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문제 정의
- , 1999)도 있는데 이는 미네랄의 흡수 한계를 갖는 작물에 미네랄 결합 펩타이드를 적용함으로서 미네랄 흡수를 향상 시킬 수 있다고 예견된다. 따라서 도축혈액의 활용이라는 친환경적인 측면에서 혈액으로부터 분리한 펩타이드에 칼슘 및 게르마늄을 결합시킨 제제를 방울토마토에 적용하여 칼슘, 게르마늄의 흡수 특성을 확인하기 위해 본 연구를 수행하였다.
- 단백질 분해효소는 alcalase, esperase, flavourzyme, protamex를 이용하였고 alcalase가 가장 좋은 분해력을 나타내어 폡타이드 생산을 위한 혈청 분해에 활용하였다. 한우 혈청으로부터 분리한 펩타이드와 킬레이트 결합한 칼슘 (chelate-Ca)과 게르마늄 (chelate-Ge)을 방울토마토에 적용하여 흡수 변화를 확인하고자 시험을 수행하였다.
제안 방법
- 한우 혈액으로부터 분리한 혈청을 단백질 가수분해 효소인 alcalase, flavourzyme, esperase, protamex로 최적 조건에서 12시간 동안 각각 가수분해를 실시하였다. 기질대비 첨가한 효소량은 250:1, 500:1:, 1,000:1로 하였다. 단백질 가수분해 효소를 이용하여 얻은 혈청 가수분해물은 유리아미노산 분석에 사용하였다.
- 기질대비 첨가한 효소량은 250:1, 500:1:, 1,000:1로 하였다. 단백질 가수분해 효소를 이용하여 얻은 혈청 가수분해물은 유리아미노산 분석에 사용하였다.
- 펩타이드는 Asp, Glu, Leu을 주요 구성 아미노산으로 하는 한우 혈청을 단백질 분해효소로 분해 후 한외여과를 거쳐 제조하였다. 단백질 분해효소는 alcalase, esperase, flavourzyme, protamex를 이용하였고 alcalase가 가장 좋은 분해력을 나타내어 폡타이드 생산을 위한 혈청 분해에 활용하였다. 한우 혈청으로부터 분리한 펩타이드와 킬레이트 결합한 칼슘 (chelate-Ca)과 게르마늄 (chelate-Ge)을 방울토마토에 적용하여 흡수 변화를 확인하고자 시험을 수행하였다.
- HNO3 10 mL를 첨가하여 250℃에서 분해시켰다. 분해된 시료용액은 3차 증류수로 50 mL 정용하였으며, Ca 함량은 ICP-AES (OPTIMA 3300DV, USA, Perkin-Elmer)를 이용하여 분석하였고 게르마늄 함량은 ICP-MS (ELAN 6000 ELAN DRC II, USA, Parkin-Elmer)로 측정하였다.
- 혈청 가수분해 시료에 5% TCA (trichloroacetic acid)를 일정량 첨가하여 단백질 등의 간섭물질을 침전시킨 후 10,000 xg, 15분 원심 분리하여 상징액만을 사용하였다. 상징액은 유리 아미노산 표준시료와 유사한 농도로 희석하여 아미노산 분석에 사용하였다.
- 시험은 대조구 (control), Calciolid 500배 희석액 (Ca 300 mg L-1; Calciolid Ca-300), chelate-Ca 2000배 희석액 (Ca 100 mg L-1; Chelate-Ca 100), chelate-Ca 1000배 희석액 (Ca 200 mg L-1; Chelate-Ca 200), chelate-Ca 500배 희석액 (Ca 400 mg L-1; Chelate-Ca 400), Ge-132® 100배 희석액 (Ge 20 mg L-1; Ge 132®-20), Chelate-Ge 200배 희석액 (Ge 10 mg L-1; Chelate-Ge 10), Chelate-Ge 100배 희석액 (Ge 20 mg L-1; Chelate-Ge 20), Chelate-Ge 50배 희석액 (Ge 40 mg L-1; Chelate-Ge 40) 처리로 나누었다.
