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문제 정의
- 군소의 PDE4 long-form의 N말단 20개의 아미노산으로 이루어진 ApPDE4 L(N20)은 소수성 상호작용에 의해 원형질막으로 위치되고, ApPDE4 short-form (ApPDE4 S(N-UCR1- 2))은정전기적 상호작용에 의해서 원형질막으로 위치된다고 보고되었다[11]. 본 연구에서는 이러한 인지질에 결합하여 원형질막에 위치되는 단백질들을 살아있는 세포내에서 과발현 시켰을 때 유도되는 세포의 형태적 변화에 영향을 있는지 확인하고자 하였다.
제안 방법
- Louis, Mo, USA)사에서 구입하였다. Antimycin A의 처리 농도는 PBS에 200 nM로 녹여 40분간 처리하였고, Rapamycine 세포배양 MEDIA에 1 μM 으로 녹여 1분간 처리했고, Wortmannine DMEM에 200 nM 으로 녹여 40분간 처리하여 사용하였다.
- 세포 배양기를 이용해 배양하였다. DNA transfectione Invitrogen (1600 Faraday Avenue, PO Box 6482, Carlsbad, California 92008, USA)사에서 제공되는 설명서를 기반으로수행되었고, Transfection 후 다음날에 Carl Zeiss (Carl-Zeiss- Strasse 22, 73447 Oberkochen, Germany)사의 Zeiss LSM 700 laser scanning confocal microscope을 이용하여 GFP ex- citation (488 그리고 508-543 nm)과 GFP emission (500-550 nm) 필터로 설정 후 ZEN software로 영상을 획득하였다.
- 이를 응용하여, 원형질막의 특정 PI를 제거할 수 있다. PI의 Inositol ring 의 탄소 5번째 인산기를 제거할 수 있는 Inpp5e와, PI의 Inositol ring의 탄소 4번째의 인산기를 제거할 수 있는 PJ-Sac 과, PI의 Inositol ring의 탄소 4, 5번째의 인산기를 제거할 수있는 PJ와, 마지막으로 인산기를 제거할 수 없는 Negative control인 PJ-DEAD construct를 사용하여 직접적으로 원형질막의 특정 PI를 제거하였을 때 EGFP-OSH2(PH)x2와 EGFP- PLCδ1(PH)와 EGFP-AKT(PH)와 EGFP-P4M-SidM의 단백질위치 변화를 확인하였다(Fig. 1B). EGFP-PLCδ1(PH)는 원형질막의 PI(4, 5)P2와 선택적으로 결합하여 원형질막으로 위치된다고 보고되어 있는데, 본 실험의 결과와 마찬가지로 원형질막의 PI(4, 5)P2의 5번째 인산기를 제거할 수 있는 Inpp5e와 5번째 인산기와 4번째 인산기도 같이 제거할 수 있는 PJ를 이용하였을 때, 원형질막에 위치하고 있는 EGFP-PLCδ1(PH)의단백질 위치가 Rapamycin처리에 의해 사라지는 것을 확인하였다(Fig.
- 않았다. 본 연구를 통해 원형질막의 안쪽층으로위치되는 단백질들의 막 결합특성에 따라 세포모양의 다른변화를 분석할 수 있었다.
- 본 연구에서는 원형질막의 인지질 구성요소 중 PS, PI4P, PI(4, 5)P2 혹은 PI(3, 4, 5)P3와 선택적으로 결합하여 원형질막으로 위치하는 단백질들과 소수성 또는 정전기적인 상호작용에 의해 원형질막에 위치하는 단백질을 세포내에 과발현시켜 세포의 형태적 모양변화를 관찰하였다. 본 연구를 통해 특정 인지질과 결합하여 원형질막으로 위치하는 단백질들이 고유의 세포 모양변화를 유발할 수 있음을 알게 되었다.
- 원형질막의 내층에 존재하는 인지질과 결합하여 세포의원형질막에 위치되는 단백질들의 과발현이 세포의 형태적 변화를 유도하는 효과를 알아보기 위하여, 원형질막에 존재하면서 인지질에 결합한다고 알려진 단백질들을 HEK293T 세포에 과발현시켰다(Fig. 1A). OSH2(PH)x2는 PI4P와 PI(4, 5)P2 에 결합하고[16], PLCδ1(PH)는 PI(4, 5)P2에만 결합하고, AKT1(PH)는 PI(3, 4, 5)P3 그리고 P4M-SidMe PI4P에 특정적으로 결합한다고 보고되고 있다[6, 7, 17].
