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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 마우스에 NC/Nga DNCB(2.4-Dinitrochlorbenzene)를 도포하여 아토피 피부염을 유발시킨 다음, 저비용으로 손쉽게 얻을 수 있을 뿐만 아니라 Staphyloccous aureus에 대한 항균성을 갖고 있는 솔잎 추출물을 도포함으로써 보이는 피부 병변의 중증도 측정, 혈청 IgE 측정(ELISA), 마우스 피부 표피 두께 변화, Mast cell 변화를 측정하여, 솔잎 추출물의 아토피 피부염 치료 효과를 갖는 천연염료로서의 적용 가능성에 대해 검증하고자 하였다.
- 본 연구의 목적은 솔잎 추출물의 아토피 피부염치료 효과를 갖는 천연염료로서의 적용 가능성을 알아보기 위한 것이다. 아토피 피부질환에 대한 솔잎 추출물의 효과를 알아보기 위하여 본 연구에서는 인체 아토피피부염과 유사한 피부 병변을 DNCB로 유발시킨 NC/Nga 마우스의 피부에 솔잎 추출물을 도포하고, 피부 병변 및 혈청 내 총 IgE 농도변화, 두께변화, 비만세포(mast cell)의 개수를 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- 실험시작 4일 전에 모든 마우스의 등에 1% DNCB용액 150㎕를 도포하였고 4일 동안 면역반응을 유발한 후, 모든 마우스에 1주일에 2~3회씩 2주 동안 0,5% DNCB용액 150㎕를 등 부위에 도포하여 접촉성 피부염을 유발하였다.
- 마우스의 안와에서 헤파린이 도포된 주사기를 이용하여 혈액을 채취하여 8000rpm에서 10분간 원심 분리로 얻은 혈청을 모아 -70℃의 냉동고에 보관하였다. 상용화된 ELISA set(BD OptEIATM, BD Biosciences, USA)를 이용하여 혈청 IgE를 측정하였다.
- 실험 종료 후 NC/Nga 마우스의 등 쪽 부분의 피부조직을 10% 포르말린에 24시간 이상 고정시킨 후 파라핀 블록을 제작하고 5/㎛로 절편한 후 hematoxylin & eosin 염색법(H&E stain)을30) 이용하여 조직염색을 한 후 광학현미경으로 확인하였다.
- 아토피 피부염을 2주간 유도한 다음 3주간 주 5회 첫 번째 실험군은 미처리, 두 번째 실험군은 0.5% DNCB, 세 번째 실험군은 솔잎 추출물과 DNCB 0.5%를 각각 등 부위에 도포하였다.
- 본 연구의 목적은 솔잎 추출물의 아토피 피부염치료 효과를 갖는 천연염료로서의 적용 가능성을 알아보기 위한 것이다. 아토피 피부질환에 대한 솔잎 추출물의 효과를 알아보기 위하여 본 연구에서는 인체 아토피피부염과 유사한 피부 병변을 DNCB로 유발시킨 NC/Nga 마우스의 피부에 솔잎 추출물을 도포하고, 피부 병변 및 혈청 내 총 IgE 농도변화, 두께변화, 비만세포(mast cell)의 개수를 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 실험군의 구성은 15마리 중 건강한 12마리의 NC/Nga 마우스를 다음과 같은 3개의 실험군으로 나누어 5주간 실험을 진행하였다. 첫 번째 실험군은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Control), 두 번째 실험군은 DNCB만 도포한 군(DNCB), 세 번째 실험군은 솔잎 추출물과 DNCB 0.5%를 도포한 군(DNCB+Pine needles)으로 나누어 실험을 진행하였다.
- 측정은 NC/Nga 마우스의 등에 도포한 부분을 관찰하여 NC mouse score를 이용하여15) 육안 평가를 실시하였는데, NC mouse score는 NC mouse score 판정사진을 기준으로 관찰자가 육안으로 관찰하여 등급을 매기는 방법으로, 최소는 0에서 최대는 13이다,
- 피부 병변의 측정은 아토피 피부염을 2주간 유도한 다음 1회, 3주간의 솔잎 추출물 처리 종료 후 1회 총 2회 측정하였다.
