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문제 정의
- 본 연구는 개망초꽃의 오일성분이 항산화, 항균및 항염 효능을 확인함으로써 천연방부 및 자극완화제로서 화장품 소재로 활용 가능성을 확인하기 위하여 수행하였다. 개망초꽃 오일 성분의 항산화 활성을 확인한 결과 ABTS 라디칼 소거활성에서 시료의 농도 500 ㎍/mL에서 ABTS 소거 활성이 98.
- 개망초에 대한 기존 연구는 부위별 화학성분 분석, 부위별 항산화 및 아질산염 소거 활성, methanol 추출물의 항염 효과, 개망초 꽃으로부터 triterpenoid 분리 등 알코올 추출물을 이용한 연구들이 진행되어 왔으나[18,19,20,21], 에센셜 오일에 대한 연구는 보고되어 있지 않다. 본 연구에서는 제주도에서 자생하고 있는 식물 중 메탄올추출물에서 어느 정도 항염 효과가 있다고 보고된 개망초 꽃으로부터 에센셜 오일을 추출하여 항균, 항산화, 항염 효과를 측정함으로써 화장품 소재로서 활용 가능성을 확인하고자 하였고 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 0.02, 0.04,0.08, 0.16, 0.31, 0.63 ,1.25, 2.5, 5, 10 mg/mL로 100 μL 처리한 후 O.D값을 0.3으로 맞춘 균배양액을 100배 희석하고 well당 100 μL씩 가한 후 배양하여 세균의 증식여부를 육안으로 확인한다.
- 미생물 최소사멸농도(minimum bactericidal concentration, MBC)는 다음과 같이 측정한다. MIC법에 따라 확인된 MIC농도 이상의 well에 배지를 루프를 이용하여 TSA평판에 획선 도말하여 배양한 후 균의 생육 여부를 확인한다. 균이 전혀 자라지 않은 농도를 MBC값으로 한다.
- Paper disc diffusion 법으로 실험한 결과 E.coli, S. aureus, P. acnes 균주 모두에서 항균 활성을 보여 개망초꽃 에션셜 오일의 미생물 최소저해농도(MIC)와 미생물 최소사멸농(MBC)를 측정해 보았다. 그 결과 E.
- Spectrophotometer를 사용하여 600 nm에서 optical density (O.D)값을 측정하고 희석하여 0.3으로 맞춘 후, 평판배지에 희석된 균을 100 μL 가하고 일회용 루프를 이용하여 획선으로 도말한 후 8 mm paper disc를 올리고 시료를 15 μL (100mg/mL)가하여 잘 흡수되게 한 후 배양한다.
- 개망초꽃 에션셜 오일 추출물에 대해, 초기 염증 반응 진행에 중요하게 작용하는 염증성 cytokine으로 알려진 TNF-α, IL-6의 발현에 미치는 영향을 ELISA kit를 이용하여 실험을 진행하였다.
- 개망초꽃 에션셜 오일 추출물의 항염증 효과를 찾기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 NO 및 세포독성 효과를 확인하였다. 오일의 농도는 6.
- 3으로 맞춘 후, 평판배지에 희석된 균을 100 μL 가하고 일회용 루프를 이용하여 획선으로 도말한 후 8 mm paper disc를 올리고 시료를 15 μL (100mg/mL)가하여 잘 흡수되게 한 후 배양한다. 배양 후 생성된 생육저해환의 지름(mm, disc포함)을 측정하여 항균활성을 비교분석하였다.
- 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 이용하여 검정곡선을 작성하여 비교하였다.
- 전 배양시킨 cells을 1 μg/mL LPS가 포함된 배지로 교환 후, sample을 농도별로 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1%naphylethylenediamine in 2.5% phosphoric acid)을 이용하여 세포배양액 중에서 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- 7 cell에서 LPS에 의해 유도된 NO 및 세포독성 효과를 확인하였다. 오일의 농도는 6.25, 12.5, 25,50 ㎍/mL로 하였으며 NO의 양은 Griess 시약을 사용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 측정결과 개망초꽃 에션셜 오일추출물에서 LPS에 의해 유도된 NO의 증가를 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 실험에 사용한 유기용매들은 Fisher (HPLC grade, Korea)의 제품을, potassium persulfate, 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (≥98% HPLC grade), 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl는 Sigma(≥100%, USA)의 제품을 사용하였으며, 균 배양배지로 trypticase soy broth (TSB)는 Difco(USA), reinforced clostridial medium (RCM)은oxoid의 제품을 사용하였다. 항균실험에 사용한 incubating jar, CO2가스팩은 oxoid (USA), paper disc는 ADVANTEC (Japan)의 제품을 사용하였고, 흡광도의 측정에는 epoch spectrophotometer를 사용하였다(BioTek, USA). 실험에 사용된 배지의 penicillin-streptomycin, fetal bovine serum (FBS), dulbecco's modifiedeagle’s medium (DMEM)은 GIBCO (Grand Island, YY, USA)에서 구입하였고, lipopolysaccharide (LPS)는 Sigma-Aldrich Co.