- 예를들어 EGFP-PLCδ1(PH)와 EGFP-AKT1(PH)가 발현된 세포에서는 가장자리 부분에 모양이 약간 부푸는것과 얇은 가시 모양을 형성하는 것으로 관찰되었고, Lact-C2-EGFP는 세포모양이 줄어들면서 돌기모양을 형성하는 것으로 관찰되었다. 이러한 세포의 모양변화가 세포사멸과정의 Artifact으로 Lamellipodia나 Filopodia 처럼 보이게 하는 것이 아닌지 확인하기위해, 세포사멸을 세포를 확인할 수 있는 Annexin V staining 실험을 진행하였다(data not shown). Annexin V 염색 실험은 세포사멸이 진행된 세포를 구별시켜주는 방법으로세포사멸이 진행되었을 때 원형질막 내층에 존재하는 PS가외층으로 노출되면서 이를 염색시키는 원리이다.
- 이를 위해 실험에 사용한 단백질들의 원형질막 위치 매커니즘이 보고된 것과 일치하는지 확인하기 위해 ATP 합성을억제하는 약물인 Antimycin A (Am)을 처리해 보았다. 일반적으로 원형질막의 Phosphatidylinositide (PIs)는 다양한 인산화 효소에 의해서 인산화된 형태이다.
- 인지질에 결합하여 원형질막에 위치되는 단백질들의 과발현이 세포의 어떤 형태적 변화를 유도하는지 확인하기 위해서 HEK293T 세포에 이들을 과발현시키고 장시간(24시간 이상) 배양한 후 세포 모양을 관찰하였다(Fig. 2A). Fig.
- 특정단백질의 과발현에 의해 세포의 형태적 모양 변화를 더 자세히 관찰하기 위해서 Confocal laser scanning micro- scopy을 통하여 세포를 촬영하였다(Fig. 2B). 실험의 대조군으로 EGFP가 발현된 세포는 발현 후에 특정한 모양 변화가 나타나지 않았다.
대상 데이터
- Antimycin A, Phosphate-buffered saline (PBS), Rapamy- cin, Wortmannine Sigma (St. Louis, Mo, USA)사에서 구입하였다. Antimycin A의 처리 농도는 PBS에 200 nM로 녹여 40분간 처리하였고, Rapamycine 세포배양 MEDIA에 1 μM 으로 녹여 1분간 처리했고, Wortmannine DMEM에 200 nM 으로 녹여 40분간 처리하여 사용하였다.
- HEK293T 세포는 10% Fetal bovine serum (FBS) + 1% Penicillin/streptomycin + DMEM 배양액에서 37℃ (w/ 5% CO2) 세포 배양기를 이용해 배양하였다. DNA transfectione Invitrogen (1600 Faraday Avenue, PO Box 6482, Carlsbad, California 92008, USA)사에서 제공되는 설명서를 기반으로수행되었고, Transfection 후 다음날에 Carl Zeiss (Carl-Zeiss- Strasse 22, 73447 Oberkochen, Germany)사의 Zeiss LSM 700 laser scanning confocal microscope을 이용하여 GFP ex- citation (488 그리고 508-543 nm)과 GFP emission (500-550 nm) 필터로 설정 후 ZEN software로 영상을 획득하였다.
이론/모형
- 원형질막에 위치되는 단백질들이 어떤 PIs와 결합하여 원형질막으로 위치되는지 확인하기 위해, Pseudojanin (PJ) sys- tem을 이용하였다. PJ systeme FKBP12-rapamycin binding (FRB) domain과 FK506-binding protein (FKBP)의 상호작용을 기반으로 Rapamycin이 존재할 때, FRB domain와 FKBP 단백질이 서로 결합하는 특성을 가지고 있다[4].
