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문제 정의
- , 2008), 「한국산업표준 (KS)」와「건강기능식품의 기준 및 규격」에서 사용되고 있는 추출법은 시료와 용매의 양이 많이 필요하며 특히 건강기능식품의 기준 및 규격에서는 환류추출 방법을 사용하여 실험 시간이 길며 실험하는 과정이 복잡하다. 따라서 본 연구에서는 짧은 시간 안에 다양한 ginsenoside의 분리능이 양호한 분석법을 확립하고, 동시에 기존의 공정서에 제시한 추출방법과 비교하여 인삼의 주요성분인 ginsenoside를 보다 더 효율적으로 추출할 수 있는 새로운 방법을 제시하고자 하였다.
- 초고압 추출의 경우는 고가의 초고압 추출장비가 필요한 점을 고려할 때, 비교적 간편한 초음파 추출이 품질분석을 위한 소량 시료 추출방법으로는 적합할 것으로 판단된다.선행연구에서 추출 용매 및 조건별 인삼의 ginsenoside 성분의 추출효율을 비교하여 초음파추출 효율성에 대해 보고하였는데(Kim et al., 2008), 이는 본 연구의 추출 조건 확립에 바탕이 되었다. Method A와 기존 공정서상의 추출법에 기초한 method B, C를 이용하여 백삼시료 2종 (white ginseng 1, 2) 을 추출한 후 ginsenoside를 새로운 HPLC 방법으로 분석한 결과, white ginseng 1에서 각각 추출물의 분리능은 Fig.
제안 방법
- 80 - 100 mesh로 분쇄한 인삼 건조 시료 1g을 원심분리 튜브에 평량해 담고 10 ㎖ 50% MeOH을 넣고 균질하게 혼합후 80℃의 환류냉각추출기에서 1시간 냉각추출 하였다. 방냉 후 원심분리 (3000 rpm, 10분)한 다음 상징액을 환저플라스크에 취한 후 위와 같은 방법으로 잔류물에 추출을 1회 더 반복하였다.
- Ginsenoside Rb1, Rg1를 비롯한 총 10종의 ginsenoside 동시분석법인 새롭게 제안한 HPLC 분석법의 재현성을 검토하기 위해 각 성분에 대한 3종의 농도조건을 하루 동안 5회 분석 (intra-day) 및 5일 동안 반복 분석 (inter-day)으로 정밀도(precision) 및 정확도 (accuracy)는 각각 상대표준오차 값과 회수율로서 구하여 Table 2에 나타내었다. Intra-day 정밀도는 5.
- HPLC 분석은 Advanced Materials Technology사의 Halo® RP-Amide (4.6 × 150 ㎜, 2.7 ㎛, Wilmington, DE, USA) 컬럼을 사용하여 50℃에서 실시하였다.
- 지표성분 표준품에 대하여 3종의 농도조건을 5일 동안 반복 분석하여 inter-day precision를 평가하고, 또한 연속으로 5회 분석하여 intra-day precision를 평가하여 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy)를 구함으로써 재현성 (reproducibility)을 검증하였다. 각 ginsenoside 성분에 대한 최저 검출한계농도 (LOD), 최저 정량한계농도 (LOQ)는 표준정량곡선을 작성한 후 자동계산 되어지는 시그널 (S) 대비 노이즈 (N) 값인 S/N 값에서 각각 S/N 값이 3, 10일때의 농도로서 구하였다.
- 기존 공정서상의 추출법인 KS 추출법 및 건강기능식품의 기준 및 규격의 추출법에 기초한 각각의 시료 추출 및 전처리법 method B, C는 1g의 시료와 10 ㎖의 용매를 사용하여 인삼시료를 추출하였는데, 새로운 시료 추출 및 전처리법인 method A는 0.2 g의 시료와 2 ㎖의 추출용매를 사용하였다. Method A는 method B와 같은 초음파 추출법을 사용하여 추출을 하였지만 초음파 추출시 온도를 50℃로 설정해 주었다는 차이가 있으며, method C 방법보다는 추출방법이 간단하다.
- 환저플라스크에 옮긴 상징액을 50℃ 수조에서 rotary evaporator를 이용하여 진공농축하였다. 농축물을 증류수 2 ㎖ 에 용해 한 후 가온 초음파 추출법과 동일하게 SPE 전처리 과정을 거친 후 0.45 ㎛ membrane filter로 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다.
- HPLC 분석법 validation 결과는 새로운 HPLC 분석법이 인삼의 주요 ginsenoside 성분의 정량 분석에 적합하고 재현성이 우수한 방법임을 입증하였다. 따라서 새로운 HPLC 분석법을 이용한 인삼의 주요 ginsenoside 성분의 분석을 통해 인삼 사포닌 추출법, method A, B, C를 비교하여 새롭게 개선된 추출조건을 제시하는데 활용하였다.