- 시험은 대조구 (control), Calciolid 500배 희석액 (Ca 300 mg L-1; Calciolid Ca-300), chelate-Ca 2000배 희석액 (Ca 100 mg L-1; Chelate-Ca 100), chelate-Ca 1000배 희석액 (Ca 200 mg L-1; Chelate-Ca 200), chelate-Ca 500배 희석액 (Ca 400 mg L-1; Chelate-Ca 400), Ge-132® 100배 희석액 (Ge 20 mg L-1; Ge 132®-20), Chelate-Ge 200배 희석액 (Ge 10 mg L-1; Chelate-Ge 10), Chelate-Ge 100배 희석액 (Ge 20 mg L-1; Chelate-Ge 20), Chelate-Ge 50배 희석액 (Ge 40 mg L-1; Chelate-Ge 40) 처리로 나누었다. 엽과 과실은 3회 처리 1주일 후 수확하여 칼슘과 게르마늄 함량 조사에 이용하였다.
- 엽과 과실은 시료채취 후 증류수를 이용하여 세척한 후 물기를 제거하고, 과실은 처리당 10개, 엽은 처리당 20매를 무게를 측량한 후 70℃의 건조기에서 3일간 건조한 후 마쇄하여 분석시료로 사용하였다. 분석 전처리는 시료 0.
- 혈청 100 μL을 취한 후 PICO-tag방법을 이용하여 hydrolysis 및 PITC labeling을 실시한 후 400 μL의 buffer에 녹여 그 중 10 μL을 취하여 분석에 사용하였다. 유리 아미노산 분석은 충남대학교 공동실험실습관의 amino acid analyzer (HITACHI L-8900, Japan)을 활용하여 분석하였다. 혈청 가수분해 시료에 5% TCA (trichloroacetic acid)를 일정량 첨가하여 단백질 등의 간섭물질을 침전시킨 후 10,000 xg, 15분 원심 분리하여 상징액만을 사용하였다.
- 처리제는 혈청을 가수분해효소로 분해 후 한외여과 과정을 통해 얻은 펩타이드와 CaCl2를 킬레이트 결합한 chelate-Ca (CaO 20%), 리다코리아의 ‘Calciolid' (CaO 15%), 펩타이드와 유기 게르마늄인 Ge-132®를 킬레이트 결합한 chelate-Ge (Ge 2000 mg L-1), 물에 Ge-132®를 녹인 유기 게르마늄제 (Ge 2000 mg L-1)를 사용하였다. 처리 시기는 2011년 4월29일 정식하고, 2011년 6월 21일 1회 처리한 후 10일 간격으로 10a당 1,200 L (주당 300 mL)를 3회 엽면시비 처리하였다. 시험은 대조구 (control), Calciolid 500배 희석액 (Ca 300 mg L-1; Calciolid Ca-300), chelate-Ca 2000배 희석액 (Ca 100 mg L-1; Chelate-Ca 100), chelate-Ca 1000배 희석액 (Ca 200 mg L-1; Chelate-Ca 200), chelate-Ca 500배 희석액 (Ca 400 mg L-1; Chelate-Ca 400), Ge-132® 100배 희석액 (Ge 20 mg L-1; Ge 132®-20), Chelate-Ge 200배 희석액 (Ge 10 mg L-1; Chelate-Ge 10), Chelate-Ge 100배 희석액 (Ge 20 mg L-1; Chelate-Ge 20), Chelate-Ge 50배 희석액 (Ge 40 mg L-1; Chelate-Ge 40) 처리로 나누었다.
- 이를 4℃, 3,000 xg 조건에서 20분 동안 원심분리 후 얻어진 혈청을 연구시료로 사용하였다. 한우 혈액으로부터 분리한 혈청을 단백질 가수분해 효소인 alcalase, flavourzyme, esperase, protamex로 최적 조건에서 12시간 동안 각각 가수분해를 실시하였다. 기질대비 첨가한 효소량은 250:1, 500:1:, 1,000:1로 하였다.
