고, 증가된 WBC 및 platelet의 수를 정상수준으로 회복시켰다.
대상 데이터
- 본 시험에 사용한 수은(HgCl2, Mercuric chloride, Junsei, Japan) 과 납(Pb(CH3COO)2, lead acetate, Junsei, Japan) 국내 식품에서 가장 많이 오염이 보고된 중금속으로 보고되어 선정하였다(Lee and Lee, 2001). 두 중금속은 Junsei사의 특급시약을 사용하였고, 최종적으로 수은과 납의 농도는 50 ppm이 되도록 증류수에 혼합하여, 복강으로 17일간 투여하였다.
- , 2001). 본 실험에서는 NC의 GOT과 GPT 농도는 58.0 U/L 및 52.9 U/L로 정상범위에 위치하였다. 한편 HC군의 농도는 정상범위를 벗어났으나, 포공영을 투여한 군에서는 GOT 및 GPT 농도가 HC군보다는 낮은 수치를 나타내어 개선되는 효과를 보였으며, GOT는 포공영 투여에 의해서 처리군 모두 정상범위로 회복을 시켰으나, GPT의 수치는 포공영 투여에도 불구하고 정상범위로 되돌려 놓지는 못 하였다.
- 본 연구에 사용된 동물은 127 g±7 g, albino 흰쥐(수컷, 4주령)를 (주)샘타코에서 분양받아 1마리씩 stainless steel cage(항온항습기, 온도 22±2℃, 습도 50±5%)에 넣어 사육하였다.
- 실험동물의 혈액을 채취하기 위해 실험종료 12시간 전부터 절식시켰다. 심장으로부터 혈액을 채취하였고, CBC tube에 전혈 3 mL 취하고 나머지는 원심분리(3,000 rpm, 20 min, US-5500CF, Vision, Korea)하여 혈청을 분리한 후-80℃에서 냉동 보관하였다. 이때 사용한 모든 기구와 용기는 중금속 오염을 방지하기 위하여 0.
- 포공영은 2011년 대구의 약령시장에서 구입하였다. 건조된 포공영 1 ㎏을 가정용 분쇄기 (한일, HFM 394)로 마쇄하여 분말로 만들어 정제수로 세척 후 3 L의 ethanol을 가하여 90℃의 온도에서 환류조건하에서 12시간 추출을 3회 반복하여 추출 및 감압농축한 후, 동결건조 하여 포공영 추출물 (수득량, 39 g)을 수득하였다.
데이터처리
- 그룹간의 유의적인 통계차를 분석하기 위하여 p<0.05의 유의수준으로 일원분산분석 (one-way ANOVA)을 실시한 후, Duncan의 다중범위 검정법(Duncan’s multiple range test)을 이용하여 사후검증을 하였다.
- 실험 결과의 통계분석은 SPSS 프로그램(version 20.0.0, Chicago, llinois, USA)을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다. 그룹간의 유의적인 통계차를 분석하기 위하여 p<0.
이론/모형
- Red blood cell(RBC), white blood cell(WBC), hemoglobin(Hb) 및 Hematocrit(Hct) 는 자동분석기(Express plus, Chiron, USA)를 이용하여 농도를 분석하였고, lymphocyte는 Turk solution을 이용하여 염색하여 수를 계수하였다(Blaxhall and Daisley, 1973). Bilirubin, Alkaline phosphatase (ALP), glutamic oxaloacetate transaminase(GOT), glutamic pyruvate transaminase(GPT), lactate dehydrogenase(LDH), ceatinine 및 blood urea nitrogen (BUN) 농도는 상업용 kit(Boehringer Mannheim)을 이용하여 enzymatic methods에 의해 측정하였다. 혈청의 납과 수은 농도는 습식법으로 분해하여 ICP(Labtest Scan 707, Australia)로 측정하였다(Kalamegham and Ash, 1992).