- 새롭게 제안한 HPLC 분석법의 분석 조건을 validation 하기 위해, 2.5 - 80 ngㆍ㎕−1 농도 범위내에서 HPLC 분석하여 회귀식과 상관계수를 각각 구하였다.
- 새롭게 확립한 가온 초음파 추출조건을 비롯하여 KS법의 추출조건 및 건강기능식품의 기준 및 규격의 추출조건에 의해 추출된 추출물은 모두 Sep-pak Plus C18 cartridge (Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 solid phase extraction (SPE) 전처리한 후 membrane filter 여과하여 HPLC 분석시료로 사용하였다.
- 인삼의 주요 ginsenoside 성분을 정량하기 위한 새로운 HPLC 조건을 설정하기 위해, 50℃에서 Halo® RP-Amide (4.6 × 150 ㎜, 2.7 ㎛, DE, USA) 컬럼을 사용하여 acetonitrile과 H2O 혼합용매로 기울기 용리하여 Fig. 1에서와 같이 ginsenoside Re, Rg1, Rf, Rb1, Rg2, Rh1, Rc, Rb2, Rb3, Rd의 분리능이 양호한 분석조건을 확립하였다.
- 25 - 80 ngㆍ㎕−1 농도 범위에서 HPLC 분석을 하여 회귀식을 구하고 linearity를 검증하였다. 지표성분 표준품에 대하여 3종의 농도조건을 5일 동안 반복 분석하여 inter-day precision를 평가하고, 또한 연속으로 5회 분석하여 intra-day precision를 평가하여 정밀도 (precision) 및 정확도 (accuracy)를 구함으로써 재현성 (reproducibility)을 검증하였다. 각 ginsenoside 성분에 대한 최저 검출한계농도 (LOD), 최저 정량한계농도 (LOQ)는 표준정량곡선을 작성한 후 자동계산 되어지는 시그널 (S) 대비 노이즈 (N) 값인 S/N 값에서 각각 S/N 값이 3, 10일때의 농도로서 구하였다.
- 80 - 100 mesh로 분쇄한 인삼 건조 시료 1g을 원심분리 튜브에 평량해 담고 10 ㎖ 50% MeOH을 넣고 균질하게 혼합후 초음파추출기 (Powersonic 410, Hwashin Tech, Daegu, Korea)에서 30분간 추출한다. 추출 후 원심분리 (3000 rpm, 10분)하여 상징액 1 ㎖는 가온 초음파 추출법과 동일하게 SPE 전처리 과정을 거친 후 0.45 ㎛ membrane filter로 여과하여 HPLC분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 인삼 추출물의 성분분석에 사용한 ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1 성분은 ChromaDex사 (Irvine, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. HPLC 이동상용매인 MeOH과 acetonitrile은 HPLC급 Merck사 (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 인삼 지표성분 정량 분석에는 Agilent 1100 series HPLC system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다.
- 분석에 사용한 인삼시료는 2개소에서 구입한 피부직삼 건시료로 금산에서 재배하여 수확한 4년근 시료를 사용하였고, 추출조건에 따른 함량 비교를 위해 건시료를 80 - 100 mesh로 분쇄하여 추출에 사용하였다.
- 인삼 추출물의 성분분석에 사용한 ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1 성분은 ChromaDex사 (Irvine, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. HPLC 이동상용매인 MeOH과 acetonitrile은 HPLC급 Merck사 (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- Ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1은 1.25 - 80 ngㆍ㎕−1 농도 범위에서 HPLC 분석을 하여 회귀식을 구하고 linearity를 검증하였다.
- 결과 값에 대한 통계처리는 SAS Enterprise guide 4.3 프로그램 (Cary, NC, USA)을 사용하여, 분산분석 (ANOVA)과 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 p < 0.05 수준에서 평균간의 유의적인 차이를 검증하였다.
이론/모형
- HPLC 이동상용매인 MeOH과 acetonitrile은 HPLC급 Merck사 (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 인삼 지표성분 정량 분석에는 Agilent 1100 series HPLC system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다.
성능/효과
- 37 ㎎ㆍℓ−1 로서 본 연구의 분석법보다는 저농도까지 검출이 가능하였으나, 회수율은 89 -118%로서 본 연구의 분석법보다는 정확도와 정밀도가 다소 떨어지는 경향이었다. HPLC 분석법 validation 결과는 새로운 HPLC 분석법이 인삼의 주요 ginsenoside 성분의 정량 분석에 적합하고 재현성이 우수한 방법임을 입증하였다. 따라서 새로운 HPLC 분석법을 이용한 인삼의 주요 ginsenoside 성분의 분석을 통해 인삼 사포닌 추출법, method A, B, C를 비교하여 새롭게 개선된 추출조건을 제시하는데 활용하였다.
