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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 조직이 자멸사될 때 발현되는 Apo Taq를 타액선에서 관찰하여, 타액선조직이 정서적 스트레스에 의하여 세포자멸사 된다는 것을 확인함으로써, 스트레스로 인하여 발생되는 여러 가지 질환의 원인을 구명하려고 하였던 바, 다소 의미 있는 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 본 실험에서는 Sprague-Dawley계의 생후 10주된 체중 250∼300g인 웅성백서를 사용하였으며, 12시간 주기로 밤낮을 구별하였다. 18마리를 사용하여 대조군에 2마리, 실험대조군에 2마리 그리고 실험군에 14마리씩을 배정하였으며, 실험대조군은 2시간동안 restraint cone을 사용하여 구속스트레스를 부여하고 즉시 희생시켰고, 실험군은 매일 2시간씩 restraint cone을 사용하여 구속스트레스를 부여하였으며, 이들은 각 군별로 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일에 각각 2마리씩 희생시켰다.
- TUNEL assay에 양성인 세포측정은 각 군의 슬라이드에서 무작위 10부위를 선택하여 광학현미경 200배율에서 관찰되는 TUNEL assay에 양성인 세포수를 측정하였다.
- 면역조직화학적 소견을 관찰하기 위하여 각 군을 Bouin용액에 1일간 고정시킨 후, 4~6μm로 박편을 제작하였다.
- 본 연구는 백서에 구속스트레스를 가한 후, 이하선 조직의 형태학적 변화 양상을 광학 현미경으로 관찰하였으며, 타액선 조직에서 세포자멸사의 평가는 TUNEL assay에 양성을 보 이는 세포 수를 측정하여, 각 군별 차이를 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 이를 다시 PBS 용액으로 3회 세척한 후 DAB-subtraction solution(500μl)을 떨어 뜨려 5분간 반응 후 발색시켜 증류수로 세척한 후 봉입하였다. 위양성 반응을 배제하기 위해 Tdt 대신 PBS용액을 적용시킨 대조표본을 만들어 광학현미경을 통해 음성 반응을 확인하였다.
- 조직에서 세포자멸사의 평가는 TUNEL assay에 양성을 보이는 핵이 갈색으로 염색되는 세포 수를 측정하여 각 군별 차이를 비교하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서는 Sprague-Dawley계의 생후 10주된 체중 250∼300g인 웅성백서를 사용하였으며, 12시간 주기로 밤낮을 구별하였다.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 측정치는 평균±표준오차로 표시하였으며, 통계학적 유의성은 Student's t-test를 실시하였고, 유의수준은 0.05로 정하였다.
성능/효과
- ‘스트레스’는 예기치 않은 환경에 처했을 때 나타나는 생체의 비특이적 반응으로, 생리적으로 자율신경계, 내분비계 및 면역계 등에 영향을 미치게 된다.1) 따라서 스트레스에 의하여 면역이 약화됨으로써 면역체계로부터 많은 보호를 받도 있는 구강 내에는 다양한 병소가 발생되기도 하는 것이다. 이러한 스트레스를 갑작스럽고 심하게 받게 되면, 정신기능에 장애를 일으켜 해리장애가 일어나기도 하고, 운동신경기능에 장애를 일으키면 전환장애가, 자율신경이나 말초신경에 장애를 일으키면 심신장애가 초래되기도 한다.
- 1. 백서 이하선에서 구속 스트레스를 가한 후, 5일 부터 타액선 선포의 위축 및 농염이 관찰되었으며, 7일부터 세포자멸사 소견이 관찰되기 시작하였다.
- 2. In situ DNA end labelling assay를 통하여 TUNEL 염색을 시행한 결과, 타액선 장액선포에서 양성세포가 구속 스트레스에 대해 5일부터 통계학적으로 유의하게 증가하여 7일째에 가장 큰 지수를 보여 조직학적 소견과 일치하였다.