- 유리 아미노산 분석은 충남대학교 공동실험실습관의 amino acid analyzer (HITACHI L-8900, Japan)을 활용하여 분석하였다. 혈청 가수분해 시료에 5% TCA (trichloroacetic acid)를 일정량 첨가하여 단백질 등의 간섭물질을 침전시킨 후 10,000 xg, 15분 원심 분리하여 상징액만을 사용하였다. 상징액은 유리 아미노산 표준시료와 유사한 농도로 희석하여 아미노산 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 공시작물 방울토마토 품종은 ‘로블리’를 이용하였고, 포장은 (주)바이오넬의 시설하우스를 이용하였으며 두둑너비 50 cm, 재식거리 50 cm, 한 처리구당 30주의 방울토마토를 정식하였다.
- 처리제는 혈청을 가수분해효소로 분해 후 한외여과 과정을 통해 얻은 펩타이드와 CaCl2를 킬레이트 결합한 chelate-Ca (CaO 20%), 리다코리아의 ‘Calciolid' (CaO 15%), 펩타이드와 유기 게르마늄인 Ge-132®를 킬레이트 결합한 chelate-Ge (Ge 2000 mg L-1), 물에 Ge-132®를 녹인 유기 게르마늄제 (Ge 2000 mg L-1)를 사용하였다.
- 펩타이드는 Asp, Glu, Leu을 주요 구성 아미노산으로 하는 한우 혈청을 단백질 분해효소로 분해 후 한외여과를 거쳐 제조하였다. 단백질 분해효소는 alcalase, esperase, flavourzyme, protamex를 이용하였고 alcalase가 가장 좋은 분해력을 나타내어 폡타이드 생산을 위한 혈청 분해에 활용하였다.
- 한우 혈액은 논산시 지산동 논산특별도축장에서 도축 즉시 멸균용기에 수거하여 4℃에서 24시간 동안 정치하였다. 이를 4℃, 3,000 xg 조건에서 20분 동안 원심분리 후 얻어진 혈청을 연구시료로 사용하였다.
데이터처리
- †Values within a column followed by the same letter are not significantly different at 5% level by Duncan’s multiple range test.
- 시험구 배치는 난괴법으로 3반복 하였으며, 자료분석은 Statistical Analysis System program (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분산분석 후 Duncan's multiple range test로 통계처리 하였다.
이론/모형
- 구성 아미노산 분석은 한국기초과학지원연구원의 fluorometric analysis system (Waters 510 HPLC Pump, Gradient Controller, 717 Automatic sampler, USA)을 활용하여 분석하였다. 혈청 100 μL을 취한 후 PICO-tag방법을 이용하여 hydrolysis 및 PITC labeling을 실시한 후 400 μL의 buffer에 녹여 그 중 10 μL을 취하여 분석에 사용하였다.
- 혈청 100 μL을 취한 후 PICO-tag방법을 이용하여 hydrolysis 및 PITC labeling을 실시한 후 400 μL의 buffer에 녹여 그 중 10 μL을 취하여 분석에 사용하였다.
성능/효과
- 이는 소 혈장 또는 혈청에 있어서 alcalase가 분해력이 우수하다는 것을 간접적으로 알 수 있다. Alcalase 250:1, 9.90 g L-1는 alcalase 500:1, 8.65 g L-1보다 높은 농도를 나타내었지만 효소 첨가량의 증가에 비해 유리 아미노산의 증가는 높지 않았고 주요 아미노산의 농도에서도 250:1과 500:1은 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서 가수분해 능력과 경제성을 모두 고려해 보았을 때 한우 혈청을 분해하기 위한 가장 우수한 효소와 첨가량은 alcalase 500:1로 판단하였다.
- Chelate Ca을 500, 1,000, 2,000배로 희석하여 방울토마토 재배에 적용한 결과, 처리 농도 및 횟수 증가에 따라 엽과 과실의 칼슘함량이 다소 증가하여 대조처리 Calciolid Ca-300 (3409.1, 67.5 mg kg-1)이 Chelate Ca-200 (3781.1, 78.0 mg kg-1) 보다 처리농도가 높음에도 불구하고 그 함량이 낮아 킬레이트 칼슘의 흡수율이 더 많았다. Chelate Ge을 50, 100, 200배로 희석하여 적용한 결과, 방울토마토 엽의 게르마늄 함량이 처리 농도가 높을수록 많아져 대조구와 Ge 132®-20 보다 모든 처리구에서 2배 이상의 높은 함량을 나타내었다.