성능/효과
- 1B). EGFP-PLCδ1(PH)는 원형질막의 PI(4, 5)P2와 선택적으로 결합하여 원형질막으로 위치된다고 보고되어 있는데, 본 실험의 결과와 마찬가지로 원형질막의 PI(4, 5)P2의 5번째 인산기를 제거할 수 있는 Inpp5e와 5번째 인산기와 4번째 인산기도 같이 제거할 수 있는 PJ를 이용하였을 때, 원형질막에 위치하고 있는 EGFP-PLCδ1(PH)의단백질 위치가 Rapamycin처리에 의해 사라지는 것을 확인하였다(Fig. 1B1). PI4P만의 결합으로 원형질막에 위치된다고 보고된 EGFP-P4M-SidMe 원형질막의 PI4P를 제거할 수 있는 PJ-Sac와 PJ가 발현된 경우에, 원형질막에 위치하고 있는 EGFP-P4M-SidM의 단백질 위치가 Rapamycin처리에 의해사라지는 것을 확인하였다(Fig.
- 1B1). PI4P만의 결합으로 원형질막에 위치된다고 보고된 EGFP-P4M-SidMe 원형질막의 PI4P를 제거할 수 있는 PJ-Sac와 PJ가 발현된 경우에, 원형질막에 위치하고 있는 EGFP-P4M-SidM의 단백질 위치가 Rapamycin처리에 의해사라지는 것을 확인하였다(Fig. 1B3). 반면에, PI4P와 PI (4, 5)P2결합에 의해 원형질막에 위치된다고 알려진 EGFP- OSH2 (PH)x2는 PJ로 PI4P와 PI(4, 5)P2를 함께 제거하였을 경우에만 단백질의 원형질막 위치가 사라지는 것을 확인했다 (Fig.
- 1D), 본 연구실의 이전 연구에서 발견한 S(N-UCR1-2)-EGFP의 단백질 위치 메커니즘이 특정 PIs의 결합에 의한 것이 아니라 정전기적 상호작용에 의해서 위치된다고 이루어진다는 사실과 부합하였다 [11]. 따라서, 종합해보면 EGFP-OSH2(PH)x2는 원형질막에 위치하는데 PI4P, PI(4, 5)P2가 모두 중요하고, EGFP-PLCδ 1(PH)는 PI(4, 5)P2가 중요하고, EGFP-AKT1(PH)는 PI(3, 4, 5)P3 가 중요하고, EGFP-P4M-SidM는 PI4P가 중요함을 확인할 수 있었다.
- 반면, PI(4, 5)P2와 결합하여 원형질막으로 위치하는 EGFP-PLCδ1(PH), PI(3, 4, 5)P3와 결합하여 원형질막으로 위치하는 AKT1(PH)-EGFP, PI4P와 PI(4, 5)P2에결합하여 원형질막으로 위치하는 OSH2(PH)x2-EGFP의 세포 내 과발현은 세포의 크기가 줄어드는 세포수축 현상과 함께 Lamellipodia (화살촉)와 Filopodia (화살표)모양으로 보이는 모양 변화가 유발되었다. 반면에, PS와 선택적으로 결합하여 원형질막으로 위치하는 Lact-C2-EGFP, 원형질막의 소 수성 상호작용에 의해 원형질막으로 위치하는 L(N20)-EGFP, 그리고 원형질막의 정전기적 상호작용에 의해 원형질막으로 위치하는 S(N-UCR1-2-)-EGFP의 세포 내 과발현은 세포의 형태가 줄어드는 현상과 이를 통해 나타나는 부분적인 돌기가 형성되는 것을 확인하였다. 시간이 지남에 따라 세포의 본래의 모양을 잃고 작고 둥글게 변하여 돌기부분에 분절이 일어나는 세포사멸과 비슷한 형태적 변화가 일어나는 것을 확인하였다.
- 본 연구를 통해 PI(4, 5)P2 또는 PI(3, 4, 5)P3와 결합하여 원형질막으로 위치되는 단백질들의 과발현은 세포수축과 Lamellipodia와 Filopodia와 같은 모양변화를 유발하였고, PS와 소수성 또는 정전기적 상호작용에 의해서 원형질막으로위치되는 단백질의 과발현은 세포수축과 돌기모양의 형성을유발하였으나, Lamellipodia와 Filopodia와 같은 모양변화를유발하지는 않았다. 본 연구를 통해 원형질막의 안쪽층으로위치되는 단백질들의 막 결합특성에 따라 세포모양의 다른변화를 분석할 수 있었다.