대상 데이터
- Cytokine 생성 억제평가에 사용된 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA) kit 중, TNF-α와 IL-6는 mouse ELASA kit (BD Biosciences, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 마우스 대식 세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 1 % penicillin-streptomycin과 10 % fetal bovine serum (FBS)이 함유된 dulbecco's modifiedeagle’s medium (DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5 % CO2 incubator 조건에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.
- 본 실험에서 사용한 개망초 꽃은 제주대학교 인근에서 6월에 채집하여 꽃 몇 860 g을 디에틸에테르(diethyl ether, HPLC grade, Fisher, Korea) 4 L에 하루 동안 침지시킨 후 추출 농축하여 콘크리트(concrete)를 60.2 g을 얻은 후, 에탄올(EtOH, HPLC GRADE, Fisher, Korea) 200 mL를 첨가하여 30℃에서 충분히 교반시키면서 용해시킨 후, -20℃로 냉각시켜 왁스(wax) 제거하고, 여과 및 농축하여 앱솔루트 상태의 오일 3.43 g을 얻어 빛을 차단할 수 있는 갈색병에 넣고 상온에 보관하며 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 유기용매들은 Fisher (HPLC grade, Korea)의 제품을, potassium persulfate, 2,2′-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (≥98% HPLC grade), 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl는 Sigma(≥100%, USA)의 제품을 사용하였으며, 균 배양배지로 trypticase soy broth (TSB)는 Difco(USA), reinforced clostridial medium (RCM)은oxoid의 제품을 사용하였다.
- 항균활성을 측정하기 위해 Escherichia coli(E.coli), Staphylococcus aureus (S. aureus), Propionibacterium acnes (P. acnes)를 사용하였으며, 배지는 E. coli와 S. aureus는 trypticase soy broth (TSB), P. acnes는 Reinforced clostridial medium (RCM)을 사용하고 각각에 agar powder 1.5%를 가하여 고체배지로 사용하였다. 균주 배양 조건으로는 E.
이론/모형
- essential oil. Cell viability was determined using the MTT assay.
- 시료의 항산화 활성을 측정하기 위해 ABTS 라디칼 소거활성과 DPPH 라디칼 소거 활성법을 이용하였다. 두 실험 방법은 대표적인 항산화 활성 측정법으로 두 실험법에 약간의 차이가 있다.
- 항균활성을 측정하기 위하여 paper disc diffusion method를 사용하였다. Spectrophotometer를 사용하여 600 nm에서 optical density (O.
성능/효과
- acnes 균주에서 모두 억제 효과를 보였으며, 특히나 피부질환을 일으키는 대표적인 피부상재균인 포도상 구균과 여드름균에서 더 좋은 억제 효과를 보였다. Disc법에서는 P. acnes 균에 대한 억제 효과가 14 mm로 가장 좋았으며, MIC와 MBC에서는 S. aureus는 0.31 mg/mL의 낮은 농도에서 균의 성장을 완전히 억제시켰고, 여드름균인 P. acnes에서도 MIC가 0.31 mg/mL, MBC가 0.63 mg/mL로 우수한 항균활성을 나타내었다.
- 63mg/mL로 나타났다. Paper disc diffusion 법에서와 마찬가지로 그람양성균인 S. aureus, P. acnes에서 낮은 MIC, MBC값을 보여 우수한 항균활성을 나타냈으며, S. aureus 균주에서는 MIC, MBC 모두 0.31 mg/mL로 낮은 농도에서도 균을 모두 사멸시키는 것으로 나다났다(Table 2).
