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문제 정의
- 따라서 본 연구는 음폐수의 회분식 산발효 반응에 있어 초기 pH 조건과 반응 온도 조건이 VFAs 생성에 미치는 영향을 평가하고 산생성이 최대화되는 조건을 도출함으로써 음폐수의 효율적인 처리 및 자원화에 대한 기초자료를 제공하고자 하였다. 또한 초기 pH에 따른 고온조건의 미생물 군집 해석을 통해 pH와 미생물 군집의 상관성을 평가하고자 하였다.
- 따라서 본 연구는 음폐수의 회분식 산발효 반응에 있어 초기 pH 조건과 반응 온도 조건이 VFAs 생성에 미치는 영향을 평가하고 산생성이 최대화되는 조건을 도출함으로써 음폐수의 효율적인 처리 및 자원화에 대한 기초자료를 제공하고자 하였다. 또한 초기 pH에 따른 고온조건의 미생물 군집 해석을 통해 pH와 미생물 군집의 상관성을 평가하고자 하였다.
제안 방법
- DGGE실험을 위해 PCR product 30 µL에 dye solution 10 µL를 혼합하여 gel에 loading한 뒤 60℃, 200 V에서 5시간동안 전기영동을 실시하였다.
- DNA 추출은 시료 채취 후 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤, PowerSoilTM DNA isolation kit(MoBio Ltd. Co., USA)를 이용하여 추출하였다. 추출한 DNA는 1%의 Agarose gel에서 전기 영동하여 추출여부를 확인하였다.
- 실험에 사용된 primer는 Table 2에 나타내었다. PCR시 mismatch의 오류를 최소화하기 위하여 모든 PCR조건에서 hot taq polymerase(Solgent Co., Korea)을 이용하였다. 각각의 primer에 따른 denaturing, annealing, extension 조건 별 시간과 온도에 대한 PCR 조건은 Table 3에 제시하였다.
- 초기 pH 조건에 따른 산발효 효율을 조사하기 위해, 산발효조 내 시료를 채취하여 주기적으로 시료를 채취하여 pH 측정은 pH meter (Orion, model 520A, USA)를 이용하였으며, TSS 및 VSS는 수질오염공정 시험법에 따라 측정하였다. TCODCr, SCODCr농도는 COD kit(HS-COD-M, Humas, Korea)를 이용하여 분석하였다. VFAs는 flame ionization detector(FID) 검출기가 장착된 Gas Chromatography (Hewlett Packard, HP-5890 series Ⅱ, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 이동상으로는 질소 가스를 이용하였다. VFAs 중 측정항목은 acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid 등을 대상으로 하였으며, C2 - C5 VFAs의 정량을 위해 표준물질을 사용하였다.
- TCODCr, SCODCr농도는 COD kit(HS-COD-M, Humas, Korea)를 이용하여 분석하였다. VFAs는 flame ionization detector(FID) 검출기가 장착된 Gas Chromatography (Hewlett Packard, HP-5890 series Ⅱ, USA)를 이용하여 분석하였다. 이때 컬럼은 DB-FFAP (30 m × 0.
- 4로 나타났으며, 이는 서로 다른 시기에 채취한 음폐수 시료 성상의 차이에서 기인한 것으로 판단된다. pH 6.2와 6.4의 조건을 대조실험군(no pH adjustment)으로 이용하였으며, pH를 5.0, 7.0, 그리고 9.0로 조정한 회분반응기를 대상으로 산발효 실험을 실시하였다. Fig.
- pH 조건에 따른 산발효 회분실험은 각각 중온(35±0.5℃)과 고온(55±0.5℃) 조건에서 수행되었다.
- 음폐수를 회분식 산발효조에 넣고 밀폐시킨 후 질소가스를 5분 동안 purging 하여 기질과 반응조에 잔존하는 공기를 완전히 배출시키고, 반응기 내 혐기성 조건을 유지시켰다. 각 조건에서 시간경과에 따른 산 생성 효율을 평가하기 위해, pH, TCODCr, SCODCr, TSS, VSS, volatile fatty acids(VFAs)를 분석하기 위해 반응 초기에는 6시간 간격으로 4회 시료를 채취하였고, 이후에는 12시간 또는 24시간 간격으로 시료를 채취하였다.