- Bilirubin, Alkaline phosphatase (ALP), glutamic oxaloacetate transaminase(GOT), glutamic pyruvate transaminase(GPT), lactate dehydrogenase(LDH), ceatinine 및 blood urea nitrogen (BUN) 농도는 상업용 kit(Boehringer Mannheim)을 이용하여 enzymatic methods에 의해 측정하였다. 혈청의 납과 수은 농도는 습식법으로 분해하여 ICP(Labtest Scan 707, Australia)로 측정하였다(Kalamegham and Ash, 1992).
성능/효과
- 실험 결과, 포공영을 투여 받은 실험군은 중금속 투여로 인하여 발생하는 체중감소의 개선효과가 나타났고, 혈액세포의 변화에 있어서도 중금속 노출로 감소되었던 RBC의 수를 증가시켰고, 증가된 WBC 및 platelet의 수를 정상수준으로 회복시켰다. 간 및 신장의 손상 지표들로 측정한 Bilirubin, ALP, GOT, GPT, LDH, ceatinine 및 BUN에 있어서도 중금속 노출로 증가된 수치를 농도의존적으로 감소시켰다. 또한 혈액 내에서의 중금속 잔존량을 측정한 결과, 포공영 추출물 투여로 인하여 농도의존적으로 그 잔존량이 감소하였다.
- 본 실험의 궁극적인 목적은 포영영에 의한 체내 축적된 중금속의 잔존량의 감소을 목적으로 하여 혈청 내에서의 중금속의 잔존량을 측정한 결과, 포공영 투여에 의한 중금속 잔존량의 감소가 농도의존적으로 감소함을 관찰하였으나, 기타 체중증가율 및 혈액학적 변화에 비례하여 중금속을 체외로 배출되는지에 대한 추가적인 실험을 시행하지 못하였다. 결론적으로 납과 수은의 노출로 인한 체중감소, 혈청학적 변화 및 장기손상에 대한 개선 정도를 포공영 추출물로 실험한 결과, 유의적인 생화학적 개선효과와 혈청 조사를 통한 중금속 잔존량의 감소효과가 있는 것으로 관찰되었다.
- 본 실험에서도 납과 수은에 의한 노출 시 동물모델에서 간에서 상당한 손상을 주는 것을 Bilirubin, ALP, GOT, GPT, ceatinine 및 BUN 등의 간 손상에 의한 지표를 확인하여 관찰하였다. 납과 수은의 노출에 대하여 동물은 간 및 신장의 손상으로 인한 지표인자로 LDH을 제외하고 Bilirubin, ALP, GOT, GPT, ceatinine 및 BUN의 수치가 정상범위를 벗어났다. 이러한 동물에 포공영의 투여는 유의적으로 감소를 시켰으며 특히 고농도의 포공영(500 mg/kg) 투여군은 정상군과 동일하거나 정상범위 내로 회복시켰다.
- 간 및 신장의 손상 지표들로 측정한 Bilirubin, ALP, GOT, GPT, LDH, ceatinine 및 BUN에 있어서도 중금속 노출로 증가된 수치를 농도의존적으로 감소시켰다. 또한 혈액 내에서의 중금속 잔존량을 측정한 결과, 포공영 추출물 투여로 인하여 농도의존적으로 그 잔존량이 감소하였다. 따라서, 포공영 에탄올 추출물은 체내 노출된 납과 수은에 대한 독성을 완화시켜주는 것으로 사료된다.
- , 2001). 본 실험결과 역시 중금속 투여에 의해 ALP농도가 유의적으로 상승되었고 포공영 투여에 의한 감소하는 경향을 나타내었으나 정상범위로 회복되지는 못 하였다. 즉, HC군은 66.
- 본 실험결과, 납 및 수은의 중금속의 노출은 식이섭취량을 급격히 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 포공영 추출물의 투여는 감소된 식이섭취량에 증가나 중금속 투여에 의해 감소된 식이섭취량을 유지시키지는 못 하였고, 오히려 포공영의 투여농도가 증가됨에 따라서 미약하게 감소되는 경향이 관찰되었다.