- , 2008), 이는 본 연구의 추출 조건 확립에 바탕이 되었다. Method A와 기존 공정서상의 추출법에 기초한 method B, C를 이용하여 백삼시료 2종 (white ginseng 1, 2) 을 추출한 후 ginsenoside를 새로운 HPLC 방법으로 분석한 결과, white ginseng 1에서 각각 추출물의 분리능은 Fig. 2와 같았으며, white ginseng 1, 2의 ginsenoside 함량은 Fig. 3과 같았다. White ginseng 1, 2를 method A 방법으로 추출한 결과, 각각 ginsenoside Rg1은 0.
- White ginseng 1, 2를 method A 방법으로 추출한 결과, 각각 ginsenoside Rg1은 0.274 ± 0.003, 0.271 ± 0.0102%,Rb1은 0.283 ± 0.004, 0.252 ± 0.011%를 나타내었고, method B 방법으로 추출한 결과, 각각 ginsenoside Rg1은 0.276 ± 0.004, 0.252 ± 0.010%, Rb1은 0.229 ± 0.008, 0.163 ±0.005%를 나타내었으며, method C 방법으로 추출한 경우는 각각 ginsenoside Rg1은 0.245 ± 0.004, 0.248 ± 0.002%, Rb1은 0.257 ± 0.003, 0.244 ± 0.005%를 나타내었다.
- White ginseng 1, 2의 total ginsenoside의 함량은 method A 방법로 추출시 각각 1.187 ± 0.006%, 1.133 ± 0.037%, method B 방법으로 추출시 각각 1.078 ± 0.028%, 0.943 ± 0.027%, method C 방법으로 추출시 각각 1.056 ± 0.014%, 1.054 ± 0.017%를 나타내었는데, white ginseng 1, 2 시료 모두 method A 방법을 적용한 것이 다른 두 추출, 전처리 방법을 적용한 것보다 유의성 있게 높은 함량을 보였다.
- 이상의 결과들로부터, 새롭게 확립된 새로운 HPLC 분석방법이 기존의 KS 또는 건강기능식품의 기준 및 규격과 같은 공정서에서 제시하는 ginsenoside 분석방법과 비교하여 ginsenoside를 보다 신속하게 분석, 정량 할 수 있는 분석방법이었으며, 또한 새로운 가온 초음파 추출법은 두 공정서에 제시한 추출법 보다 ginsenoside 추출효율이 증진되어 ginsenoside 함량이 유의성있게 높거나 비슷한 경향을 나타내었다. 더욱이 새로운 추출방법은 시료와 용매의 양을 절감할 수 있고 실험 방법이 간단하여 높은 재현성을 기대할 수 있을 뿐 아니라 분석시간을 단축할 수 있는 장점이 있는 것으로 판단되었다. 현재 인삼 산업법에 근거하여, 인삼 (백삼)의 품질검사를 위한 지표성분으 로 ginsenoside Rb1, Rg1의 함량기준이 각각 0.
- 48% 범위를 나타내었다. 또한 inter-day 정밀도와 정확도는 각각 0.36 - 2.11%, 93.58 - 05.64 범위로 측정되었다 (Table 2). Intra-day와 inter-day 결과는 주어진 농도 범위 내에서 약 15%를 벗어나지 않는 정확성을 보여주었다.
- 즉, 현재 인삼 성분 검사시 추출방법으로 사용되는 방법 중에서, KS 추출방법 보다는 건강기능식품의 기준 및 규격에서 제시하는 인삼 추출방법이 더적절하다고 판단되어진다. 또한, 새롭게 제안된 가온 초음파추출법도 ginsenoside 함량이 건강기능식품의 기준 및 규격의 방법보다 떨어지지 않고, 분석 시간도 더 단축되고 실험과정이 간편한 것을 고려하면 매우 효율적인 시료 추출법이라고 판단되었다.
- 반면에, 이번에 새롭게 제안한 HPLC 분석법은 Halo® RP-Amide 컬럼을 이용하여 35분 이내에 10개 ginsenoside 성분 (ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1) 정량 분석이 가능하였다.