- 125 µL을 첨가하고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 25 µL가 되도록 PCR stock solution을 제조하였다. 각각 target 미생물의 16S ribosomal ribonucleic acid(rRNA)를 증폭하기 위해서 먼저 1차 PCR 한 뒤, 2차 PCR 후 DGGE를 위해서 GC-Clamp를 부착한 primer를 이용하여 3차 PCR을 실시하였다. 실험에 사용된 primer는 Table 2에 나타내었다.
- 각각의 primer에 따른 denaturing, annealing, extension 조건 별 시간과 온도에 대한 PCR 조건은 Table 3에 제시하였다. 모든 PCR 실시 후 1% agarose gel에서 전기영동으로 확인하였으며, 다음 과정을 위해서 PCR purification kit(Bioneer Co., Korea)를 사용하여 PCR product를 정제하였다.
- DGGE는 복합 미생물군집의 유전적 다양성을 직접적으로 규명할 수 있는 분자생물학적 방법이다. 본 실험에서는 DGGE (Bio-Rad Ltd. Co., Model 475 Gradient delivery system) gel stock solution으로 acidogenic bacteria는 30%와 60%의 변성제 농도구 배로 조제하여(변성제 농도 100%는 8 M Urea와 40% formamide) 각각 glass plate사이에 18 mL씩 주입하여 농도 구배가 있는 gel을 제조하였다. DGGE실험을 위해 PCR product 30 µL에 dye solution 10 µL를 혼합하여 gel에 loading한 뒤 60℃, 200 V에서 5시간동안 전기영동을 실시하였다.
- 산발효 회분식 실험은 용적이 1 L(유효용적 0.8 L)인 삼각플라스크를 회분 반응기로 사용하였으며, 음폐수와 혐기성 소화슬러지를 2:1로 혼합하여 주입하였다. 중온조건의 실험은 부산 수영하수처리장 중온 혐기성 소화조 슬러지를 No.
- 4로 나타났다. 음폐수의 산발효에 있어 pH 조건에 따른 영향을 평가하기 위해 음폐수와 슬러지 혼합액의 pH를 1 M H2SO4와 NaOH 완충용액을 이용하여 각각 5, 7, 9로 조정한 회분 실험을 실시하였으며, 이때 pH를 조정하지 않은 조건(no pH adjustment)을 대조실험으로 이용하였다. pH 조건에 따른 산발효 회분실험은 각각 중온(35±0.
- 이때 컬럼은 DB-FFAP (30 m × 0.2 mm × 0.33 µm)를 사용하였으며, Oven, Injector 및 Detector의 온도는 각각 95℃, 220℃, 250℃로 설정하였다.
- DGGE실험을 위해 PCR product 30 µL에 dye solution 10 µL를 혼합하여 gel에 loading한 뒤 60℃, 200 V에서 5시간동안 전기영동을 실시하였다. 전기 영동한 gel은 ethidium bromide으로 30분간 염색시킨 후 UV transilluminator (Uvitec gel documentation system, UK)를 사용하여 band를 확인하였다.
- 중온 및 고온 조건에서 음폐수를 기질로 이용하여 서로 다른 초기 pH 조건에서 회분식 산발효 실험을 실시하여 다음의 결론을 얻었다. 중온조건은 중온 소화조 슬러지를 이용하였고, 고온조건은 중온 소화조 슬러지를 고온조건으로 90일간 순응시켜 사용하였다.
- 중온 및 고온 조건에서 음폐수를 기질로 이용하여 서로 다른 초기 pH 조건에서 회분식 산발효 실험을 실시하여 다음의 결론을 얻었다. 중온조건은 중온 소화조 슬러지를 이용하였고, 고온조건은 중온 소화조 슬러지를 고온조건으로 90일간 순응시켜 사용하였다.
- 추출한 DNA는 0.5 µL 튜브에 10 × Taq buffer 2.5 µL, 10 mM dNTP 10 µL, 각각의 primer 0.25 µL (10 pmol), DNA template 2 µL, Taq(or hot taq) DNA polymerase(Solgent Co., Korea) 0.125 µL을 첨가하고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 25 µL가 되도록 PCR stock solution을 제조하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 부산시 수영하수종말처리장의 음식물쓰레기 병합처리시설에서 음식물쓰레기를 분리 및 탈수하는 과정에서 발생하는 음폐수를 수거하여 사용하였으며, 음폐수의 성상분석 결과는 Table 1과 같다. 음폐수에 포함된 입자가 큰 고형물을 제거하기 위해 No.
