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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라 양식 넙치에서 분리한 VHSV 분리주들의 glycoprotein (G)의 염기서열을 분석하여 Korean VHSV 분리주들과 기보고된 일본 및 중국의 분리주들을 계통발생학적으로 비교하여 국내 특이적인 염기서열을 확인하여, 구역화 (zoining)된 수산생물 질병의 예찰, 모니터링 및 질병 관리에 필요한 유용한 자료를 제공하려고 한다.
제안 방법
- VHSV 분리주들의 지역특이적인 서열의 확인을 위해 서열변이가 심한 G-유전자 (Benmansour et al., 1997)의 full length open reading frames (ORFs)의 서열을 VHSVG-ORF-F1 (5‘-ATGGAATGGAATACTTTTTTCTTGGTG-3’)와 VHSV-G-ORF-R1 (5’-TCAGACCGTCTGACTTCTGGAGAACTGC-3‘)primer set를 디자인하여 PCR을 수행하였으며, 1524bp의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 증폭된 PCR산물은 pGEMⓇ-T Easy vector (Promega, USA)를 이용해 클로닝하여, ExprepTM Plasmid SV DNA prep kit (GeneAll Biotechnology Co.
- 본 연구에서는 총 8개의 국내 VHSV의 분리주들인 VHSV-IVa-KOR-YGH-Wando, VHSV-IVa-KOR-CJA-Jeju(Cho et al., 2012), VHSV-IVa-KOR-FYeosu05 (Kimet al., 2013), VHSV-IVa-KOR-GeoJe-201001, VHSV-IVa-KOR-Jeju-201001, VHSV-IVa-KOR-Jeju200501과 HSV-IVa-KOR-KR2002(Kim et al., 2011)분리주들과 GenBank로부터 얻은 28개의 외국 VHSV분리주들 (Table 1)의 G 유전자의 서열을 비교분석하였다 (Fig. 1).
- 합성된 cDNA는 VHSV N-gene의 1-505 base를 포함하는 부위를 증폭하는 VN Forward(5’-ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG-3’)와 VN reverse (5’-GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC-3’)primer set를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다 (Snowet al., 2004). 5 μl의 cDNA, 11.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 VHSV 분리주들의 분리유래는 선행연구의 결과, 2010년 지리적으로 먼 거리의 완도와 제주도에서 VHSV의 특징적인 증상인 안구돌출 및 출혈, 체색흑화, 복수에 의한 복부팽만 등의 질병증상을 보였으며, 제주도에서는 약 80%, 완도에서는 약 15%의 양식 넙치의 치어를 폐사시킨 VHSV-IVa-KOR-YGH-Wando 분리주와 VHSV-IVaKOR-CJA-Jeju 분리주를 기초로 하였다 (Cho et al.,2012). 또한, VHSV-IVa-KOR-GeoJe-201001, VHSVIVa-KOR-Jeju-201001, VHSV-IVa-KOR-Jeju-2005013종의 국내 VHSV 분리주에 대한 염기서열은 국립수산과학원 병리연구과로부터 제공받았다.
데이터처리
- gov/)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 검색을 통해 유사도 분석을 수행하였다. VHSV 분리주들의 G-유전자염기서열을 이용한 분자계통분석은 Clustal X software(Thompson et al., 1997)를 이용하여 정렬하였고 분석방법으로 근린결합분석 (NJ, neighbor-joining analysis,1000 rounds of bootstrap)을 수행하였고 MEGA4program (Tamura et al., 2007)을 이용해 염기서열간의 유전적 거리와 계통도 (phylogenetic tree)를 얻었다. 본 연구에서 비교한 8개의 Korean VHSV 분리주와 다른 나라의 28개의 VHSV 분리주들에 대한 정보는Table 1에 나타내었다.
이론/모형
- Nucleotide 서열과 추정 아미노산 서열은 BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999)의 CLUSTALW alignment model (Thompson et al., 1994)통해 양방향 염기서열 데이터를 교차분석 후 단임 염기서열(contig)을 확보하여, National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 검색을 통해 유사도 분석을 수행하였다. VHSV 분리주들의 G-유전자염기서열을 이용한 분자계통분석은 Clustal X software(Thompson et al.
- Viral RNA의 역전사 및 RT-PCR을 이용한 바이러스의 동정법은 세계동물보건기구 (Office of International Epizootics, OIE)에 의해 추천되는 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (OIE, 2013)의 VHSV의 분자생물학기법을 이용한 진단법을 기초로 하였다. VHSV의 검출을 위한 conventional reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)법은 cDNA 합성 후 RT-PCR을 수행하는 two step법으로 진행되었다. cDNA의 합성 (total volume 20 μl)은 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, USA)를 이용하여 5 μl의 viral RNA, 4 μl의 5× iScript Reaction Mix, 1 μl의 iScript Reverse Transcriptase, 및 10 μl Nuclease-free water로 25℃에서 5분, 42℃에서 30분, 85℃에서 5분 반응하였다.