- 혈청의 IgE측정은 시험시작 전, 아토피 피부염을 2주간 유도한 다음, 3주간의 솔잎 추출물 처리 종료 후 3회 측정하였다. 마우스의 안와에서 헤파린이 도포된 주사기를 이용하여 혈액을 채취하여 8000rpm에서 10분간 원심 분리로 얻은 혈청을 모아 -70℃의 냉동고에 보관하였다.
- 화학적 면역 유도 물질인 2.4-Dinitrochlorbenzene(이하 DNCB)를 NC/Nga 마우스에 도포 후 발생한 피부병변은 아토피피부염과 유사한 접촉성 과민반응으로 IgE의 증가 등 아토피피부염이 있을 때와 동일한 면역반응이 유발되므로 인간에서의 아토피피부염과 유사한 병변으로 볼 수 있어 유용한 아토피피부염 연구 모델로 DNCB와 NC/Nga마우스를 사용할 수 있다고 보고된 바 있으므로10) 본 연구에서는 NC/Nga 마우스에 DNCB 용액을 도포하여 아토피피부염을 유발시켰다.
대상 데이터
- NC/Nga 마우스는 무균 환경에서는 정상이고 건강하지만 보통의 환경에서는 소양증으로 부종 상처 등의 임상증상을 보이며 혈청 내 IgE 수치가 증가하는 등 사람의 아토피 피부염을 대체할 수 있는 모델로 알려져 있다28,29). 6주령 수컷 NC/Nga 마우스를 중앙실험동물(Seoul Korea)에서 공급 받아 입수 시 외관을 육안으로 검사한 후 마우스를 군으로 나누어 각 3군 별로 우리에 격납시키고 25℃, 30% 습도 조건에서 일반 실험 사육 환경 하에 약 2주 동안 적응 시킨 후 실험을 실시하였다. 실험동물의 사육과 보관은 동물실험실의 지침에 의거하였으며, 본 실험은 충남대학교 공동동물실습관의 동물실험윤리위원회의 규정을 준수하여 설계 수행하였다.
- 본 실험에 사용된 DNCB는 씨그마알리드리치코 리아(유)(Korea)에서 구입하였으며, 아세톤과 올리브오일이 4:1로 혼합된 용액에 0.5%와 1%로 희석한 다음 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 소나무(Pinus densiflora)는 대전 계족산에서 2009년 7월에 채집하여 사용하였다. 채집한 솔잎은 잘게 자른 후 솔잎 200g당 메탄올 800ml와 증류수 200ml를 가하여 48시간 침지 후 침지액을 Rotary vacuum evaporator(RV10, IKAⓇ, Germany)를 이용하여 온도 40 ∼ 60℃, 회전속도 180rpm에서 감압 농축하여 분말화한 후 농도로 제조하여 1%실험에 사용하였다.
- 실험동물의 사육과 보관은 동물실험실의 지침에 의거하였으며, 본 실험은 충남대학교 공동동물실습관의 동물실험윤리위원회의 규정을 준수하여 설계 수행하였다. 실험군의 구성은 15마리 중 건강한 12마리의 NC/Nga 마우스를 다음과 같은 3개의 실험군으로 나누어 5주간 실험을 진행하였다. 첫 번째 실험군은 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군(Control), 두 번째 실험군은 DNCB만 도포한 군(DNCB), 세 번째 실험군은 솔잎 추출물과 DNCB 0.
- 아토피 피부질환의 동물모델로는 NC/Nga 마우스가 잘 알려져 있으므로11) 본 연구에서는 실험동물로 NC/Nga 마우스를 이용하였다. NC/Nga 마우스는 무균 환경에서는 정상이고 건강하지만 보통의 환경에서는 소양증으로 부종 상처 등의 임상증상을 보이며 혈청 내 IgE 수치가 증가하는 등 사람의 아토피 피부염을 대체할 수 있는 모델로 알려져 있다28,29).