- 33 µm)를 사용하였으며, Oven, Injector 및 Detector의 온도는 각각 95℃, 220℃, 250℃로 설정하였다. 이동상으로는 질소 가스를 이용하였다. VFAs 중 측정항목은 acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid 등을 대상으로 하였으며, C2 - C5 VFAs의 정량을 위해 표준물질을 사용하였다.
- 중온조건의 실험은 부산 수영하수처리장 중온 혐기성 소화조 슬러지를 No. 20(850 µm)체로 거른 후 사용하였고, 고온조건의 실험은 중온 혐기성 소화조 슬러지를 진탕배양기를 이용하여 55±1℃ 조건에서 90일간 순응시켜 No. 20(850 µm)체로 거른 후 사용하였다.
이론/모형
- 초기 pH 조건에 따른 산발효 효율을 조사하기 위해, 산발효조 내 시료를 채취하여 주기적으로 시료를 채취하여 pH 측정은 pH meter (Orion, model 520A, USA)를 이용하였으며, TSS 및 VSS는 수질오염공정 시험법에 따라 측정하였다. TCODCr, SCODCr농도는 COD kit(HS-COD-M, Humas, Korea)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- 4는 고온조건의 회분반응기에 대해 pH 조건에 따른 미생물 군집 구조를 모니터링 하기 위해 실시한 DGGE 결과를 SPSS 분석을 통해 나타낸 것이다. Acidogenic bacteria 검출을 위해 PRBA338F-GC과 PRUN518R primer를 이용하였는데, 초기 pH 조건에 따른 DGGE profile은 서로 상이한 결과를 보여주었으며, 총 15개의 band가 일정한 경향을 보여주었다. 대조실험 (no pH adjustment) 조건의 band는 초기 pH를 각각 5, 7, 9로 조정한 조건에 비해 복잡한 결과를 보여줌으로써 pH 조정이 미생물 군집을 상대적으로 단순화시키는 것으로 판단되었다.
- SPSS 분석을 통한 초기 pH 5의 조건과 음폐수(pH 3.8~4.4)의 미생물 군집의 상관도(Pearson Correlation Coefficients)는 90%였으며, Control (IM, Initial Mixture)과 초기 pH 7 조건의 미생물 군집 상관도는 86%였다. 따라서 초기 pH 조건이 미생물 군집 구조에 주요한 영향을 미치는 것으로 판단할 수 있으며, pH 조건에 따른 미생물 종을 규명하기 위해서는 DGGE band로부터 DNA 추출 및 PCR을 통해 염기서열 분석 (sequencing analysis)이 추가적으로 이뤄져야 할 것이다.
- TVFAs 생성속도도 중온과 고온 반응 모두에서 초기 pH를 7로 조정한 경우에 가장 높게 나타났으며, 반응 시작 후 18hr 동안 TVFAs 생성속도는 중온과 고온조건에서 0.15 g TVFAs/L·hr과 0.23 g TVFAs/L·hr이었다.
- 고온조건에서도 중온조건과 마찬가지로 초기 pH를 7로 조정한 경우에 가장 높은 최종 VFAs 농도를 나타내었으며, 중온과 고온조건 모두에서 반응 시작 후 18 hr 동안 가장 높은 VFAs 생성 속도를 보였는데, 반응 시작 후 18 hr 동안 VFAs 생성속도는 반응 부피와 반응 시간 및 VFAs 생성량을 기준으로 각각의 조건에서 0.15 g TVFAs/L·hr과 0.23 g TVFAs/L·hr이었다.
- 그러나 VFA 중 propionic acid와 butyric acid의 온도조건에 따른 생성에서는 서로 다른 결과가 나타났는데, 35±1℃의 중온조건에서는 acetic acid, propionic acid, butyric acid 그리고 valeric acid의 농도 순으로 생성되었으나, 55±℃의 고온조건에서는 acetic acid, butyric acid, propionic acid, 그리고 valeric acid의 순으로 농도가 높았다.
- Acidogenic bacteria 검출을 위해 PRBA338F-GC과 PRUN518R primer를 이용하였는데, 초기 pH 조건에 따른 DGGE profile은 서로 상이한 결과를 보여주었으며, 총 15개의 band가 일정한 경향을 보여주었다. 대조실험 (no pH adjustment) 조건의 band는 초기 pH를 각각 5, 7, 9로 조정한 조건에 비해 복잡한 결과를 보여줌으로써 pH 조정이 미생물 군집을 상대적으로 단순화시키는 것으로 판단되었다.
