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문제 정의
- 본 연구에서는 인간유래 융합세포주 개발을 염두에 두고 HEK293과 Namalwa 세포의 배양 특성을 확인 및 비교하고자 하였다. 전체 배양 공정에 대한 특성을 파악하기 위해 세포유지, 배지개발, 배양조건 확립, 대량배양으로 분류하여 단계별로 핵심이 되는 세부 특성을 규명하고자 mixture design 과 Box-Behnken design과 같은 실험계획법을 적용하였다.
- 이러한 현상은 영양분 고갈에 의한 사멸이 아니라 외부 스트레스에 의한 세포 괴사가 유도된 것으로 파악되며, 상대적으로 낮은 산소소비 속도를 확인하였다. 이러한 특성으로 미루어 볼 때 용존산소량 조절보다는 전단 응력에 의한 영향이 클 것으로 추측되며, 교반 속도를 낮춰 전단응력의 간접적인 영향을 확인해 보았다. 그 결과 40 rpm 에서 생존도가 정상 수준으로 회복되었고 어느 정도 개선된 세포 증식을 보였지만, 여전히 flask 배양 수준에는 미치지 못하였다.
제안 방법
- Flask나 bioreactor에서 매일 700 μL씩 시료를 채취하여 Bioprofile 400 (Nova Biomedical, USA)으로 glutamine, glutamate, glucose, lactate, ammonia의 농도 (c)를 분석하였다.
- 이렇게 서로 상반된 특성들은 융합세포주의 선별 방향을 제시하거나 기대하지 못했던 새로운 특성을 예측해 볼 수 있다. HEK293 세포는 glutamine가 없는 조건에서 증식이 가능할 뿐만 아니라 오히려 glucose를 적게 소모하면서도 효율적인 대사를 수행하였으며 (Fig. 3(d), (h)), 배양 5일째 3.
- 각각의 세포주는 CD293과 RPMI 1640 (Invitrogen, USA) 배지 25 mL에 0.5 × 106 cells/mL 농도로 접종하여 125-mL Erlenmeyer flask 에서 배양하였으며, 100 rpm, 37℃, 5% CO2 조건을 유지하였다.
- 5 프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다. 경향성 확인이 목적이기 때문에 전통적인 방법을 변형시켜 혼합 비율과 적정 농도를 한 번에 확인할 수 있도록각 조건을 none, soy peptone, yeast extract로 정하고 6 g/L 기준으로 수행하였다.
- 5 × 106 cells/mL 농도로 접종하여 125-mL Erlenmeyer flask 에서 배양하였으며, 100 rpm, 37℃, 5% CO2 조건을 유지하였다. 계대 배양은 3~4일 간격으로 수행하였다. 실험에 사용된 기본배지로는 CD293 배지에 6 mM L-glutamine을 첨가하였다.
- 이는 두 세포주가 모두 안정성을 유지할 수 있고 조성 확인과 조절이 용이한 배지이다. 계대배양을 통해 두 세포주가 안정함을 확인한 후 cell bank를 구축하였으며, 모든 실험에는 세포 해동 후 3~7 passage 범위에 해당하는 세포를 사용하였다.
- 다양한 배양조건 변수들 중 세포 증식에 영향을 줄 수 있는 온도, pH, 삼투압을 선택하였다. 온도는 humidified CO2 incubator (Sanyo Electric Co.
- 두 세포주의 특성 규명에 앞서 기본배지를 한 종류로 정할 필요가 있었으며, 이를 선정하기 위해 두 세포주 각각에 대한 기본배지를 우선적으로 확인하였다. 그 결과 Namalwa 세포주의 기본배지인 RPMI 1640 배지에서는 HEK293 세포가 심한 응집 현상을 보였으며, anti-clumping agent를 처리해 보았으나 문제를 해결 할 수 없었다 (Fig.
