선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 실험에서는 PRRSV 감염 시 면역계의 중요 장기인 림프절에서 나타나는 변화상을 관찰하고자 하였다. 이 바이러스에 감염된 돼지에서는 육안적으로 림프절의 크기가 증가하고, 병리조직학적 병변으로 림프소절이 증식 또는 비대되는 특징을 나타낸다 [6, 7, 14].
- 본 연구는 PCV2 및 PRRSV에 감염된 자돈에서 림프절의 병변을 관찰하고, 면역조직화학염색(immunohistochemistry; IHC)을 통하여 각각의 바이러스 감염군에서 림프절을 구성하고 있는 세포의 분포 및 변화상을 비교함으로써 바이러스 감염과 숙주의 면역능과의 연관성을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 PCV2와 PRRSV가 감염된 돼지의 림프절 병변을 병리조직학적 및 면역조직화학염색을 통하여 검사하였다. PCV2에 감염된 돼지에서는 림프절 내 면역기능을 담당하는 림프구의 고갈로 인하여 림프절이 정상적인 기능을 수행하지 못하기 때문에 개체의 면역저하 현상이 유발되고 있는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 PCV2와 PRRSV에 감염된 돼지에서 림프절의 반응을 관찰하고, 림프절을 구성하고 있는 세포의 변화상을 확인하여 바이러스 감염에 따른 숙주의 면역력과의 관련성을 알아보고자 하였다. PCV2 단독감염군과 PCV2/PRRSV 혼합감염군에서는 림프절의 림프소절과 속겉질에 미만성으로 현저한 림프구 소실과 함께, 피질 및 수질부에 조직구와 다수의 다핵거대세포의 침윤이 관찰되었다.
제안 방법
- 2005년부터 2008년 4월 사이 제주도 소재 28개 양돈 농장으로부터 의뢰된 5~14주령의 돼지를 선정하였다. 각 개체의 병리조직학적 병변과 미생물검사를 통하여 진단을 하였고, 이들 개체에서 악하 및 서혜림프절 시료에 한하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 실시하였다 [4, 10]. 이 결과와 검사 대상 장기인 림프절의 조직 상태가 가장 좋고, 사후변화가 동반되지 않은 시료를 대상으로 PCV2 단독감염군 14두, PRRSV 단독감염군 10두, 두 바이러스 혼합감염군 14두로 세분하여 총 38두의 림프절을 실험에 공여하였다.
- 염색이 끝난 조직 슬라이드는 광학현미경으로 관찰하여 바이러스 항원의 분포를 확인하였다. 또한 각 세포의 분포 및 수적 변화를 확인하기 위한 방법으로 Shibahara 등 [19]의 보고를 참고하여 200배 시야에서 림프소절 4부위, 속겉질과 수질 각 3부위 등 총 10개 부위를 개체별로 동일하게 선택하여 세포 표지자에 양성인 세포의 수를 세고, 그 평균값을 비교하였다.
- 이 결과와 검사 대상 장기인 림프절의 조직 상태가 가장 좋고, 사후변화가 동반되지 않은 시료를 대상으로 PCV2 단독감염군 14두, PRRSV 단독감염군 10두, 두 바이러스 혼합감염군 14두로 세분하여 총 38두의 림프절을 실험에 공여하였다. 또한 연령대가 비슷하고 외관상 건강하며, 병리검사 및 미생물검사 결과 두 바이러스가 음성인 개체 6두를 음성대조군으로 추가하여 실험을 실시하였다.
- 림프절의 세포학적 변화상 조사: 각 실험군의 림프절에서 CD3, CD79α, lysozyme, S-100 항체를 이용하여 IHC를 수행하여 양성인 세포의 수를 비교하였다(Fig. 5).
- 반응이 끝난 후 PBS 수세를 거친 뒤 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Dako)로 발색하였으며, 대조염색은 Mayer hematoxylin (Sigma-Aldrich, USA)으로 염색하였다.
- 본 연구에서도 PCV2 감염이 입증된 림프절에 한하여 CD3, CD79α, lysozyme 및 S-100와 같은 세포 표지자를 사용하여 IHC를 수행하였고, 양성인 세포의 수적인 변화를 비교하였다.