- 2(b)에서 반응 48hr 이후 TVFAs 농도가 감소하는 결과와 부합하며, 산발효균과 메탄균이 혼재된 소화슬러지 식종에 따라 VFA의 메탄 전환과정에서 alkalinity 회복에 따른 결과로 판단된다. 따라서 고온조건의 산발효 반응에서도 초기 pH를 중성범위로 조정하는 것이 최대 TVFAs 생성에 효율적인 것으로 평가되었다.
- 본 연구의 중온조건에서 pH 변화 결과를 보면, 초기 pH 7.0의 조건에서 가장 안정적인 결과를 보여주고 있으며, 이는 산발효 과정에서 메탄발효의 전구물질인 acetate 생성을 최대화시키기 위해 중성 범위의 초기 pH 조건이 적합하다는 연구결과들과 부합하는 것으로 평가되었다 (Bengtsson 등, 2008; Lim 등, 2008).
- 온도조건에 따른 VFA 주요 성분별 농도는 중온조건에서 메탄 전환 효율이 낮은 propionic acid가 1,348 mg/L의 고농도로 축적되었으나, 고온조건에서는 acetic acid와 butyric acid의 생성이 최대화되었으며, propionic acid의 농도가 매우 낮게 나타나 biogas 생산을 위한 음폐수의 산발효 반응은 고온조건이 적합한 것으로 평가되었다.
- 20(850 µm)체로 거른 후 산발효 반응의 진행을 방지하기 위해 4℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다. 음폐수의 평균 pH는 4.1이었으며, TCODCr과 SCODCr의 평균값은 각각 160.3 g/L와 60.2 g/L로 나타났다.
- 초기 pH 조건에 따른 미생물 군집 특성에서는 pH를 조정한 경우 미생물 군집이 보다 단순화되는 것으로 나타났으며, pH 조건에 따라 미생물 군집의 유사성이 높게 나타남으로써 pH 조정이 미생물 군집 구조에 직접적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.
- 2 (b)는 고온조건에서 초기 pH에 따른 TVFAs 생성량 변화를 보여주고 있다. 초기 pH를 7.02로 조정한 경우에 반응 시작 후 12 hr에서 18 hr 사이에 급격한 TVFAs 농도 증가를 보여주고 있으며, 이후에도 반응 실험이 완결된 72 hr까지 농도 증가가 관찰되었다. 최대 농도는 5,538 mg/L로 중온조건의 최대 TVFAs 농도와 비슷하지만, 초기 TVFAs 농도 가 1,016 mg/L이었으므로 산발효에 의한 TVFAs의 농도 증가는 중온 조건의 약 1.
- 02로 조정한 경우에 반응 시작 후 12 hr에서 18 hr 사이에 급격한 TVFAs 농도 증가를 보여주고 있으며, 이후에도 반응 실험이 완결된 72 hr까지 농도 증가가 관찰되었다. 최대 농도는 5,538 mg/L로 중온조건의 최대 TVFAs 농도와 비슷하지만, 초기 TVFAs 농도 가 1,016 mg/L이었으므로 산발효에 의한 TVFAs의 농도 증가는 중온 조건의 약 1.6배에 달하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 고온조건에서 음폐수의 가수분해 효율이 중온조건에 비해 우수하므로 반응 시작 후 반응완료 시간인 72 hr까지 음폐수 유기물의 지속적인 산발효가 가능했기 때문인 것으로 판단된다(Feng과 Chen, 2009; Kim 등, 2006; Lim 등, 2008; Yu 등, 2002).
- 회분실험을 위해 음폐수와 혐기성 소화슬러지를 부피비 2:1로 주입한 중온조건과 고온조건의 초기 pH는 각각 6.2와 6.4로 나타났으며, 이는 서로 다른 시기에 채취한 음폐수 시료 성상의 차이에서 기인한 것으로 판단된다. pH 6.
후속연구
- 4)의 미생물 군집의 상관도(Pearson Correlation Coefficients)는 90%였으며, Control (IM, Initial Mixture)과 초기 pH 7 조건의 미생물 군집 상관도는 86%였다. 따라서 초기 pH 조건이 미생물 군집 구조에 주요한 영향을 미치는 것으로 판단할 수 있으며, pH 조건에 따른 미생물 종을 규명하기 위해서는 DGGE band로부터 DNA 추출 및 PCR을 통해 염기서열 분석 (sequencing analysis)이 추가적으로 이뤄져야 할 것이다.
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