- 6 ×106 cells/mL의 최대세포농도에 도달하였다. 또한 glutamine 농도의 차이보다는 유무에 의한 차이가 더 명확한데 대사경로 자체가 변경되어 이러한 결과를 보인다고 판단할 수 있으며 극단적인 조건은 단백질 생산에 적합하지 못할 수 있기 때문에 추후 실험에서는 4 mM glutamine으로 낮춰 적용하기로 하였다. Namalwa 세포는 glutamine 농도에 경향성 있는 증식 및 대사를 보여주는데 이 역시 극단적인 조건은 피하고자 6 mM glutamine 조건으로 유지시켰다.
- 온도, pH, 삼투압에 대한 영향을 좀 더 명확히 분석하기 위하여 비증식속도 (μ), 최대세포농도 (MAX), 누적 생존 세포농도 (IVCD)로 자료를 정리하였다. 또한 대사량 계산에 직접적으로 적용되고 환경에 의한 세포의 변화를 가장 잘 반영하는 IVCD 기준으로 각 조건간 상호작용을 확인하였다 (Table 3, 4).
- 또한 가수분 해물 첨가에 의한 세포 증식의 증진을 기대할 수 있으며, 배양 환경 변화나 bioreactor 배양에서는 아직 밝혀지지 않은 리스크를 예측해 볼 수 있었다. 본 연구의 결과는 융합세포주와의 직접적인 비교에 의한 결과가 아니기 때문에 최적화나 정확한 수치에 대한 정보의 의미 보다는 두 세포주의 특정 조건에 따른 특성 규명에 초점을 두었다. 향후 융합 인간세포주의 명확한 특성을 파악하고, 그 유래를 통한 간접적인 접근이 가능하게 되었다는 점에서 그 의미를 갖는다고 하겠다.
- 3을 설정 범위로 정하였다. 삼투압의 경우 낮출 수 있는 방법이 없기 때문에 범위를 0, 50, 100 mOsm/kg씩 증가시켰다.
- 샘플은 trypan blue (Life Technology, USA) dye exclusion method를 적용해 염색하고 hemocytometer를 사용하여 세포수와 세포 생존도를 확인하였다.
- 세포 증식 분석은 기본적으로 최대 세포농도와 도달 시점, 지수성장기의 비증식속도 (μ), 누적 생존세포농도 (integral viable cell density, IVCD)를 아래 수식에 적용하여 계산하였다.
- 5 × 106 cells/mL 이었으며, 온도는 37℃, 4-bladed marine impeller를 이용한 교반속도는 100 rpm, 용존산소 농도는 40% 이상으로 유지하였다. 시료 채취는 특수 제작된 sampling device를 사용하여 하루 1회 수행하였다.
- 온도, pH, 삼투압에 대한 영향을 좀 더 명확히 분석하기 위하여 비증식속도 (μ), 최대세포농도 (MAX), 누적 생존 세포농도 (IVCD)로 자료를 정리하였다.
- 다양한 배양조건 변수들 중 세포 증식에 영향을 줄 수 있는 온도, pH, 삼투압을 선택하였다. 온도는 humidified CO2 incubator (Sanyo Electric Co., Japan)의 온도 조절 기능을 통해 조절하였고, 삼투압은 Vapro vapor pressure 5600 (Wescor Inc, USA)으로 측정하고 5 M NaCl을 이용하여 조절하였다. 또한 pH는 pH meter (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 측정하고 1 N HCl 및 1 N NaOH를 이용하여 조절하였다.
- 전체 배양 공정에 대한 특성을 파악하기 위해 세포유지, 배지개발, 배양조건 확립, 대량배양으로 분류하여 단계별로 핵심이 되는 세부 특성을 규명하고자 mixture design 과 Box-Behnken design과 같은 실험계획법을 적용하였다. 이를 통해 세포의 주요 에너지원과 부산물의 축적, hydrolysate, 그리고 배양 환경 등이 비증식속도, 최대세포농도, 누적 생존세포농도 등 세포 증식과 관련된 인자들에 미치는 영향을 확인하였다.