- 0 mg kg-1) 보다 처리농도가 높음에도 불구하고 그 함량이 낮아 킬레이트 칼슘의 흡수율이 더 많았다. Chelate Ge을 50, 100, 200배로 희석하여 적용한 결과, 방울토마토 엽의 게르마늄 함량이 처리 농도가 높을수록 많아져 대조구와 Ge 132®-20 보다 모든 처리구에서 2배 이상의 높은 함량을 나타내었다. 본 연구를 통해 펩타이드와 킬레이트 결합한 칼슘과 게르마늄을 방울토마토에 시용할 경우 그 흡수율이 증가되는 것을 확인하였다.
- 다양한 단백질 가수분해 효소의 종류 및 기질 대비 첨가량에 따른 혈청 가수분해물의 유리 아미노산 농도는 Table 2에 나타내었다. 기질대비 효소 첨가량이 증가함에 따라 유리 아미노산의 농도는 증가하는 경향이 나타났고 혈청의 분해능은 alcalase, esperase, protamex, flavourzyme 순서로 높게 나타난다는 것을 간접적으로 알 수 있다. 다른 연구 결과에서도 소 혈장 단백질을 다양한 단백질 가수분해 효소로가수분해하여 얻어진 펩타이드의 수율을 확인한 결과 alcalase가 가장 높았다고 하였다 (Hyun et al.
- 65 g L-1보다 높은 농도를 나타내었지만 효소 첨가량의 증가에 비해 유리 아미노산의 증가는 높지 않았고 주요 아미노산의 농도에서도 250:1과 500:1은 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서 가수분해 능력과 경제성을 모두 고려해 보았을 때 한우 혈청을 분해하기 위한 가장 우수한 효소와 첨가량은 alcalase 500:1로 판단하였다.
- 10% 증가하였고 유의적인 차이를 나타내었다. 또한, 대조처리 Calciolid Ca-300 (3409.1, 67.5 mg kg-1)보다 Chelate Ca-200 (3781.1, 78.0 mg kg-1)는 처리농도가 낮음에도 불구하고 엽과 과실에 포함된 칼슘함량이 높아 킬레이트 칼슘의 흡수율이 더욱 우수한 것을 알 수 있다.
- Chelate Ge을 50, 100, 200배로 희석하여 적용한 결과, 방울토마토 엽의 게르마늄 함량이 처리 농도가 높을수록 많아져 대조구와 Ge 132®-20 보다 모든 처리구에서 2배 이상의 높은 함량을 나타내었다. 본 연구를 통해 펩타이드와 킬레이트 결합한 칼슘과 게르마늄을 방울토마토에 시용할 경우 그 흡수율이 증가되는 것을 확인하였다.
- 엽의 게르마늄 함량은 대조구 1.7 μg kg-1 에 비해 대조처리 Ge 132®-20은 25.0 μg kg-1 로 높은 함량을 나타내었지만 킬레이트 게르마늄 처리구 Chelate Ge-10, 20, 40에서 대조처리에 비해 106.8%, 157.2%, 221.2% 의 높은 게르마늄 함량을 나타내어 처리 간에 유의적인 차이를 나타내었다.
- 한우 혈청에 함유된 단백질의 아미노산 구성을 분석한 결과는 Table 1에 나타내었다. 한우 혈청 단백질은 Asp, Glu, Leu가 13.66, 11.29, 5.54 g L-1로 가장 높은 함유량을 나타내었고, 각각 19.7, 16.3, 8.0%에 해당하는 양이다. 이는 TCA로 침전시킨 돼지 혈장 단백질의 아미노산 분석결과 Asp, Glu, Leu 등이 가장 높은 함유량을 나타낸 것과 유사하다 (Park et al.
후속연구
- 4 μg kg-1임을 감안하면 하루 약 100 kg을 섭취해야 DDI 수준을 초과하므로 매우 안전한 수준으로 판단된다. 이는 안전성을 갖춘 게르마늄 농산물 생산을 위한 가능성을 보여주는 결과로서 앞으로 다양한 농산물에 대한 적용 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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