선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- , 2005) 황기 추출물을 이용한 관절건강개선 기능성 원료의 개발을 추진하고 있다. 본 연구에서 황기의 적정 추출물 제조방법 평가 및 지표성분의 분석법 검증을 통해 원료 표준화의 기초자료를 확보하고자 하였다.
- 본 연구의 주요 목표 중 하나는 향후 황기의 기능성 원료를 개발한 후 황기 원료의 건강기능식품에 대한 품질관리를 위한 적절한 지표성분의 설정이다.
제안 방법
- Calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside은 50-40,000 ng mL-1, calycosin은 25-10,000 ng mL-1 농도범위에서 HPLC 분석을 하여 회귀식을 구하고 linearity를 검증하였다.
- HPLC 분석은 Thermo Scientific사의 Thermo Hypersil (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하여 30℃에서 실시하였다.
- 그러나 isomucronulatol-7-O-β-D-glucoside은 아직까지 시중에서 구입이 용이하지 않은 점과 230 ㎚에서 HPLC 분석시 황기 추출물 시료중 calycosin이 formonetin 보다는 더 peak 면적이 큰 주요성분으로 검출되는 점을 고려하여 본 연구에서는 calycosin-7-O-β-D-glucoside과 calicosin 두 물질이 관절건강 개선을 위한 황기 기능성 원료의 주요 기능성 물질로 적합하다고 판단하여 품질 관리를 위한 지표성분으로 설정하였다 (Fig. 1).
- 이러한 결과는 이 HPLC 분석법이 황기 추출물의 두 지표성분의 함량분석을 위한 정확도와 정밀도가 높은 방법임을 검증하는 것이다. 따라서 이러한 검증된 HPLC 방법으로 황기 추출물의 지표성분을 분석하여, 최적의 황기 추출조건을 설정하는 데 활용하였다. Kim 등 (2007)은 Astragali radix의 70% ethanol 추출물에서 주요 isoflavonoid 성분으로 calycosin-7-O-β-D-glucoside, isomucronulatol-7-Oglucoside, formononetin를 제시하고 HPLC/UV 분석 조건을 대해 보고한 바 있다.
- 본 연구에서는 추출조건별 황기 주정추출물에 대한 주요성분의 함량을 분석하기 위해 calycosin-7-O-βD-glucopyranoside, calycosin 두 성분만 지표성분으로 최종 설정하여 표준정량곡선을 작성하였다.
- 황기 건시료는 절편 모양으로 약 2~4 ㎜ 정도의 굵기로 절단되어 포장되어 있었다. 시제품을 생산하거나 대량으로 추출물을 제조하는 경우와 유사한 추출조건을 설정하기 위해 황기 건시료를 조분쇄하지 않고 구입상태인 수확후 1차 가공건조된 절단 건시료를 에탄올 (EtOH)로 추출 하였다.
- 추출물은 여과지로 여과하였으며, 잔사에 2L의 주정을 다시 넣고 각각 동일한 조건으로 4일씩 2, 3회 추가로 추출 및 여과를 하였다. 여과한 황기 주정 추출물은 모두 감압 농축한 후 총 수율을 계산하고 건조 추출물은 지표성분 정량분석용 시료로 사용하였다. 환류추출은 절단된 황기 건시료 200 g에 2L의 주정을 둥근 플라스크에 넣고 85℃에서 4시간 동안 환류관을 연결하여 환류추출하였다.
- 상온추출은 절단된 황기 건시료 200 g에 2 L의 주정을 삼각 플라스크에 넣고 상온에서 5일 동안 100 rpm에서 진탕추출하였다. 추출물은 여과지로 여과하였으며, 잔사에 2L의 주정을 다시 넣고 각각 동일한 조건으로 4일씩 2, 3회 추가로 추출 및 여과를 하였다. 여과한 황기 주정 추출물은 모두 감압 농축한 후 총 수율을 계산하고 건조 추출물은 지표성분 정량분석용 시료로 사용하였다.
- 추출조건별 수율 및 성분 정량분석은 3회 반복으로 실시하고, 모든 값은 mean ± SD 값으로 나타내었다.
- Calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside은 50-40,000 ng mL-1, calycosin은 25-10,000 ng mL-1 농도범위에서 HPLC 분석을 하여 회귀식을 구하고 linearity를 검증하였다. 하루 동안 3종의 농도조건에서 지표성분 표준품에 대하여 5회 분석하여 intra-day precision를 평가하고, 또 5일 동안 반복적으로 분석하여 inter-day precision를 각각 평가하여 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy)를 조사함으로써 분석법의 재현성 (reproducibility)을 검증하였다.
- 45 ㎛ membrane filter로 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다. 한편, 주피를 벗긴 황기와 벗기지 않고 건조한 황기 시료에서의 지표성분 함량을 단순 비교하기 위해 50% MeOH를 사용하여 초음파 추출하였다. 이때 황기는 분쇄한 분말시료를 사용하였는데, 60 ㎎에 50% MeOH 1.