- 본 연구에서는 인간유래 융합세포주 개발을 염두에 두고 HEK293과 Namalwa 세포의 배양 특성을 확인 및 비교하고자 하였다. 전체 배양 공정에 대한 특성을 파악하기 위해 세포유지, 배지개발, 배양조건 확립, 대량배양으로 분류하여 단계별로 핵심이 되는 세부 특성을 규명하고자 mixture design 과 Box-Behnken design과 같은 실험계획법을 적용하였다. 이를 통해 세포의 주요 에너지원과 부산물의 축적, hydrolysate, 그리고 배양 환경 등이 비증식속도, 최대세포농도, 누적 생존세포농도 등 세포 증식과 관련된 인자들에 미치는 영향을 확인하였다.
- 세 가지 기본적인 배양조건에 대한 영향을 확인하였지만 대량배양에 있어서 여러 가지 변수들이 추가로 발생한다. 조건 측정 및 유지 문제뿐만 아니라 용존 산소량이나 전단응력의 변화와 같이 flask 배양 수준에서 확인하기 어려운 조건들이 존재하기 때문에 실험실 규모 bioreactor 배양에서의 세포 특성을 확인하였다. 그 결과 HEK293 세포와 Namalwa 세포 모두 세 가지 배양 조건이 안정 범위에 있었음에도 flask에 비해 증식이 저해되었다.
대상 데이터
- 가수분해물은 soy 유래 BBL Phytone Peptone (BD, USA)과 yeast 추출물인 Bacto Yeast Extract (BD, USA)를 100 g/L stock으로 제조하여 사용하였다. 첨가하는 가수분해물의 적정 농도와 영향력의 차이를 확인하기위해 mixture design에 적용시켜 Design Expert 7.
- 본 연구에서는 융합 인간세포주 개발의 대상이 되는 세포주인 HEK293과 Namalwa세포를 사용하였다. 각각의 세포주는 CD293과 RPMI 1640 (Invitrogen, USA) 배지 25 mL에 0.
- 계대 배양은 3~4일 간격으로 수행하였다. 실험에 사용된 기본배지로는 CD293 배지에 6 mM L-glutamine을 첨가하였다. 이는 두 세포주가 모두 안정성을 유지할 수 있고 조성 확인과 조절이 용이한 배지이다.
- 주요에너지원인 탄소원과 질소원의 농도별 영향 확인을 목적으로 탄소원은 glucose를 질소원은 glutamine을 사용하였다. Glucose 농도 조절은 glucose (Sigma, USA)를 10 g/L stock 으로 제조하여 사용하였고, glutamine은 L-glutamine-200 mM (Sigma, USA)을 사용하여 조절하였다.
데이터처리
- 또한 pH는 pH meter (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 측정하고 1 N HCl 및 1 N NaOH를 이용하여 조절하였다. 또한 배양환경이 세포에 미치는 영향의 경향성을 살펴보고 각 조건에 의한 상호작용을 확인하기 위해 BoxBehnken design을 적용하고 JMP 6 프로그램을 사용하여 분석하였다. Namalwa 세포의 경우 배양환경에 대한 정보가 부족하기 때문에 일반적인 세포에 적용될 수 있는 범위를 정하는 것이 중요하였다.
- 가수분해물은 soy 유래 BBL Phytone Peptone (BD, USA)과 yeast 추출물인 Bacto Yeast Extract (BD, USA)를 100 g/L stock으로 제조하여 사용하였다. 첨가하는 가수분해물의 적정 농도와 영향력의 차이를 확인하기위해 mixture design에 적용시켜 Design Expert 7.1.5 프로그램을 이용하여 결과를 분석하였다. 경향성 확인이 목적이기 때문에 전통적인 방법을 변형시켜 혼합 비율과 적정 농도를 한 번에 확인할 수 있도록각 조건을 none, soy peptone, yeast extract로 정하고 6 g/L 기준으로 수행하였다.