- 24) 1972년 처음으로 개념이 도입된 세포자멸사는 괴사와 감별되는 세포 사망의 한 형태로, 괴사의 경우 DNA 파괴 전에 세포막의 소실이 일어나며 세포의 부종, 핵파괴를 동반한 핵농축, 세포질의 호산성화가 특징인 반면, 세포자멸사는 DNA 파괴 후에도 세포막의 소실이 없으며 세포핵의 파열(nuclear blebbing), 염색체의 응결 (internuleosomal fragmentation), 세포질의 응축(cell shrinkage), 세포자멸체 (apoptotic body) 형성 등의 특징적인 양상을 동반하여 형태학적으로 괴사와는 구별된다.25,26)
- 본 실험에서는 파라핀 조직에서 검출이 가능하고 후향 및 정량적 검사가 가능하며 임상적용이 용이한 TUNEL 방법을 이용하였는데, 이 방법은 자멸사 세포에서 endonulease의 활성화로 발생된 DNA 절단을 표식하는 방법이다.29) 본 연구에서 정상 타액선 조직의 DNA 분절화를 확인하기 위해 TUNEL 염색을 실시한 결과, 정상 이하선 조직에서는 거의 음성 반응을 보였으나, 구속 스트레스 부여군의 시간 증가군에서 5일 후부터 유의한 양성 세포를 보여 타액선도 스트레스에 의해 자멸사가 관찰되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 TUNEL 양성 반응을 보이는 기작은 DNA 의 3과 5 의 양쪽 말단에서 digoxygenin-DDUTP를 연결시키기 위해 항체 anti-dioxigenin-peroxidase 와 반응하여 발색되어 나타나게 된 것이다.
- 또한 즉시군에서 4일군까지 400배 의 고배율 시야 당 1% 이하에서 TUNEL 양성 세포가 나타났으나, (FIg. 4 B, Fig. 5A) 5일군부터 양성세포가 유의하게 증가하기 시작하여,(Fig. 5B) 스트레스 부여 7일 후에 가장 많이 발현되었고, 이런 양성세포는 세포자멸사로 의심되는 부위에서 주로 관찰되었다. (Fig.
- 정상 대조군의 이하선 조직은 장액선포와 관구조가 모여 소엽을 이루고 소엽은 섬유조직에 의해 분리되는 구조로 이루어졌으며, 선포간 경계는 명확하고 세포질은 분비과립이 관찰되었으며 타액선 결체조직 내에서는 선조관의 도관세포가 단층의 원주형으로 나타났으나 세포의 크기, 형태, 배열은 모두 규칙적 이였으며, 핵이나 세포질의 이상소견은 관찰되지 않았다.
후속연구
- 따라서 구속에 의한 스트레스 증가에 따라 생체 내 타액선조직에서 세포자멸사가 유도됨을 증명할 수 있었으며, 향후 유도 신호전달 기전에 관한 연구가 이루어져야 한다고 사료된다.
- 따라서 이런 지표들과 함께 세포의 ROS 및 산화스트레스측정, 예를 들어 산화되어 변형된 DNA를 반영하는 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG) 를 정량적 평가하는 것과 관련 신호 기전에 관한 추가적인 실험이 필요하다고 사료된다.
- 본 연구의 제한점은 연구에 사용된 TUNEL 방법이 위양성이 있다는 점인데, TUNEL 염색방법은 그 방법이 비교적 쉽고 조직의 배양을 하지 않고도 쉽게 측정할 수 있다는 장점이 있으나, 자멸세포의 퇴행성 과정 및 재생 과정에서 모두 양성으로 나타나서 위양성이 많은 것으로 알려져 있다. 또한 TUNEL 지수가 조직의 퇴행성 변화 정도와 치유 능력을 일부분 반영한다고 할 수 있으나 세포 각각의 기능적 변화를 모두 반영한다고는 할 수 없다.
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