- 반응이 끝난 후 PBS 수세를 거친 뒤 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; Dako)로 발색하였으며, 대조염색은 Mayer hematoxylin (Sigma-Aldrich, USA)으로 염색하였다. 염색이 끝난 조직 슬라이드는 광학현미경으로 관찰하여 바이러스 항원의 분포를 확인하였다. 또한 각 세포의 분포 및 수적 변화를 확인하기 위한 방법으로 Shibahara 등 [19]의 보고를 참고하여 200배 시야에서 림프소절 4부위, 속겉질과 수질 각 3부위 등 총 10개 부위를 개체별로 동일하게 선택하여 세포 표지자에 양성인 세포의 수를 세고, 그 평균값을 비교하였다.
- 의뢰된 돼지는 일반적인 절차에 따라 부검을 수행하여 육안 병변을 확인하였고, 악하림프절 및 서혜림프절을 채취한 뒤 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다. 고정된 조직은 통상적인 처리과정에 따라 파라핀 포매하여 3~4 µm로 절편을 제작한 후 hematoxylin-eosin 염색을 하였다.
대상 데이터
- 2005년부터 2008년 4월 사이 제주도 소재 28개 양돈 농장으로부터 의뢰된 5~14주령의 돼지를 선정하였다. 각 개체의 병리조직학적 병변과 미생물검사를 통하여 진단을 하였고, 이들 개체에서 악하 및 서혜림프절 시료에 한하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 실시하였다 [4, 10].
- 바이러스의 분포를 확인하기 위한 1차 항체로는 rabbit anti-PCV2 antibody(Iowa State University, USA) 및 mouse anti-PRRSV(SDOW17) antibody(South Dakota State University, USA)를 사용하였고, 림프절 내 T림프구, B림프구, 큰포식세포, 수지상세포에 대한 표지자로는 CD3(A0452; Dako), CD79α(M7051; Dako), lysozyme(A0099; Dako), S-100(Z0311; Dako)를 사용하였다 [19].
- 각 개체의 병리조직학적 병변과 미생물검사를 통하여 진단을 하였고, 이들 개체에서 악하 및 서혜림프절 시료에 한하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 실시하였다 [4, 10]. 이 결과와 검사 대상 장기인 림프절의 조직 상태가 가장 좋고, 사후변화가 동반되지 않은 시료를 대상으로 PCV2 단독감염군 14두, PRRSV 단독감염군 10두, 두 바이러스 혼합감염군 14두로 세분하여 총 38두의 림프절을 실험에 공여하였다. 또한 연령대가 비슷하고 외관상 건강하며, 병리검사 및 미생물검사 결과 두 바이러스가 음성인 개체 6두를 음성대조군으로 추가하여 실험을 실시하였다.
이론/모형
- 각 개체의 림프절에서 PCV2 및 PRRSV의 항원의 분포를 확인하고, 바이러스 감염에 따른 림프절에서의 세포학적 변화상을 확인하기 위하여 Envision polymer reagent(Dako, USA) 방법에 준하여 IHC를 수행하였다. 림프절 파라핀 조직을 4~5 µm 두께로 절편하여 silane 코팅 슬라이드에 부착한 후, 탈파라핀 및 함수과정을 거쳤으며, 조직 내 존재하는 peroxidase를 제거하기 위해 3% H2O2가 첨가된 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.
성능/효과
- PCV2에 감염된 개체의 림프절에서 림프구의 소실 이외에 주된 소견으로 조직구의 침윤을 확인할 수 있었다. Lysozyme 항체를 사용하여 침윤된 조직구가 큰포식세포 유래임을 입증하였고, 이 세포의 분포는 PCV2 항원이 위치하는 부위와도 대체로 일치하였다. 또한 다핵거대세포의 세포질에서도 lysozyme 양성을 보여 이 세포의 기원이 큰포식세포인 것으로 확인되었다.
- 각 실험군의 림프절에 대한 병리조직학적 검사 결과는 Table 1과 같다. PCV2 단독감염군 및 PCV2와 PRRSV 혼합감염군 개체 림프절의 경우 가장 주된 소견으로 림프구의 소실이 각각 10두(71.4%)에서 관찰되었으며, 그 부위에 조직구 및 다핵거대세포의 침윤을 특징으로 하는 육아종성 림프절염이 각각 12두(85.7%)에서 확인되었다(Fig. 2). 림프절 피질부의 림프소절과 속겉질 부위의 림프구는 현저히 소실되고, 수질부에는 조직구의 침윤으로 피질과 수질의 경계가 불명확하였다.