성능/효과
- HEK293 세포는 3 g/L soy peptone을 첨가할 경우 초기 증식에 가장 긍정적인 영향을 주는 반면 지수증식기에 들어서면서 yeast extract의 영향이 크게 증가하는 양상을 보였다 (Fig. 6(a), (b)).
- Namalwa 세포는 glutamine 농도에 의존적이고 결핍시 증식을 못하지만 HEK293 세포는 glutamine이 없어도 증식 가능하고 오히려 glutamine 농도가 증가할수록 심하게 응집되어 증식을 저해하였다. HEK293 세포는 가수분해물 첨가에 민감하게 반응하여 최대 3배에 달하는 최대세포농도 증가를 보였으며, soy peptone과 yeast extract를 별도로 첨가하는 것보다 적절한 비율로 첨가할 때 효과가 더욱 증폭되었다. 반면 Namalwa 세포의 경우 두 가지 가수분해물 모두 세포 증식을 저해하였다.
- 세포 증식속도 저해의 원인으로는 역시 용존산소량이나 전단응력을 들 수 있으나 낮은 교반속도에 의해 세포응집이 형성된다는 보고를 고려할 때 교반속도보다는 용존산소량에 대한 접근이 우선되어야 할 것이다 [23]. HEK293과 Namalwa 세포 모두 scale-up에 대한 민감성을 보였으며, 특히 Namalwa 세포의 경우 교반속도에 의한 생존도 영향이 심하였다 (Table 5). 이상의 결과에 의하면 최적화되어 있는 환경에서 배양한 결과가 아니기 때문에 두 세포 모두 증식이 저해되는 현상을 보였으나, 대량배양 적용에 있어 환경변화에 민감할 수 있다는 점을 확인 하였다.
- Namalwa 세포의 경우, HEK293 세포에 비해 배양 환경 변화에 민감하기 때문에 보다 부정적인 결과를 예측하였고, 실제로 총 세포수는 증가했지만 세포 생존도는 급격히 낮아졌다 (Fig. 8(b)).
- 가장 특이적인 특성은 삼투압 증가에 따라 μ가 감소하지만 최대세포농도는 360 mOsm/kg 조건까지 유지되는 점이었다 (Fig.
- 조건 측정 및 유지 문제뿐만 아니라 용존 산소량이나 전단응력의 변화와 같이 flask 배양 수준에서 확인하기 어려운 조건들이 존재하기 때문에 실험실 규모 bioreactor 배양에서의 세포 특성을 확인하였다. 그 결과 HEK293 세포와 Namalwa 세포 모두 세 가지 배양 조건이 안정 범위에 있었음에도 flask에 비해 증식이 저해되었다.
- 2(b), (f)). 또한 기본배지 조건인 6 mM glutamine이 증식 저해를 유발하여 glucose 농도에 대한 정확한 결과를 얻을 수 없었는데 이는 glutamine 농도 실험 결과에서 확인할 수 있다.
- HEK293 세포주는 칼슘 이온 농도에 민감한 반응을 보인다는 보고를 고려할 때 RPMI 1640은 두 세포주 공통의 기본배지로 적합하지 않다고 볼 수 있다 [20]. 반면 HEK293 세포주의 기본 배지인 CD293 배지에서는 두 세포주 모두 정상적인 증식이 가능하고, 여타 단백질이 첨가되어 있지 않은 chemically defined media 이므로 본 연구에 적합하다고 판단하였다.
- 고삼투압 조건은 생산성 증진을 위해 적용되어온 방법으로 이미 HEK293 세포에서 그 효율성이 보고된 바있으며 새로운 융합세포주에도 적용 가능함을 예상할 수 있다 [22]. 배양조건간 상호작용 결과는 높은 삼투압 조건에서 온도가 증가됨에 따라 세포에 부정적인 영향을 주는 하락폭이 커졌으나 실질적인 배양공정에 있어 크게 유의할 정도는 아니며, 다른 조건들은 서로 독립적이었다 (Fig. 7(c)).