- 이상의 결과들로부터, 새롭게 확립된 새로운 HPLC 분석방법이 기존의 KS 또는 건강기능식품의 기준 및 규격과 같은 공정서에서 제시하는 ginsenoside 분석방법과 비교하여 ginsenoside를 보다 신속하게 분석, 정량 할 수 있는 분석방법이었으며, 또한 새로운 가온 초음파 추출법은 두 공정서에 제시한 추출법 보다 ginsenoside 추출효율이 증진되어 ginsenoside 함량이 유의성있게 높거나 비슷한 경향을 나타내었다. 더욱이 새로운 추출방법은 시료와 용매의 양을 절감할 수 있고 실험 방법이 간단하여 높은 재현성을 기대할 수 있을 뿐 아니라 분석시간을 단축할 수 있는 장점이 있는 것으로 판단되었다.
- 005%를 나타내었다. 즉, method A방법이 기존 추출 및 전처리법 method B, C와 비교하여, ginsenoside Rb1, Rg1 두 성분 함량이 유의성 있게 높거나 비슷한 경향을 나타내었다. 특히, white ginseng 2 시료의 경우는 method B 방법에 의해서만 ginsenoside Rb1의 함량이 인삼 산업법에서 정한 인삼 성분 검사기준인 0.
- 반면에, 이번에 새롭게 제안한 HPLC 분석법은 Halo® RP-Amide 컬럼을 이용하여 35분 이내에 10개 ginsenoside 성분 (ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1) 정량 분석이 가능하였다. 즉, 새롭게 제안한 HPLC 분석법은 KS와 건강기능식품의 기준 및 규격에서 제시한 기존 분석법들 보다 분석 시간이 짧고 다양한 ginsenoside 성분의 정성 및 정량 분석이 가능한 방법이었다.
- Ginsenoside 성분 추출에는 최소한 50℃ 이상의 가온 조건을 추가하여 ginsenoside 성분의 추출효율을 증진시키는 과정이 매우 중요함을 알 수 있었다. 즉, 현재 인삼 성분 검사시 추출방법으로 사용되는 방법 중에서, KS 추출방법 보다는 건강기능식품의 기준 및 규격에서 제시하는 인삼 추출방법이 더적절하다고 판단되어진다. 또한, 새롭게 제안된 가온 초음파추출법도 ginsenoside 함량이 건강기능식품의 기준 및 규격의 방법보다 떨어지지 않고, 분석 시간도 더 단축되고 실험과정이 간편한 것을 고려하면 매우 효율적인 시료 추출법이라고 판단되었다.
- 그러나, 전기장 추출의 경우는 분석 시료량과 용매가 많이 소요되는 단점이 있었다. 초고압 추출의 경우는 고가의 초고압 추출장비가 필요한 점을 고려할 때, 비교적 간편한 초음파 추출이 품질분석을 위한 소량 시료 추출방법으로는 적합할 것으로 판단된다.선행연구에서 추출 용매 및 조건별 인삼의 ginsenoside 성분의 추출효율을 비교하여 초음파추출 효율성에 대해 보고하였는데(Kim et al.
- 즉, method A방법이 기존 추출 및 전처리법 method B, C와 비교하여, ginsenoside Rb1, Rg1 두 성분 함량이 유의성 있게 높거나 비슷한 경향을 나타내었다. 특히, white ginseng 2 시료의 경우는 method B 방법에 의해서만 ginsenoside Rb1의 함량이 인삼 산업법에서 정한 인삼 성분 검사기준인 0.20%에 미달되었는데, 이것은 method A, C 방법이 추출시 가온조건이 들어가는 것에 반해 method B 방법은 가온조건 없이 초음파 추출을 하기 때문에 추출효율이 상대적으로 떨어지는 것에 기인하는 것으로 해석되었다. 또한, 추출단계의 가온조건은 malonyl-ginsenoside Rb1의 분해를 촉진하여 ginsenoside Rb1의 함량을 증가시킬 수 있음을 추정할 수 있었다 (Choi et al.
후속연구
- 10% 이상의 기준은 대한약전 뿐 아니라 일본 등 외국의 약전에도 적용되는 보편적인 기준으로, 이 기준보다 더 낮은 함량으로 인삼 성분 검사기준을 적용시 국내 인삼의 품질관리 기준이 하향 조정되기 때문에 품질관리가 허술해질 수 있다는 우려가 있다. 본 연구결과는 동일한 인삼 시료일지라도 추출방법에 따라서 ginsenoside Rb1의 함량이 인삼 성분검사기준에 미달되는 사례가 있을 수 있음을 시사하고 있다.Ginsenoside 성분 추출에는 최소한 50℃ 이상의 가온 조건을 추가하여 ginsenoside 성분의 추출효율을 증진시키는 과정이 매우 중요함을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 확립된 새로운 인삼 추출법과 새로운 HPLC분석법은 백삼 뿐 아니라 다양한 인삼의 품질관리를 위한 ginsenoside 성분검사 방법으로서 매우 효율적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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