- 환류추출은 절단된 황기 건시료 200 g에 2L의 주정을 둥근 플라스크에 넣고 85℃에서 4시간 동안 환류관을 연결하여 환류추출하였다. 환류추출도 상온추출과 마찬가지로 1회 환류추출과 동일한 방법으로 총 3회 4시간씩 추출한 후 여과하여 감압농축하고 총수율을 계산하였다. 준비된 각각의 건조 추출물은 10 ㎎을 1 mL의 50% MeOH에 녹여 0.
- 황기 기능성 원료 개발을 위한 추출물 제조공정의 추출조건을 검토하기 위해 주피를 벗긴 황기 건재 시료에 30, 50, 95% 주정을 사용하여 상온추출과 환류추출로 진행하였다. 상온추출은 절단된 황기 건시료 200 g에 2 L의 주정을 삼각 플라스크에 넣고 상온에서 5일 동안 100 rpm에서 진탕추출하였다.
- T Baker®, Nederland)를 사용하였고 그 외 황기의 추출에는 주정 (대한수정라이프, 한국)을 사용하였다. 황기 지표성분 정량 분석에는 Agilent 1100 series HPLC system (Agilent Technolgies, USA)을 사용하였다. 그 외 기타 시약은 Sigma Chemical Co.
- 또한 주피를 벗긴 황기시료와 주피를 벗기지 않은 황기시료의 지표성분 정량분석을 위한 시료는 제천 농가에서 재배하여 건조한 1년근 황기를 구입하여 사용하였다. 황기의 기원확인을 위해 식물분류 전문가인 농촌진흥청 국립원예특작과학원의 이정훈 박사가 본 실험에 사용한 황기 시료에 대한 정확한 식물 분류 동정을 하였다. 황기 건시료는 절편 모양으로 약 2~4 ㎜ 정도의 굵기로 절단되어 포장되어 있었다.
대상 데이터
- Acetonitrile은 HPLC급 용매 (J. T Baker®, Nederland)를 사용하였고 그 외 황기의 추출에는 주정 (대한수정라이프, 한국)을 사용하였다.
- MeOH와 DMSO를 혼합하여 50% DMSO 용액을 만들어, 표준정량곡선 작성을 위한 지표성분들의 표준용액을 제조하였다. Calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside은 50-40,000 ng mL-1, calycosin은 25-10,000 ng mL-1 농도범위에서 HPLC 분석을 하여 회귀식을 구하고 linearity를 검증하였다.
- 황기 추출조건의 검토를 위한 황기시료는 주피가 벗겨진 1년 근 건시료로서 2011년 제천에서 재배하여 가을에 수확한 것을 2011년 12월에 한국생약협회를 통해 구입하였다. 또한 주피를 벗긴 황기시료와 주피를 벗기지 않은 황기시료의 지표성분 정량분석을 위한 시료는 제천 농가에서 재배하여 건조한 1년근 황기를 구입하여 사용하였다. 황기의 기원확인을 위해 식물분류 전문가인 농촌진흥청 국립원예특작과학원의 이정훈 박사가 본 실험에 사용한 황기 시료에 대한 정확한 식물 분류 동정을 하였다.
- 황기 추출물의 성분분석에 사용한 calycosin-7-O-β-Dglucopyranoside, calycosin 및 formononetin 성분은 (Fig. 1) ChromaDex사 (ChromaDex®, Inc., USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 황기 추출조건의 검토를 위한 황기시료는 주피가 벗겨진 1년 근 건시료로서 2011년 제천에서 재배하여 가을에 수확한 것을 2011년 12월에 한국생약협회를 통해 구입하였다. 또한 주피를 벗긴 황기시료와 주피를 벗기지 않은 황기시료의 지표성분 정량분석을 위한 시료는 제천 농가에서 재배하여 건조한 1년근 황기를 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험값의 통계처리 및 유의성 검정은 SAS (Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하여 분산분석 (ANOVA)과 Duncan’s multiple range test로 유의성을 검증하였으며, 각 처리구간의 최소유의차 (p < 0.05) 수준에서 통계처리하였다.
성능/효과
- Calycosin-7-O-βD-glucoside 함량은 30, 50% 주정 환류 추출물에서 각각 1,738.2 ± 108.7, 1,700.3 ± 30.4 ㎍ g-1로서 30, 50% 주정 상온 추출물 및 95% 주정 환류 추출물의 731.9 ± 27.3, 1,041.0 ± 21.4, 1,152.1 ± 37.6 ㎍ g-1보다 유의성 있게 높은 경향이었다.
- Calycosin의 함량은 95% 주정 환류 추출물이 932.1 ± 12.4 ㎍ g-1 로서 가장 높았으며, 50% 주정으로 상온, 환류 추출한 것이 30% 주정으로 상온, 환류 추출한 것보다 유의성 있게 calycosin 함량이 높았다.