- HEK293 세포의 배양에 사용된 배지는 가수분해물이 첨가된 상태로 삼투압이 50 mOsm/kg 정도 증가되어 있는 상태인 반면 Namalwa 세포배양에 사용된 배지는 일반배지 중에서도 낮은 삼투압 수준이기 때문이다. 상호 작용 결과를 보면 배양조건에 예민하다는 점을 다시 확인할 수 있었고, pH와 삼투압 간의 상호작용이 있음을 알 수있다 (Fig. 7(d)).
- HEK293과 Namalwa 세포 모두 scale-up에 대한 민감성을 보였으며, 특히 Namalwa 세포의 경우 교반속도에 의한 생존도 영향이 심하였다 (Table 5). 이상의 결과에 의하면 최적화되어 있는 환경에서 배양한 결과가 아니기 때문에 두 세포 모두 증식이 저해되는 현상을 보였으나, 대량배양 적용에 있어 환경변화에 민감할 수 있다는 점을 확인 하였다. 그러나 두 세포 모두 산업적으로 적용된 바 있고, 선별된 세포에 대한 배양공정 최적화 단계를 거친다면 명확한 원인을 밝히고 개선시킬 수 있을 것이다.
- 최종적으로 기존 결과에 비해 약 세배에 달하는 11.6 × 106 cells/mL의 최대세포농도에 달해 가수분해물이 HEK293 세포의 성장에 큰 영향을 미쳤다 (Table 1).
후속연구
- 이상의 결과에 의하면 최적화되어 있는 환경에서 배양한 결과가 아니기 때문에 두 세포 모두 증식이 저해되는 현상을 보였으나, 대량배양 적용에 있어 환경변화에 민감할 수 있다는 점을 확인 하였다. 그러나 두 세포 모두 산업적으로 적용된 바 있고, 선별된 세포에 대한 배양공정 최적화 단계를 거친다면 명확한 원인을 밝히고 개선시킬 수 있을 것이다.
- 융합 인간세포주의 제작을 고려할 때, HEK293 세포의 최대 장점인 고효율 형질전환능을 유지하면서 배양 공정에서 치명적인 단점이었던 응집현상을 Namalwa 세포의 특성을 더하여 극복 할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 가수분 해물 첨가에 의한 세포 증식의 증진을 기대할 수 있으며, 배양 환경 변화나 bioreactor 배양에서는 아직 밝혀지지 않은 리스크를 예측해 볼 수 있었다.
- 7(d)). 이러한 결과는 미약하나마 가수분해물 첨가시 증식이 저해되었던 원인을 설명해 줄 수 있으며, 첨가물을 추가할 경우 반드시 pH와 삼투압의 변화를 고려해야 할 것이다.
- 또한 배양 조건의 경우 고려해야 할 인자 수는 비교적 적지만 각 조건들 사이의 상호작용이 있을 수 있기 때문에 최적의 환경을 찾기가 쉽지 않다. 하지만 실험계획법을 적용한다면 이원배치법이나 Plackett-Burman법과 같은 직교배열법으로 배지 혹은 배양조건 중 중요인자를 검색하고, Box-Behnken법이나 중심합성 설계와 같은 반응표면분석법을 이용하거나 mixture design 등을 이용해 각 인자간의 상호작용이나 최적화 수준을 보다 효율적으로 확인해 볼 수 있다. 시간적 경제적 효율을 고려할 때 분명 이상적인 방법이기는 하지만 실험계획법의 기본원리인 randomization, replication, blocking을 비롯해 목적에 부합되는 설계법의 선택이 성공적인 적용의 필수요건이 될 것이다 [17-19].
- 본 연구의 결과는 융합세포주와의 직접적인 비교에 의한 결과가 아니기 때문에 최적화나 정확한 수치에 대한 정보의 의미 보다는 두 세포주의 특정 조건에 따른 특성 규명에 초점을 두었다. 향후 융합 인간세포주의 명확한 특성을 파악하고, 그 유래를 통한 간접적인 접근이 가능하게 되었다는 점에서 그 의미를 갖는다고 하겠다.
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