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문제 정의
- 1,4,5 우리나라는 수질에 대해서 먹는 물과 하천수 등 다양한 용도별 수질 기준을 가지고 있으며 이를 시험하는 분석법으로 먹는 물 공정 시험법과 수질 오염 공정 시험법을 이용하고 있다. 먹는 물 공정 시험 기준과 수질 오염 공정 시험기준에서 농약류에 대한 추출 방법은 액체-액체 추출법(Liquid-Liquid Extraction, LLE)으로 되어 있으나 LLE 추출법은 여러 가지 단점들이 있어서 본 논문에서는 먹는 물 공정 시험법과 수질 오염 공정 시험법에서 관리하고 있는 농약류에 대해 기존 추출 방법의 단점을 보완할 수 있는 다른 추출 방법을 시도해 보았다.
- 본 논문에서는 속빈 섬유 미량 추출법(HF-LPME)를 이용하여 먹는물수질공정시험법과 수질오염공정시험법에서 관리하고 있는 농약에 대한 동시분석법을 확립하였다. LPME를 이용한 기존 농약 분석에서는 유기인계 농약과 카바메이트계 농약을 각각 따로 분석하였지만 본 연구에서는 동시 분석하여 추출율을 알아보았다.
가설 설정
- 둘째, 염이 첨가됨에 따라 용액의 이온 세기가 증가 되어 수용액에서의 분석 물질의 용해도가 감소됨에 따라 유기상으로의 분배가 증가된다. 셋째, 염을 첨가하면 상비(phase ratio)에 영향을 미친다. 이와 같은 영향에 따라서 첫 번째와 세 번째 효과는 추출효율을 감소시키는 요인이 되며, 두 번째 요인은 추출효율을 증가시키는 요인이 된다.
제안 방법
- 3.1에서 확립된 추출 조건으로 추출하고 GC/ MS에 주입하여 표준물 검정곡선을 작성하였다. 표준 용액을 증류수 5 mL에 5 µg/L, 10 µg/L, 20 µg/L, 50 µg/L가되도록 조제하였고, 내부표준물질(ISTD)은 phenanthrene-d10를 사용하여, 농도가 40 µg/L가 되도록 조제하여 작성 하였다.
- 본 논문에서는 속빈 섬유 미량 추출법(HF-LPME)를 이용하여 먹는물수질공정시험법과 수질오염공정시험법에서 관리하고 있는 농약에 대한 동시분석법을 확립하였다. LPME를 이용한 기존 농약 분석에서는 유기인계 농약과 카바메이트계 농약을 각각 따로 분석하였지만 본 연구에서는 동시 분석하여 추출율을 알아보았다. 동시분석법 확립 시 조절하였던 실험인자들은 추출용매, 교반효과, 염석효과, 추출시간, pH 였고 실험 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- 농약 분석을 위한 기체 크로마토그래프/질량분석기(GC/ MS)는 Agilent 사의 6890N/5973N(Palo Alto, CA, USA)을 사용하였다. 모세관 컬럼은 Agilent 사의 DB-5(Methyl 5% phenyl polysiloxane)로 길이는 30 m, 안지름 0.
- 3에 나타내었다. 농축배수(enrichment factor)는 실험농도를 표준물질 농도로 나누어 계산하였다.
- 속빈 섬유가 추출 용매로 가득 차게 되면 시료 5 mL이 담긴 vial에 호일로 vial 윗부분을 막고 속빈 섬유만 통과할 수 있게 구멍 뚫어 놓는다. 다음 단계로 구멍 사이로 추출 용매가 채워진 속빈 섬유를 끼워 넣고 속빈 섬유가 시료에 충분히 담겨질 수 있도록 높이를 조절한 후 시료와 추출용매 간의 분배 평형을 위해 자석 막대를 이용하여 시료를 교반하였다. 자석 막대는 테프론으로 피복된 소형 자석 막대를 사용하였다.
- LPME를 이용한 기존 농약 분석에서는 유기인계 농약과 카바메이트계 농약을 각각 따로 분석하였지만 본 연구에서는 동시 분석하여 추출율을 알아보았다. 동시분석법 확립 시 조절하였던 실험인자들은 추출용매, 교반효과, 염석효과, 추출시간, pH 였고 실험 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
- 따라서 본 논문에서는 분석 물질의 농도가 200 µg/L인 시료 5 mL에 대하여 속빈 섬유를 이용하여 다음과 같이 각 조건을 변화시키면서 실험하였다.