- Intra-day와 inter-day 정밀도는 RSD값으로 calycosin-7-O-βD-glucopyranoside는 각각 0.09-0.19%, 0.44-0.62%였으며, calycosin은 0.14-1.10%, 0.32-0.84%로 나타났다.
- Intra-day와 inter-day 정확도는 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside는 각각 101.2-102.4%, 100.8-101.0%였으며, calycosin은 100.3-101.3%, 99.9-101.6%로 나타났다.
- 두 지표성분의 검출한계농도 (LOD, S/N > 3)는 모두 50 ng mL-1 로서 매우 감도가 높았다.
- 이러한 결과는 이 HPLC 분석법이 황기 추출물의 두 지표성분의 함량분석을 위한 정확도와 정밀도가 높은 방법임을 검증하는 것이다.
- 즉 calycosin이 calycosin-7-O-β-D-glucoside 성분과는 달리 비극성 용매에서 더 많이 추출된 결과이다. 이상의 결과를 토대로 추출수율과 지표성분의 함량을 고려할 때, 황기시료에 대한 최적의 추출조건은 50% 주정을 이용한 환류추출인 것으로 판단된다.
- 주피를 벗긴 황기 미세분말시료를 초음파 추출한 것이 calycosin-7-O-β-D-glucoside, calycosin 지표성분 함량이 각각 142.2 ± 7.1, 118.9 ± 2.4 ㎍ g-1으로서 주피를 벗기지 않은 황기 추출물보다 더 함량이 높았다.
- 추출수율이 가장 높았던 50% 주정 환류 추출물 중 calycosin-7-O-β-D-glucoside, calycosin 함량은 각각 1,700.3 ± 30.4, 443.6 ± 8.4㎍ g-1 이었다.
- 추출조건별 황기 추출물의 수율을 조사한 결과 (Table 1), 95% 주정 환류 추출을 제외한 추출방법에서는 유의적인 차이가 인정되지 않았지만 50% 주정으로 환류추출한 것이 27.27 ± 2.27% 로서 추출수율이 가장 높은 경향이었다.
- 황기의 주요성분을 정량하기 위한 HPLC 분석조건을 검토한 결과에서는 Thermo Hypersil (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛) 컬럼을 사용하여 HPLC 분석할 때, Fig. 2에서와 같이 calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosin, formononetin 등 주요 isoflavonoid 성분의 RT값이 각각 10.3, 18.6, 25.6분으로 분리능이 양호하였다.
후속연구
- 다만, 인체적용시험을 통해 그 유효성이 입증되어야 기능성 원료로서 인정이 가능하다. 본 연구에서 확립하고 검증한 최적의 황기 추출방법과 HPLC 분석법은 관절건강 개선 기능성 원료 개발을 위한 인체적용시험용 식품 (건조 추출물 분말) 제조를 위한 제조공정 설정 및 원료표준화를 위한 기초자료로서 활용 가치가 높을 것으로 기대된다.
- membranceus에서 추출한 추출물도 유사한 flavonoid 성분을 함유한다고 보고하고 있어 Kim 등(2007)의 보고와는 다소 다른 HPLC 패턴을 보이고 있다. 이상의 결과로 보아, Astragali radix의 기원식물을 명확히 분류하고 동정하여 연구재료로 사용하는 것이 매우 중요하며, 향후 중국의 A. mongholicus에 대해서도 시료를 구입하여 본 연구에서 최적화한 HPLC 분석 조건으로 주요 flavonoid 성분을 비교분석함으로써 기원식물별 지표성분 설정을 검토할 필요성이 있다고 판단된다.
- 4 ㎍ g-1으로서 주피를 벗기지 않은 황기 추출물보다 더 함량이 높았다. 인삼의 경우 triterpenoid 성분인 진세노사이드 화합물이 근피에 많이 존재하기 때문에 근피비율이 높은 세근이 동체보다 단위중량당 진세노사이드 함량이 높게 측정되는 것을 감안하면, 황기의 astragalosides 성분과 같은 triterpenoid 성분은 주피를 벗기지 않은 황기에서 더 많이 검출될 가능성도 있으므로 향후 이러한 triterpenoid 사포닌 성분 분석도 황기 품질평가를 위해 필요할 것이다. 우리가 주로 식품원료로 사용하는 황기 (Astragali radix)는 1년생 황기의 주피를 거의 벗긴 뿌리인데, 일부 제품에서는 주피를 벗기지 않은 황기를 사용하는 경우도 있다.
- 한편, 한약재나 생약으로 사용되는 황기는 주로 다년생 3년근을 껍질을 벗긴 것과 껍질을 벗기지 않은 것 모두를 사용 가능하도록 되어 있다. 황기를 식품으로 대량 사용할 경우에는 인체 독성이나 안전성이 더욱 중요해지는데, 약효성분들이 근피 (뿌리 껍질)에도 많이 분포하는 경우가 있으므로 황기의 뿌리를 벗기거나 벗기지 않은 시료에 대한 성분 및 효능, 안전성에 대한 검토도 향후 필요할 것을 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.