- , 1997). 본 실험에서 포공영 투여가 실험 종료 시점까지 전체적으로 체중이 정상군의 수준에는 도달 하지 못 하였으나, 증가중금속 노출에 대하여 고농도의 포공영(500 mg/kg)을 투여 받은 군에서 체중증가량이 정상군과 동일한 수준으로 나타나 포공영 투여로 인해 중금속 피해가 완화되어 나타난 결과라 판단이 되었다. 이러한 체중증가율의 변화는 혈액세포의 변화에 있어서도 동일한 결과를 뒷받침해 주었다.
- 현대 사회에서 환경으로부터 오염이 우려되는 납과 수은을 실험동물에 노출시켰고, 납과 수은에 노출된 흰쥐에서 포공영이 이러한 중금속 노출로 영향을 받는 체중변화, 간 및 신장에 미치는 영향을 혈액 세포분석 및 혈액 내의 생화학적 분자에 대한 조사하였다. 실험 결과, 포공영을 투여 받은 실험군은 중금속 투여로 인하여 발생하는 체중감소의 개선효과가 나타났고, 혈액세포의 변화에 있어서도 중금속 노출로 감소되었던 RBC의 수를 증가시켰고, 증가된 WBC 및 platelet의 수를 정상수준으로 회복시켰다. 간 및 신장의 손상 지표들로 측정한 Bilirubin, ALP, GOT, GPT, LDH, ceatinine 및 BUN에 있어서도 중금속 노출로 증가된 수치를 농도의존적으로 감소시켰다.
- 실험종료 시점에서 포공영을 투여하지 않은 군의 혈청 내의 납과 수은의 잔존량은 각각 0.18±0.02 μg/mL 및 0.42±0.04 μg/mL로 나타났다.
- 1). 전혈의 성상 중 적혈구(RBC), 백혈구(WBC) 및 혈소판(Platelet)을 측정한 결과,포공영 투여군의 RBC 및 platelet은 유의적으로 개선효과를 나타내었고, WBC에 있어서는 HC 대비 개선효과가 나타나기는 했으나, 농도 역의존적인 현상은 관찰되었다. 그러나 포 영공의 투여는 전체적으로 HC군 대비 혈액학적 수치에 있어서 중금속이 투여되지 않은 정상군과 비슷한 수준으로 나타나, 노출된 중금속에 의한 혈액세포의 변화에 영향을 주었다.
- 중금속 투여군은LDH활성이 261.2±12.9 U/L로 증가되었고 포공영 100mg/kg, 200 mg/kg 및 500 mg/kg투여에 의해 236.6±13.7 U/L, 228.9±11.9 U/L 및 206.5±6.7 U/L으로절대적 수치로는 농도의존적인 감소를 나타내었으나, 전 시험군 모두 정상범위 이었다.
- 중금속 투여군의 BUN 및 creatinine농도는 각각 35.1±3.5 mg/dL 및 2.88±0.07 mg/dL로 유의적으로 상승되었고 포공영 투여에 따라 BUN 및 creatinine 수치는 농도의존적으로 감소되어,포공영 100 mg/kg, 200 mg/kg 및 500 mg/kg에서 BUN은 각각 21.8±6.4 mg/dL, 18.9±5.1 mg/dL 및 15.8±3.8 mg/dL이었고, creatinine은 각각 2.01±0.06 mg/dL, 1.81±0.11 mg/dL 및 1.27±0.09 mg/dL로 나타났으며, 이들 지표는 특히 500 mg/kg의 고농도에서만 정상범위로 회복이 되었다.
- 그러나 HC군과 중금속 및 포공영 추출물을 투여한 군들 간에는 체중증가의 경향성은 관찰하였으나, 유의적인 체중증가로는 판단할 수는 없었다. 중금속을 투여받은 네 군의 사료 섭취량은 NC군에 비해 유의적으로 낮은 것으로 나타났다. 체중증가와 식이섭취량에 의한 식이효율(FER)에 있어서 HC군과 포공영을 투여군들 간에 유의적인 차이가 나타났다.