- 본 논문에서는 먹는 물 공정 시험법과 수질 오염 공정 시험법에서 관리하는 농약 항목에 대해 동시 분석할 수 있는 방법에 초점을 맞추었고, 추출방법으로는 속빈 섬유 (Hollow-Fiber, HF)를 이용한 막대형 LPME를 사용하였다. 이를 위해서 농약의 추출효율을 높이는 데 영향을 미치는 여러 인자인 추출용매의 종류, 교반 속도, 염석효과, 추출시간, pH를 변화시키면서 분석을 위한 최적 추출 조건들을 체계적으로 확립하였다.
- 본 실험에서는 막대형 미량 추출방법을 사용하였는데 속빈 섬유를 3 cm 정도 자른 후 속빈 섬유 속에 남아 있을 유기물질의 제거를 위하여 HPLC급 아세톤에 담가서 초음파세척기를 이용하여 10분간 세척 후 건조시킨다. 건조 후 한쪽 끝을 약 300℃ 정도로 설정된 가열판을 이용하여 봉합시킨 후 2.
- 분석 대상 농약들에 효과적인 추출 효과를 알아보기 위해 각각의 실험 인자들(추출 용매, 교반 효과, 염석 효과, 추출 시간, pH)에 대해서 조건들을 변경시킴으로써 농약에 대한 최적의 추출 조건을 확립하는 실험을 실시하였다.
- 속빈 섬유를 이용한 액체상 미량 추출법 최적화를 위해 실험 인자들로 추출 유기 용매의 종류, 분석물과 추출 용매의 추출 시간, 추출 시 교반속도, 시료 용액의 pH 변화, 염석효과를 설정하였고, 각각의 인자들에 대해 조건을 최적화하고자 하였다.
- 시료를 5 µg/L 농도가 되게 만들고 7 번 반복 측정하여 평균, 표준 편차, 검출 한계와 정량 한계, 및 정확도, 정밀도를 구하였다.
- 분석할 수용액시료의 이온 세기를 조절하는 것은 일반적으로 실험 조절 인자 중 하나이다. 실험온도는 실온, 교반속도 1200 rpm, pH 5, 추출시간은 5분, 추출용매는 toluene으로 고정한 상태에서 염화소듐의 농도가 5%, 10%, 15%, 20%, 25%가 되도록 염화소듐을 첨가하여 추출률에 대한 영향을 확인하였다.
- 하지만 추출 시간이 너무 길어지면 속빈 섬유 내부의 추출 용매의 손실이 커지기 때문에 적절한 추출 시간을 선정하여 추출 용매의 손실을 최소화 하여 추출 률을 증가시키는 것이 중요하다. 실험온도는 실온, 염화소듐 15%, 교반속도 1200 rpm, pH 5, 추출용매는 toluene 으로 고정한 상태에서 추출 시간은 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min이 되도록 하여 추출률에 대한 영향을 확인하였다.
- 이와 같이 모든 실험 시 pH는 추출에 있어 중요한 인자인 것이다. 실험온도는 실온, 염화소듐 15%, 교반속도 1200 rpm, 추출시간은 15분, 추출용매는 toluene으로 고정한 상태에서 pH는 2, 5, 8, 11 이 되도록 하여 추출률에 대한 영향을 확인하였다.
- 실험온도는 실온, 염화소듐 5%, pH 5, 추출 시간은 5분, 추출용매는 toluene 으로 고정한 상태에서 자석 막대의 교반 속도에 따른 추출 효과를 알아보기 위해 교반 속도를 300 rpm, 600 rpm, 900 rpm, 1200 rpm, 1500 rpm으로 변경하여 교반 효과 선정 실험을 진행하였다.
- 본 논문에서는 먹는 물 공정 시험법과 수질 오염 공정 시험법에서 관리하는 농약 항목에 대해 동시 분석할 수 있는 방법에 초점을 맞추었고, 추출방법으로는 속빈 섬유 (Hollow-Fiber, HF)를 이용한 막대형 LPME를 사용하였다. 이를 위해서 농약의 추출효율을 높이는 데 영향을 미치는 여러 인자인 추출용매의 종류, 교반 속도, 염석효과, 추출시간, pH를 변화시키면서 분석을 위한 최적 추출 조건들을 체계적으로 확립하였다.
- 자석 막대는 테프론으로 피복된 소형 자석 막대를 사용하였다. 정해진 추출 시간이 되면 미량 실린지를 속빈 섬유에 삽입하여 추출 용매를 채취한 뒤 GC/MS에 바로 주입하여 분석하였다.