- 형태적 모양변화를 관찰하였다. 본 연구를 통해 특정 인지질과 결합하여 원형질막으로 위치하는 단백질들이 고유의 세포 모양변화를 유발할 수 있음을 알게 되었다.
- 반면에, PS와 선택적으로 결합하여 원형질막으로 위치하는 Lact-C2-EGFP, 원형질막의 소 수성 상호작용에 의해 원형질막으로 위치하는 L(N20)-EGFP, 그리고 원형질막의 정전기적 상호작용에 의해 원형질막으로 위치하는 S(N-UCR1-2-)-EGFP의 세포 내 과발현은 세포의 형태가 줄어드는 현상과 이를 통해 나타나는 부분적인 돌기가 형성되는 것을 확인하였다. 시간이 지남에 따라 세포의 본래의 모양을 잃고 작고 둥글게 변하여 돌기부분에 분절이 일어나는 세포사멸과 비슷한 형태적 변화가 일어나는 것을 확인하였다. 그러나, 이들 세포에서 Lamellipodia와 Filopodia로 보이는 모양 변화는 나타나지 않았다.
- Annexin V 염색 실험은 세포사멸이 진행된 세포를 구별시켜주는 방법으로세포사멸이 진행되었을 때 원형질막 내층에 존재하는 PS가외층으로 노출되면서 이를 염색시키는 원리이다. 실험결과로세포의 형태적 변화가 유도된 세포에서는 Annexin V의 염색이 되지 않았다. 즉, 세포사멸에 의한 모양변화가 아니라 특정단백질의 과발현이 살아있는 세포에서 세포의 형태적 변화를유발하는 것으로 확인이 되었다.
- 즉 ATP를 사용하여 PI의 Inositol ring에 효소에 의해서 인산화가 되어 PIs가 된다. 원형질막에 위치하는 PIs를 제거하기 위하여 ATP 합성을억제하는 약물인 Am을 처리하면, PIs결합에 의해 원형질막으로 위치하는 EGFP-OSH2x2(PH), EGFP-PLCδ1(PH), EGFP-AKT1(PH), EGFP-P4M-SidM 그리고 정전기적 상호작용에 의해서 원형질막으로 위치하는 S(N-UCR1-2)-EGFPe원형질막에서 세포질로 단백질의 위치가 바뀌는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 이와는 대조적으로, PS와 결합하는 Lact-C2- EGFP와 소수성 상호작용에 의해서 원형질막으로 위치하는 ApPDE4 L(N20)-EGFPe Am을 처리하여도 원형질막의 단백질 위치에는 변화가 없었다(Fig.
- 그러나, 이들 세포에서 Lamellipodia와 Filopodia로 보이는 모양 변화는 나타나지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 인지질에 결합하여 원형질막으로 위치되는 단백질의 과발현은 세포의 특정 모양연구 결과 특히 PI(4, 5)P2 또는 PI(3, 4, 5)P3와결합하여 원형질막으로 위치되는 세포에서는 Lamellipodia 와 Filopodia가 형성되는 세포 모양과 일치했고, 원형질막으로 위치하는 단백질의 과발현이 결합하고 있던 인지질의 고유의 기능을 저해시킴으로써 세포의 형태변화를 유도하였다. 이전 연구를 통해 PI(4, 5)P2와 PI(3, 4, 5)P3는 세포의 액틴 필라멘트의 형성 및 조립을 조절한다고 보고되어 있는데, 이와 결합하는 단백질의 과발현이 Actin polymerization과 관련되어있는 Lamellipodia와 Filopodia가 형성된다는 사실은 매우 흥미로운 연구 결과이다.
- 실험결과로세포의 형태적 변화가 유도된 세포에서는 Annexin V의 염색이 되지 않았다. 즉, 세포사멸에 의한 모양변화가 아니라 특정단백질의 과발현이 살아있는 세포에서 세포의 형태적 변화를유발하는 것으로 확인이 되었다.
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