- 본 연구에서는 PCV2와 PRRSV에 감염된 돼지에서 림프절의 반응을 관찰하고, 림프절을 구성하고 있는 세포의 변화상을 확인하여 바이러스 감염에 따른 숙주의 면역력과의 관련성을 알아보고자 하였다. PCV2 단독감염군과 PCV2/PRRSV 혼합감염군에서는 림프절의 림프소절과 속겉질에 미만성으로 현저한 림프구 소실과 함께, 피질 및 수질부에 조직구와 다수의 다핵거대세포의 침윤이 관찰되었다. 반면 PRRSV 단독감염군에서는 항원에 대한 림프절의 반응으로 B와 T림프구 영역이 증가하는 소견을 나타내었다.
- 본 실험에서는 T림프구에 대한 범 표지자인 CD3를 사용하였기 때문에 각각의 T림프구 변화상을 확인할 수는 없었지만, 정상군에 비해 림프소절과 속겉질 두 영역 모두에서 T림프구가 감소되는 소견을 확인하였다. PCV2에 감염된 개체의 림프절에서 림프구의 소실 이외에 주된 소견으로 조직구의 침윤을 확인할 수 있었다. Lysozyme 항체를 사용하여 침윤된 조직구가 큰포식세포 유래임을 입증하였고, 이 세포의 분포는 PCV2 항원이 위치하는 부위와도 대체로 일치하였다.
- 5). T림프구의 경우 세 군 모두 정상군과 비교하여 유의성 있는 차이는 없었으나, PCV2 단독감염군, 혼합감염군에서는 정상군에 비해 다소 감소하는 반면 PRRSV 단독감염군에서는 속겉질의 림프구가 증가하는 경향을 나타내었다. B림프구는 세 군 모두 정상군에 비해 감소하였고, 특히 PCV2 단독감염군과 혼합감염군에서 유의성 있게 감소하고 있음을 나타내었다(Fig.
- PCV2에 감염된 돼지에서는 림프절 내 면역기능을 담당하는 림프구의 고갈로 인하여 림프절이 정상적인 기능을 수행하지 못하기 때문에 개체의 면역저하 현상이 유발되고 있는 것으로 사료된다. 그러나 PRRSV에 감염된 돼지에서는, 일반적인 항원 자극에 의한 림프절의 B와 T림프구 영역이 증가하는 양상을 보이는 경우와 거의 유사한 병변이 가장 주된 변화상으로 확인되었다. 돼지에서 PRRSV 감염으로 인한 개체의 면역억제 현상을 림프절 병변만을 토대로 설명하기에는 큰 무리가 있는 상황이다.
- 3), 이러한 소견은 속겉질에서도 확인되었다. 대조군을 제외한 세 군 모두에서 림프절의 응고괴사소견을 확인하였고, 분포는 국소성에서부터 광범위한 다발성까지 매우 다양하게 관찰되었다(Fig. 4).
- 본 실험에서도 PRRSV에 단독감염된 10두 중 5두(50%)에서 림프소절의 증식과 비대 소견을 나타내었다. 또한 각 세포에 대한 변화를 살펴본 결과, T림프구 영역은 정상군에 비해 증가함을 확인하였다. 그러나 B림프구 영역인 림프소절의 직경은 정상군에 비해 넓게 관찰되는 반면(data not shown) CD79α에 양성을 나타내는 B림프구는 적게 관찰되었다.
- Lysozyme 항체를 사용하여 침윤된 조직구가 큰포식세포 유래임을 입증하였고, 이 세포의 분포는 PCV2 항원이 위치하는 부위와도 대체로 일치하였다. 또한 다핵거대세포의 세포질에서도 lysozyme 양성을 보여 이 세포의 기원이 큰포식세포인 것으로 확인되었다.
