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문제 정의
- 본 연구에서는 고품질 감귤인 부지화의 미숙과 과피에서 수증기증류법을 이용하여 추출한 에센셜오일의 성분을 분석하고 항균 활성과 항산화 활성을 조사하여 새로운 천연 유래 생리 활성물질의 개발 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- DPPH 라디칼 소거 활성 실험은 Blosis 방법으로 다음과 같이 실행하였다. 0.2 mM DPPH를 조제한 후, 다양한 농도로 시료의 활성을 측정하였다. 준비된 0.
- DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용하여 에센셜오일의 라디칼 소거 효과로 항산화 활성을 측정하였다 (Blois, 1958). DPPH는 광범위하게 쓰이는 간단한 항산화 검색방법으로 특히 phenol과 aromatic amine의 항산화 활성의 측정에 많이 사용하는 방법이다.
- DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (SC50)로 표시 하였으며, 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다. 이때 ascorbic acid를 대조구로 사용하였다.
- MTT 분석방법을 이용하여 천연 항균 소재로서 적용을 위해 Human cell line에 대한 세포독성을 확인하였다. 사용된 세포는 human fibroblast cell, CCD986sk와 human keratinoyte cell인 HaCaT 세포로 피부관련 세포이다.
- S. epidermis는 TSA 배지를 사용하여 37℃에서 24 h 동안 배양하여 형성된 원형 발육 저해환을 측정하였다. 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- SIEO의 항균 활성 결과는 Table 2에서와 같이 S. epidermidis와 P. acnes 모두에서 생육 저해환을 생성하였으며, 항균활성의 정도를 알아보기 위해 최소억제농도를 측정하여 확인하였다 (MIC: 10 μL/mL, 10 μL/mL).
- epidermidis는 각각의 배양배지와 조건에서 배양한 후 균 현탁액을 농도가 약 105 ~ 106 CFU/mL로 희석하여 사용하였다. 배양한 균주에 다양한 농도의 시료를 처리하고 각각 균주의 생육 적온에서 배양 후, 균 증식이 나타나지 않는 최소농도를 MIC로 정하였다.
- 5%를 포함하는 GAM 배지위에 붓는다. 배지가 굳으면 시료 용액을 포함하는 직경 8㎜ paper disc를 올려 37℃에서 48시간 혐기 배양한 다음 디스크 주변에 형성된 원형 발육 저지 환의 크기를 측정하였다.
- reticulate Blanco)는 제주도 서귀포 농가에 식재된 9년생 나무에서 수확하였고, 재배 방법은 무가온 하우스에서 재배되었다. 수확시기는 2011년 11월에 무가온 하우스에서 육안으로 색상이 발현되지 않은 청과를 수확하여 사용하였고, 특히 상품성이 없다고 판단되는 상처과나 과실형태가 정형과로 이루어지지 않은 과실을 위주로 수확하였다. 준비된 시료는 증류정유추출장치를 사용하여 6시간 동안 추출한 후 추출된 에센셜오일은 갈색병에 담아 4℃ 보관하여 실험에 사용하였다.
- Sample을 여러 농도 별로 처리하여 2일간 배양 후 500 ㎍/mL 의 MTT 시약을 well 당 20 μL를 첨가하였다. 시약 처리 후 5시간 동안 37℃에서 정치한 후, DMSO (dimethyl sulfoxid)로 formazan을 녹여 내어 570㎚에서 흡광도 값을 측정하였다.
- 4%였다. 얻어진 SIEO는 GC/MSD를 이용하여 16종류의 화학적 조성을 분석하였다 (Table 1). 분석된 성분에는 항염과 항균 활성 (Yoon et al.
- 에센셜 오일의 성분분석은 gas chromatography spectrometric detector (Agilent technologies 7890A GC system/5975C inert XL MSD with triple-axid detector, USA)로 분석하였다. GC Column은 DB-1HT (0.
- 최소억제농도 (Minimum Inhibitory Concentration; MIC)측정은 액체배지희석법 (broth dilution method)을 변형하여 사용하였다. P.
대상 데이터
- GC/MSD 분석은 GC와 동일한 조건에서 수행하였으나 MSD의 온도는 312℃로 유지하였다. GC/MSD에 의해 분석된 에센셜오일의 성분은 기기의 Wiley 138 database를 이용하여 분석하였다.
- Human fibroblast cell인 CCD986sk, keratinocyte cell인 HaCaT cell과 B16F10 melanoma 세포는 penicillin-streptomycin 100 units/mL과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다.
- 본 연구에 사용된 부지화 (‘Shiranuhi’: (C. unshiu Marc. × C. sinensis Osbeck) × C. reticulate Blanco)는 제주도 서귀포 농가에 식재된 9년생 나무에서 수확하였고, 재배 방법은 무가온 하우스에서 재배되었다.
- 부지화 에센셜오일의 항균활성 측정을 위해 Propionibacterium acnes CCARM 0081, CCARM 9009, CCARM 9010과 Staphylococcus epidermis CCARM 3709, CCARM 3710, CCARM 3711 균주를 항생제내성균주은행으로부터 분양받아 사용하였다. 분양받은 균주에 대한 항균 활성 측정은 paper disc법으로 생육 억제율을 측정하였다.