- 채집한 솔잎은 잘게 자른 후 솔잎 200g당 메탄올 800ml와 증류수 200ml를 가하여 48시간 침지 후 침지액을 Rotary vacuum evaporator(RV10, IKAⓇ, Germany)를 이용하여 온도 40 ∼ 60℃, 회전속도 180rpm에서 감압 농축하여 분말화한 후 농도로 제조하여 1%실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 데이터는 평균 표준편차로 나타내었으며, 평균치간의 유의성은 paired t-test를 이용한 후 p값이 .05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 1. 솔잎 추출물을 처리한 군이 단독 DNCB만 처리한 군에 비하여 NC 마우스 score 등급이 낮게 나타나 아토피피부염 유사 병변의 발현 억제 효과를 나타내었다.
- 2. 솔잎 추출물을 처리한 실험군에서는 단독 DNCB만 처리한 군에 비하여 유의한 IgE의 감소를 유도하였다.
- 3. 솔잎 추출물을 처리한 실험군에서는 단독 DNCB만 처리한 군에 비하여 표피의 두께가 얇게 측정되었고 비만세포의 개수가 감소하였다.
- 83μm로 DNCB군 보다는 얇은 것을 볼 수 있다. 대조군에 비해서 DNCB군은 발진이 많이 진행되어 표피가 진피(dermis)쪽으로 두껍게 내려가 현저하게 확장된 피부손상을 나타내었다. 이에 반해 솔잎 추출물로 처리한 추출물군은 DNCB군에 비해 표피의 두께도 눈에 띄게 줄어들어 DNCB군보다는 더 나은 결과를 확인 할 수 있다.
- 05에서 유의하게 감소하였다. 따라서 솔잎 추출물을 처리한 군은 아토피피부염 유사 병변의 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타났다. NC 마우스 score는 NC 마우스 score 판정사진을 기준으로 관찰자가 육안으로 관찰하여 등급을 매기는 방법으로 등급이 높을수록 아토피성 피부염이 심각함을 나타낸다.
- 반면 솔잎 추출물로 처리한 군에서는 IgE의 값이 7.66±0.81 ng/ml로 DNCB군의 9.22±0.39 ng/ml 보다 낮은 값을 보이고 있어 피부 민감성을 효과적으로 낮추고 있는 것을 보여준다.
- 아토피 피부염을 2주간 유도한 후 첫 번째 측정에서는 정상 대조군(Control)을 제외한 두 그룹의 는 Total clinical skin score 12.33±1.16과 11.25±2.36을 나타내었으나 3주간의 솔잎 추출물 처리 종료 후 측정에서는 DNCB만 도포한 군(DNCB)은 11.67±1.16을 나타내었고 솔잎 추출물을 처리한 군은 4.25±1.50으로 p< .05에서 유의하게 감소하였다.
- 알레르기의 주역 중 하나인 비만세포의 개수는 DNCB를 감작시킨 군에서 90.6±9.13으로 정상대조군의 10.2±1.92 보다 기하급수적인 증가를 보였으나, 솔잎 추출물 처리 후 36.17±7.57로 그 수가 현저히 감소하여 솔잎 추출물 처리가 아토피 피부염을 완화시킨 것을 알 수 있다.
- 대조군에 비해서 DNCB군은 발진이 많이 진행되어 표피가 진피(dermis)쪽으로 두껍게 내려가 현저하게 확장된 피부손상을 나타내었다. 이에 반해 솔잎 추출물로 처리한 추출물군은 DNCB군에 비해 표피의 두께도 눈에 띄게 줄어들어 DNCB군보다는 더 나은 결과를 확인 할 수 있다.
후속연구
- 4. 이상의 결과는 인체 아토피피부염과 유사한 피부 병변을 유발시킨 NC/Nga 마우스에 솔잎 추출물을 피부 도포 했을 때 아토피피부염의 피부 병변을 호전시킬 수 있는 가능성이 있음을 확인하였으므로 솔잎 추출물은 아토피 피부염 치료 효과를 갖는 천연염료로서의 적용이 가능할 것으로 판단된다.
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