- 최적의 추출 용매를 선정하기 위해서 물에 대한 용해도가 작고 극성이 작은 것부터 큰 것까지 여러 가지 용매를 사용하여 추출 효과를 비교하였다. 사용된 추출 용매는 toluene, chloroform, ethyl acetate, hexane, dichloromethane, 1-octanol이었으며 각 추출용매의 특성은 Table 3과 같다.
- 5 cm 길이로 절단하여 사용하였다. 추출 시에는 추출 용매로 toluene, chloroform, ethyl acetate, hexane, dichloromethane, 1-octanol을 사용하여 추출효율을 비교하였다.
- 표준 용액을 증류수 5 mL에 5 µg/L, 10 µg/L, 20 µg/L, 50 µg/L가되도록 조제하였고, 내부표준물질(ISTD)은 phenanthrene-d10를 사용하여, 농도가 40 µg/L가 되도록 조제하여 작성 하였다.
- 확립한 최적 추출 조건으로 시료를 추출한 후 GC/MSD를 이용하여 분석하는 방법의 검출 한계(Limits of detection, LOD)와 정량 한계(Limits of Quantification, LOQ)를 조사하였다. 시료를 5 µg/L 농도가 되게 만들고 7 번 반복 측정하여 평균, 표준 편차, 검출 한계와 정량 한계, 및 정확도, 정밀도를 구하였다.
대상 데이터
- Toluene, chloroform, ethyl acetate, dichloromethane, hexane와 같은 추출 용매는 HPLC급(J.T Baker, USA)를 사용하고, 1-octanol은 JUNSEI(ASSAY(GC) min. 98%)를 사용하였다. pH 조절을 하기 위해서는 인산(JUNSEI ASSAY min.
- Toluene과 1-octanol의 추출률을 비교한 결과 1- octanol에 비해 toluene이 추출률이 높다는 것을 알 수 있었고 농약 추출을 위한 유기 용매는 극성도가 상대적으로 낮으며, 물에 대한 용해도가 낮은[Table 3] toluene으로 선정하였다.
- 98%)를 사용하였다. pH 조절을 하기 위해서는 인산(JUNSEI ASSAY min. 85% (m/m))과 수산화나트륨(KANTO 순도 97%)을 희석하여 사용하였고 염석효과를 위해서는 염화나트륨(JUNSEI ASSAY min. 99.5%(m/m))을 사용하였으며, 증류수는 증류수 제조장치(Millipore Elix 15형)를 이용하여 직접 제조하여 실험에 사용하였다.
- 컬럼의 온도와 시료 주입기 및 검출기의 온도는 Table 1에 요약하였다. 대상 농약을 정성, 정량 분석하기 위해 각 물질마다 2개 또는 3개의 특징적인 이온(Characteristic ion)을 선택하였는데 carbaryl은 m/z 144, 115, diazinon은 m/z 179, 137, 304, methyl parathion은 m/z 263, 109, 125, fenitrothion은 m/z 277, 125, 109, 260, parathion은 m/z 291, 109, 97, 125, phenthoate는 274, 125, 246, 93, EPN은 157, 169를 선택하였다[Table 2].
- 모세관 컬럼은 Agilent 사의 DB-5(Methyl 5% phenyl polysiloxane)로 길이는 30 m, 안지름 0.250 mm, 정지상 두께 0.25 µm인 것을 사용하였고 운반 기체로는 헬륨(He)을 사용하였다.
- 분석 대상 농약은 carbaryl, diazinon, methyl parathion, fenitrothion, parathion, phenthoate, ENP 등 7종이며 Supelco사 (USA)의 혼합용액(200 µg/mL in hexane : toluene(1:1))을 표준물질로 사용하였다.
- 최적의 추출 용매를 선정하기 위해서 물에 대한 용해도가 작고 극성이 작은 것부터 큰 것까지 여러 가지 용매를 사용하여 추출 효과를 비교하였다. 사용된 추출 용매는 toluene, chloroform, ethyl acetate, hexane, dichloromethane, 1-octanol이었으며 각 추출용매의 특성은 Table 3과 같다.
- 속빈 섬유는 polypropylene 재질로써 안지름은 600 µm, 막 두께는 200 µm(Accurel Q3/2, Wuppertal, Germany)를 사용하였고, 추출 후에 시료를 채집하는 미세 주사기는 GC용 10 µL(Agilent, Australia)를 사용하였다.
- 속빈 섬유와 연결했던 pipette tip은 0.5~10 µL(Axygen, USA)를 사용하였고, 추출 시 시료를 담았던 vial은 Amber Vial Screw Top 7 mL(SUPELCO, USA) 제품을 사용하였으며, 자석 막대는 테프론 재질(Belart, 10 mm×6 mm, USA)을 사용하였다.