- MTT 분석방법을 이용하여 천연 항균 소재로서 적용을 위해 Human cell line에 대한 세포독성을 확인하였다. 사용된 세포는 human fibroblast cell, CCD986sk와 human keratinoyte cell인 HaCaT 세포로 피부관련 세포이다. 세포 독성에 대한 결과는 Fig.
- 수확시기는 2011년 11월에 무가온 하우스에서 육안으로 색상이 발현되지 않은 청과를 수확하여 사용하였고, 특히 상품성이 없다고 판단되는 상처과나 과실형태가 정형과로 이루어지지 않은 과실을 위주로 수확하였다. 준비된 시료는 증류정유추출장치를 사용하여 6시간 동안 추출한 후 추출된 에센셜오일은 갈색병에 담아 4℃ 보관하여 실험에 사용하였다.
- SIEO의 항균 활성측정은 paper disc 확산법과 최소억제 농도 측정 (MIC)으로 확인하였다. 항균활성 실험에는 여드름을 유발하는 S. epidermidis와 P. acnes를 사용하였고, 사용한 균주 중 S. epidermidis CCARM3710과 3711, P. acnes CCARM 9009와 9010은 항생제 내성 균주로 현재 여드름 치료제로 사용되고 있는 항생제들의 남용으로 생기는 내성균주에 대한 항균 활성도 확인하고자 사용하였다. 현재 여드름 치료에는 triclosan, azelic acid, tetracyclin 등의 항생제가 사용되고 있으나, 피부건조증이나 과민증 유발, 특히 항생제에 대한 내성 발생 등의 부작용이 알려져 지속적인 사용이 어려운 실정이다.
데이터처리
- Different superscript letters show significant differences at p < 0.05 by Duncan’s multiple range test.
- )로 표시 하였으며, 각 시료는 3회 반복실험을 실시하여 평균값을 구하였다. 이때 ascorbic acid를 대조구로 사용하였다.
- 모든 실험은 3회 이상 반복하여 이루어졌으며, 실험 결과는 각 항목에 따라 평균과 표준편차로 나타내었다. 실험군과의 차이는 SAS package (Statistical Analysis Program, version 9.
- 실험군과의 차이는 SAS package (Statistical Analysis Program, version 9.1)을 사용하여 Duncan’s Mutiple Range Test (DMRT)로 평균을 비교하여 나타내었고, p < 0.05 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- DPPH는 광범위하게 쓰이는 간단한 항산화 검색방법으로 특히 phenol과 aromatic amine의 항산화 활성의 측정에 많이 사용하는 방법이다. DPPH 라디칼 소거 활성 실험은 Blosis 방법으로 다음과 같이 실행하였다. 0.
- epidermidis등과 같은 피부 상재균들이 알려져 있다. SIEO의 항균 활성측정은 paper disc 확산법과 최소억제 농도 측정 (MIC)으로 확인하였다. 항균활성 실험에는 여드름을 유발하는 S.
- 부지화 에센셜오일의 항균활성 측정을 위해 Propionibacterium acnes CCARM 0081, CCARM 9009, CCARM 9010과 Staphylococcus epidermis CCARM 3709, CCARM 3710, CCARM 3711 균주를 항생제내성균주은행으로부터 분양받아 사용하였다. 분양받은 균주에 대한 항균 활성 측정은 paper disc법으로 생육 억제율을 측정하였다. P.
- 세포독성 평가는 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 분석 방법을 사용하였다. 24 well plate에 5 × 104cell/mL으로 24시간 전 배양 후 시료를 농도 별로 처리하였다.
성능/효과
- SIEO의 항산화 활성을 측정하기 위해 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 μL/mL의 농도로 처리한 결과 Fig. 1에서와 같이 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, SIEO의 SC50값은 15.36 μL/mL로 나타났다.
- 부지화 미숙과 과피에서 추출된 에센셜 오일의 수율은 약 1.4%였다. 얻어진 SIEO는 GC/MSD를 이용하여 16종류의 화학적 조성을 분석하였다 (Table 1).
- 분석된 성분에는 항염과 항균 활성 (Yoon et al., 2010)이 우수한 것으로 알려진 limonene이 75.21%로 주요 성분임을 확인할 수 있었고, 다음으로 α-terpineol (8.68%), 4-terpineol (5.56%)이 높게 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 특히 여드름 유발균 중 S. epidermidis 중에서 erythromycin, clindamycin, chloramphenicol 내성균인 S. epidermidis CCARM3710 (MIC: 20 μL/mL)과 S. epidermidis tetracycline 내성균인 3711 (MIC: 20 μL/mL)에서도 우수한 항균 활성을 보였으며, P. acnes에서는 clindamycin 내성균주인 P. acnes CCARM9009 (MIC: 10 μL/mL)와 P. acnes CCARM9010 (MIC: 10 μL/mL) 에서도 우수한 항균 활성을 보여 향장품 및 식품에 천연 항균 소재로서의 적용 가능성을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 사용된 세포는 human fibroblast cell, CCD986sk와 human keratinoyte cell인 HaCaT 세포로 피부관련 세포이다. 세포 독성에 대한 결과는 Fig. 2에서와 같이 농도별로 처리하여 0.5 μL/mL까지 농도를 높여도 세포에 독성을 보이지 않아 여드름 관련 향장품 소재로서의 적용이 가능할 것으로 기대된다.
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