- 이와 관련하여, 최근 연구자들은 PCV2에 감염된 돼지의 림프절과 말초혈액에서 IHC 및 유세포분석(flow cytometry)을 통하여 B 및 T림프구의 현저한 소실과 수지상세포의 감소를 보고하였다 [5]. 또한 림프절 병변에서 IHC 및 제자리부합법(in situ hybridization)을 활용하여 PCV2 항원의 분포를 검사한 결과, 주로 조직 내 침윤되어 있는 큰포식세포 및 항원제시세포에 감염된다는 사실을 확인하였다. 더욱이 조직 내 감염된 PCV2 항원의 양이 많을수록 병변의 정도가 심하다는 것을 보고하였다.
- 6). 반면, 큰포식세포는 세 군 모두 정상군과 비교하여 증가하였고, 특히 PCV2 단독감염군에서 현저히 증가하였다. 림프절 내 침윤된 다핵거대세포의 세포질에서도 lysozyme 양성반응을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 본 실험에서 B림프구뿐만 아니라, T림프구도 일정 정도 감소하는 결과를 나타내었다. Darwich 등 [5]과 Segalés 등[16]은 CD4+, CD8+ 표지자를 사용하여 PCV2 감염에 따른 조력 T림프구와 세포독성 T세포의 변화를 관찰한 결과, CD4+ T림프구는 현저히 저하되는 반면, CD8+ T림프구는 약간 감소한다는 결과를 보고하였다.
- 그러나 일부 실험에서 말초혈액을 대상으로 세포의 변화상을 관찰하였을 때, CD4+ T림프구는 PCV2 감염에 관계없이 위축된 돼지 개체에서 감소되는 소견을 나타내었고, CD8+세포는 PCV2에 감염된 개체에서 감소하는 경향을 보여 PCV2와 관련되는 세포는 CD8+ T림프구인 것으로 보고하였다 [5]. 본 실험에서는 T림프구에 대한 범 표지자인 CD3를 사용하였기 때문에 각각의 T림프구 변화상을 확인할 수는 없었지만, 정상군에 비해 림프소절과 속겉질 두 영역 모두에서 T림프구가 감소되는 소견을 확인하였다. PCV2에 감염된 개체의 림프절에서 림프구의 소실 이외에 주된 소견으로 조직구의 침윤을 확인할 수 있었다.
- 세포 수준에서 림프절의 병리조직학적 소견을 관찰하였을 때 B림프구 영역뿐만 아니라, CD8+ T림프구의 증가를 나타내어 속겉질 영역 또한 증가함을 보고하였다 [7, 9]. 본 실험에서도 PRRSV에 단독감염된 10두 중 5두(50%)에서 림프소절의 증식과 비대 소견을 나타내었다. 또한 각 세포에 대한 변화를 살펴본 결과, T림프구 영역은 정상군에 비해 증가함을 확인하였다.
- 7). 수지상세포는 정상군에 비해 세 군 모두 유의성 있게 감소되는 양상을 보였으나, 바이러스에 감염된 세 군 간에서의 뚜렷한 차이는 관찰되지 않았다.
- 조직 내 PCV2 및 PRRSV 항원분포 조사: PCV2 및 PRRSV 특이 항체를 이용하여 림프절 내 항원의 분포를 조사한 결과, 두 바이러스 모두 림프절 내에 침윤된 조직구의 세포질에서 강한 양성 반응을 나타내었다. PCV2의 경우 조직구 뿐만 아니라, 다핵거대세포의 세포질에서도 강한 양성반응을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서도 PCV2 감염이 입증된 림프절에 한하여 CD3, CD79α, lysozyme 및 S-100와 같은 세포 표지자를 사용하여 IHC를 수행하였고, 양성인 세포의 수적인 변화를 비교하였다. 큰포식세포를 제외한 B 및 T림프구와 수지상세포는 모두 정상군에 비하여 감소하였으며, 특히 B림프구가 가장 현저한 감소를 보였고 일부 개체에서는 B림프구가 전혀 나타나지 않는 경우도 있었다. B림프구가 현저히 소실된 부위에서는 lysozyme에 양성반응을 보이는 큰포식세포와 다핵거대세포의 비율이 높게 나타났다.
후속연구
- 그러나, 최근 Lin 등 [11]은 조직 내 바이러스 항원의 양이 많고 병변이 심할수록 림프구의 자멸사 소견이 많이 나타난다는 연구결과를 발표하였다. 따라서 아직까지도 PCV2 감염으로 인한 림프구 소실의 기전은 명확하게 밝혀지지 않아 이에 대한 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.