- 다음 단계로 구멍 사이로 추출 용매가 채워진 속빈 섬유를 끼워 넣고 속빈 섬유가 시료에 충분히 담겨질 수 있도록 높이를 조절한 후 시료와 추출용매 간의 분배 평형을 위해 자석 막대를 이용하여 시료를 교반하였다. 자석 막대는 테프론으로 피복된 소형 자석 막대를 사용하였다. 정해진 추출 시간이 되면 미량 실린지를 속빈 섬유에 삽입하여 추출 용매를 채취한 뒤 GC/MS에 바로 주입하여 분석하였다.
데이터처리
- 정밀도 및 정확도의 측정을 위해서5 µg/L 농도에서 시료 마다 3회씩 실시하였으며, 정밀도는 상대표준편차(RSD)로 나타내었고, 정확도는 실험값의 평균을 참값으로 나눈후 곱하기 100을 하여 구하였다.
성능/효과
- 1) 7종 농약(유기인계 농약 diazinon, methyl parathion, fenitrothion, parathion, phenthoate, EPN과 카바메이트계 농약 carbaryl)의 pKa 값은 다르지만 pH와 NaCl 농도를 조절하여 실험한 결과 7종 농약에 대한 동시 분석시 최적 pH 조건은 5.0이었으며, NaCl에 의한 염석효과는 15%일 때 최적의 추출률을 나타내었다. 추출 시 교반효과의 영향을 보기 위해서 교반 속도변화에서는 1200 rpm에서, 추출 시간과 관련해서는 15분에서 가장 좋은 추출률을 나타났다.
- 이러한 영향으로 인해 HF-LPME 장치를 이용한 시료 전처리에서는 염석효과가 추출 효율을 증가시킬 수도 있고 감소시킬 수도 있다.18 본 실험에서는 염석효과 (salting out effect)는 화합물에 따라 최적조건이 다르게 나타났으나 7종류의 동시분석 조건으로 15%가 가장 적합 하였다. 염석효과에 따른 추출량을 Fig.
- 2) 유기인계 농약 diazinon, methyl parathion, fenitrothion, parathion, phenthoate, EPN과 카바메이트계 농약 Carbaryl 에 대하여 HF-LPME로 동시 분석한 결과 toluene에서 유기인계 농약과 카바메이트 농약 모두 88%이상의 좋은 정확도를 나타내었다. 농약 시료를 5~50 µg/L의 범위의 농도로 spike한 후 확립한 방법으로 검정곡선을 작성한 결과 7 가지 농약 모두 회귀 계수(Coefficient of Regression, R2)는 0.
- 3) 먹는물공정시험법과 수질오염공정시험법에서는 정량한계와 유효측정농도가 0.5 µg/L이지만, 농약들의 관리 기준(diazinon : 20 µg/L, parathion : 0.06 mg/L, fenitrothion :0.04 mg/L, carbaryl - 0.07 mg/L)은 본 논문에서 확립한 분석법의 정량한계 보다는 높으며, HF-LPME 방법은 시료 분석 시 샘플과 유기 용매가 다량으로 소모되는 반면 본 논문에서 확립한 HF-LPME 추출법은 시료와 유기용매 사용량을 현저히 줄일 수 있을 뿐만 아니라 규제농도 이하까지 측정이 가능하며 추출 소요시간을 획기적으로 단축시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 검출한계(LOD)는 0.37~1.23 µg/L, 정량한계(LOQ)는 1.19~3.91 µg/L, 정확도(Accuracy)는 88.1~111.3%, 정밀도(Precision)는 2.14~7.82 RSD%의 결과를 얻을 수 있었다.
- 그 결과 검출 한계(LOD)는 carbaryl 0.53 µg/L, diazinon 0.40 µg/L, methyl parathion 0.39 µg/L, fenitrothion 0.37 µg/L, parathion 0.55 µg/L, phenthoate 1.17 µg/L, EPN 1.23 µg/L를 나타내었었다.
- 표준 용액을 증류수 5 mL에 5 µg/L, 10 µg/L, 20 µg/L, 50 µg/L가되도록 조제하였고, 내부표준물질(ISTD)은 phenanthrene-d10를 사용하여, 농도가 40 µg/L가 되도록 조제하여 작성 하였다. 그 결과 직선성은 7 가지의 농약 모두 회귀 계수 (Coefficient of Regression, R2)는 0.995 이상으로 좋은 직선 성을 나타내었다. 표준물과 검정곡선 선정 시 HF-LPME 의 조건은 Table 4와 같다.