- RAW 264.7 세포에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 염증 반응을 유발하였을 때 개망초꽃 오일의 NO 생성억제 효과는 세포독성이 없는 상태에서 농도 의존적으로 NO 생성을 억제시킴을 확인하였고, pro-inflammatory cytokine인 TNF-α, IL-6 역시 농도 의존적으로 억제함을 확인함으로써 피부 자극을 예방할 수 있는 화장품 소재로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
- 1). 같은 처리조건에서 세포독성효과를 확인하기 위해 MTT assay를 동시에 측정한 결과 50 ㎍/mL의 농도에서 37.9%의 세포생존율이 관찰되어 세포독성을 보였던 농도에서는 실험에서 제외시켰다(Fig. 2).
- 개망초꽃 에센셜 오일의 항균활성 측정하기 위해 paper disc diffusion 법으로 실험한 결과 E.coli, S. aureus, P. acnes 균주에서 각각 8, 11,14 mm로 측정 되어 그람양성균인 S. aureus, P. acnes에 대한 항균 활성이 그람음성균인 E. coli에 대한 항균 활성보다 더 높은 것으로 나타났다. 특히 여드름 균주인 P.
- 본 연구는 개망초꽃의 오일성분이 항산화, 항균및 항염 효능을 확인함으로써 천연방부 및 자극완화제로서 화장품 소재로 활용 가능성을 확인하기 위하여 수행하였다. 개망초꽃 오일 성분의 항산화 활성을 확인한 결과 ABTS 라디칼 소거활성에서 시료의 농도 500 ㎍/mL에서 ABTS 소거 활성이 98.6%로 이는 Shin 등[26]의 에센셜 오일 연구에서 편백오일 5000 ppm에서 43.9%, 티트리(tea tree)가 39.7%, 시더우드(cedarwood)가 31.5%의 소거활성을 보인 것 보다 10배 낮은 농도에서도 더 우수한 것으로 나타났다. DPPH 라디칼 소거 활성은 실험군의 농도 500 ㎍/mL(0.
- acnes 균주 모두에서 항균 활성을 보여 개망초꽃 에션셜 오일의 미생물 최소저해농도(MIC)와 미생물 최소사멸농(MBC)를 측정해 보았다. 그 결과 E. coli 균주에 대한 MIC가 2.5 mg/mL MBC가 5 mg/mL, S. aureu 균주에 대한 MIC가 0.31 mg/mL, MBC가 0.31mg/mL, P. acnes 균주에 대한 MIC가 0.31mg/mL, MBC가 0.63mg/mL로 나타났다. Paper disc diffusion 법에서와 마찬가지로 그람양성균인 S.
- 그 결과, 농도 의존적으로 TNF-α와IL-6 모두에서 억제 효과가 나타남을 확인하였다(Fig. 3).
- 또한 항균 활성에서는 E. coli, S. aureus, P. acnes 균주에서 모두 억제 효과를 보였으며, 특히나 피부질환을 일으키는 대표적인 피부상재균인 포도상 구균과 여드름균에서 더 좋은 억제 효과를 보였다. Disc법에서는 P.
- 실험군의 농도 500 μ g/mL에서 ABTS 소거활성은 98.6%를, DPPH 라디칼 소거 활성은 48.3%로 좋은 효능을 나타내었다(Table 1).
- 5, 25,50 ㎍/mL로 하였으며 NO의 양은 Griess 시약을 사용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 측정결과 개망초꽃 에션셜 오일추출물에서 LPS에 의해 유도된 NO의 증가를 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 같은 처리조건에서 세포독성효과를 확인하기 위해 MTT assay를 동시에 측정한 결과 50 ㎍/mL의 농도에서 37.
후속연구
- 염증(inflammation)은 외부 자극에 의한 생체조직의 면역반응의 하나로 염증과정에서 생성되는 nitric oxide (NO)와 tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6 (IL-6) 등 염증 매개 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)은 ROS 생성을 촉진시켜 질환을 악화시킬 수 있다[9]. 방부 효과나 항균 효과가 있으면서 부작용을 최소화하여 피부염증을 막아주는 것은 화장품에 있어 아주 중요한 문제로 항산화, 항염 및 항균효과가 있으면서 인체에 부작용이 없고 비용이 저렴한 물질의 개발 및 천연 소재에 대한 연구는 화장품 소재 개발에서 필수적이라 할 것이다.
- 이상의 결과들로부터 개망초꽃 에센셜 오일은항산화, 항균, 항염 효과가 있는 소재로, 천연방부제 및 피부 자극 완화 및 피부질환 예방과 관련된 화장품 원료로서 유용하게 활용 가능할 것으로 사료된다.
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