- 중금속 및 포공영 추출물 투여 시, 동물에서의 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율은 Table 2와 같다. 중금속을 투여하지 않은 NC군의 체중증가량은 중금속투여군보다 유의적으로 높아 HC, TM 100, TM 200 및 TM 500군들과 유의적인 차이를 나타내었다. 그러나 HC군과 중금속 및 포공영 추출물을 투여한 군들 간에는 체중증가의 경향성은 관찰하였으나, 유의적인 체중증가로는 판단할 수는 없었다.
- 체중증가와 식이섭취량에 의한 식이효율(FER)에 있어서 HC군과 포공영을 투여군들 간에 유의적인 차이가 나타났다. 즉, NC와 포공영 추출물 500 mg/kg을 투여한 TM 500군의 FER은 서로 비슷한 수준이었고, 나머지 두 농도의 군 모두 HC 대비 개선효과를 나타내었으며, 개선 정도는 농도의존적으로 증가하였다.
- 중금속을 투여받은 네 군의 사료 섭취량은 NC군에 비해 유의적으로 낮은 것으로 나타났다. 체중증가와 식이섭취량에 의한 식이효율(FER)에 있어서 HC군과 포공영을 투여군들 간에 유의적인 차이가 나타났다. 즉, NC와 포공영 추출물 500 mg/kg을 투여한 TM 500군의 FER은 서로 비슷한 수준이었고, 나머지 두 농도의 군 모두 HC 대비 개선효과를 나타내었으며, 개선 정도는 농도의존적으로 증가하였다.
- 03 mg/dL로 정상범위에 벗어났다. 포공영 투여군의 bilirubin의 농도는 농도의존적으로 개선이 되어 포공영 500 mg/kg의 투여군은 그 농도가 유의적으로 감소되어 정상범로 개선 효과를 나타내었다. 정상군의 혈청 중 GOT와 GPT 활성도는 각각 39-111 U/L, 20-61 U/L이다.
- 9 U/L로 정상범위에 위치하였다. 한편 HC군의 농도는 정상범위를 벗어났으나, 포공영을 투여한 군에서는 GOT 및 GPT 농도가 HC군보다는 낮은 수치를 나타내어 개선되는 효과를 보였으며, GOT는 포공영 투여에 의해서 처리군 모두 정상범위로 회복을 시켰으나, GPT의 수치는 포공영 투여에도 불구하고 정상범위로 되돌려 놓지는 못 하였다. ALP의 경우, 정상흰쥐의 농도는 14-48 U/L이며 이 지표는 간기능부전, 골질환, 황달 등에서 병적으로 상승되고 독물중독이나 만성신장염에서 저하되는 것으로 알려져 있다(Kim et al.
후속연구
- 그러나 포공영의 중금속 해독과 관련한 연구는 보고되어 있지 않은 실정이어서 본 실험결과는 기존의 포공영이 가지고 있는 생리활성이외에 추가적인 활성을 밝힌데 이의가 있다고 할 수 있겠으며, 그 작용 기전은 현재까지 보고된 식물로 부터의 중금속 노출에 의한 독성 감소 효과가 항산화와 밀접한 관련이 있는 것으로 보아 그와 유사한 기전으로 추정이 되나, 이에 대한 추가적인 연구가 필요한 실정이다.
- 이러한 혈청 내의 생화적분자의 변화 역시 체중증가율의 결과를 뒷받침해 주는 결과를 얻어내었다. 본 실험의 궁극적인 목적은 포영영에 의한 체내 축적된 중금속의 잔존량의 감소을 목적으로 하여 혈청 내에서의 중금속의 잔존량을 측정한 결과, 포공영 투여에 의한 중금속 잔존량의 감소가 농도의존적으로 감소함을 관찰하였으나, 기타 체중증가율 및 혈액학적 변화에 비례하여 중금속을 체외로 배출되는지에 대한 추가적인 실험을 시행하지 못하였다. 결론적으로 납과 수은의 노출로 인한 체중감소, 혈청학적 변화 및 장기손상에 대한 개선 정도를 포공영 추출물로 실험한 결과, 유의적인 생화학적 개선효과와 혈청 조사를 통한 중금속 잔존량의 감소효과가 있는 것으로 관찰되었다.
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