- 농약 시료를 5~50 µg/L의 범위의 농도로 spike한 후 확립한 방법으로 검정곡선을 작성한 결과 7 가지 농약 모두 회귀 계수(Coefficient of Regression, R2)는 0.995 이상으로 좋은 직선성을 나타내었다.
- 첫째, 물에서 NaCl의 용해는 Nernst 확산 필름의 물리적 성질을 변화시켜서 분석물질이 추출용매로 확산되어 가는 속도가 감소된다. 둘째, 염이 첨가됨에 따라 용액의 이온 세기가 증가 되어 수용액에서의 분석 물질의 용해도가 감소됨에 따라 유기상으로의 분배가 증가된다. 셋째, 염을 첨가하면 상비(phase ratio)에 영향을 미친다.
- 두 상(two phase)을 이용한 LPME에서 중성물질은 유기 용매에 용해가 잘 되고, 하전된 물질은 수용액에 용해가 잘 되기 때문에 pH는 분석물질이 이온상태가 아닌 중성 상태로 pH를 조절해야 한다. 분석 물질인 carbaryl은 pKa 2.36, diazinon은 pKa 2.6, methyl parathion은 pKa 7.08, fenitrothion은 pKa 3.07, parathion 은 pKa 7.15, phenthoate은 pKa 4.7, EPN은 pKa 3.85으로 물질마다 최적 추출효율을 나타내는 pH 조건에는 차이가 있었으나 pH 5 일 때 농약들의 동시 분석 시 최고 높은 추출률을 나타내었다. pH에 따른 추출량을 Fig.
- 분석대상 농약에 대한 실험 결과 모든 물질이 pH 5에서 대체적으로 높은 추출률을 보였다. 두 상(two phase)을 이용한 LPME에서 중성물질은 유기 용매에 용해가 잘 되고, 하전된 물질은 수용액에 용해가 잘 되기 때문에 pH는 분석물질이 이온상태가 아닌 중성 상태로 pH를 조절해야 한다.
- 실험결과 추출시간 15분에서 추출효율이 가장 좋은 것으로 나타났다. 이는 수용액에 있는 분석 물질이 추출 용매로 추출되는 추출량과 추출 시간이 증가함에 따라 속빈 섬유(HF) 안에 추출 용매의 손실을 줄이는 가장 최적의 시간이라고 할 수 있다.
- 실험온도는 25 ℃, 염화소듐 5%, 교반속도 1200 rpm, pH 5, 추출시간은 5분으로 고정한 상태에서 추출용매를 변화해가며 HF-LPME로 분석한 결과 toluene이 가장 좋은 추출효과를 보였다. 속빈 섬유(HF)에 용매를 채우는 과정에서 toluene 외에 다른 유기 용매들은 속빈 섬유(HF) 안에 용매의 고정 여부를 확인하기 어려웠다.
- 자석 막대의 교반 속도에 따른 추출 효과를 보면 1200 rpm일 때가 추출 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 또한 1500 rpm이 되었을 때는 추출률이 떨어지기 시작했다.
- 2%를 나타내었다. 정밀도는 carbaryl RSD 3.58%, diazinon RSD 2.92%, methyl parathion RSD 2.50%, fenitrothion RSD 2.14%, parathion RSD 3.38%, phenthoate RSD 7.50%, EPN RSD 7.82%를 나타내었다[Table 6].
- 정확도는 carbaryl 95.1%, diazinon 88.1%, methyl parathion 99.7%, fenitrothion 111.3%, parathion 104.4%, phenthoate 99.8%, EPN 100.2%를 나타내었다. 정밀도는 carbaryl RSD 3.
- 일반적으로 HF-LPME 장치를 이용한 시료 추출에서 이온들에 의한 영향(염석효과)은 다음과 같다. 첫째, 물에서 NaCl의 용해는 Nernst 확산 필름의 물리적 성질을 변화시켜서 분석물질이 추출용매로 확산되어 가는 속도가 감소된다. 둘째, 염이 첨가됨에 따라 용액의 이온 세기가 증가 되어 수용액에서의 분석 물질의 용해도가 감소됨에 따라 유기상으로의 분배가 증가된다.
- 0이었으며, NaCl에 의한 염석효과는 15%일 때 최적의 추출률을 나타내었다. 추출 시 교반효과의 영향을 보기 위해서 교반 속도변화에서는 1200 rpm에서, 추출 시간과 관련해서는 15분에서 가장 좋은 추출률을 나타났다.
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