- Viral RNA의 역전사 및 RT-PCR을 이용한 바이러스의 동정법은 세계동물보건기구 (Office of International Epizootics, OIE)에 의해 추천되는 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (OIE, 2013)의 VHSV의 분자생물학기법을 이용한 진단법을 기초로 하였다. VHSV의 검출을 위한 conventional reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)법은 cDNA 합성 후 RT-PCR을 수행하는 two step법으로 진행되었다.
성능/효과
- Genotype IVa의 Asian VHSV 분리주들을 포함한전 세계적으로 동정된 VHSV의 genotype들 (I-IV)의 G-region의 국내 VHSV 분리주들의 특이적인 서열을 확인하기 위하여 총 40종의 분리주들의 염기서열을 분석하여 Asian VHSV의 분리주들과의 비교결과 국내 VHSV 분리주의 특이적 부위였던 8 부위 (G34, C528, A755, T834, T951, T1147, T1221, T1336) 중3 부위의 국내VHSV 분리주 특이적 염기서열들(A755, T834, T1221)을 확인하였고, 4종의 일본분리주들만의 특이적 염기서열은 존재하지 않았다. 중국분리주의 경우는 비교가능한 분리주의 서열이 1종 뿐이라 추가적인 연구가 필요할 것이다.
- 또한, 중국유래 VHSV 분리주의 특이적 염기서열 11 부위(C498, C545, C548, C642, G648, T678, A738, C804,C834, G851, C1139)와 일본 유래 VHSV 분리주의 특이적 염기서열 1 부위 (C179)를 확인할 수 있었다. VHSV의 국내분리주간의 염기서열 유사도는 99.1~100%였으며, 국내 분리주와 중국 분리주는98.1~98.7%, 일본 분리주와는 98.5~99.2%의 상동성을 보였다. 이러한 바이러스의 서열변이의 다양성을 진화의 관점으로 보면, 일단 종이 형성되면 오랜 기간동안 변하지 않다가 갑자기 크게 변한다는 단속평형설 (또는 도약평형설, punctuated equilibrium theory)과 종의 형성은 일정하게 일어나며 작은 변화들이 축적을 통해 오랜 세월을 거쳐 변하게 된다는 점진적진화론 (progressive evolution, gradualism)으로 많은 연구를 통해 설명하고 있다.
- 하지만 국내분리주들의 경우에는 현재까지 다른 genotype이 동정되지 않고 genotype IVa만 한국에 유입되었음을 나타내고 있다. 그리고 일본 및 중국에서 분리된 대부분 분리주들 역시 genotype IVa 계열에 포함되어, 아시아 지역의 VHSV의 경우 genotype IVa계열의 공통적인 ancestor virus로부터 파생되었음을 예상할 수 있다. 또한, VHSV의 숙주 종 간의 서열변이의 다양성보다는 지리적 위치와 관련된 유전적 다양성을 보이고 있다.
- 아시아에서 분리된 VHSV 분리주들의 nucleotide 서열들을 multiple sequence alignment를 통해 비교해본 결과, 국내 VHSV 분리주들은 일본과 중국 분리주들 (VHSV-IVa-JPN-JF00Ehi1, VHSV-IVa-JPNJP99Obama25과 VHSV-IVa-CHN-PORV)과 98.0% 이상의 nucleotide 서열의 상동성을 나타내었다. 아미노산 레벨에서는 국내 분리주들과 일본과 중국의 VHSV 분리주들과는 4∼5개의 변이가 발견되었으며, 이는 다른 보고서에서 발표된 것처럼 G-단백질의 single amino acid substitution에 의한 VHSV 분리주의 고병원성과 저병원성 차이의 가능성을 가지고 있다(Betts and Stone, 2000; Campbell et al.
- 지역별 VHSV 분리주들의 특이적 염기서열의 확인을 위해 multiple sequence alignment를 통해 아시아의 VHSV 분리주들의 nucleotide 서열들을 비교해본 결과, G-단백질의 8 부위 (G34, C528, A755, T834, T951, T1147, T1221, T1336)에서 국내 VHSV 분리주들의 특이적인 서열을 확인하였다 (Fig. 2).
후속연구
- 또한, single-stranded RNA genome으로 다른 RNA virus들과 마찬가지로 빠른 진화를 야기하는 error-prone replication mechanism을 가지기 때문에 서열변이가 심해 유전적 다양성과 감염기작에 대한 연구에 용이한 반면, 새로운 항원성을 가진 바이러스들이 자주 출현한다 (Holmes, 2009; Snow, 2011). 따라서, 지속적인 서열변이의 모니터링 및 국제적인 조사와 정보의 공유가 필요하다.
- 본 연구에서 수행된 VHSV 분리주들의 계통분석 및 염기서열의 분석 결과 2005년 이후에 조사된 아시아 국가의 VHSV의 분리주들은 각 지역의 특징적인 염기서열 부위를 포함하고 있으며, 이러한 VHSV의 유전적 특성분석에 대한 연구와 질병의 발생 및 감염기작에 대한 이해와 연구결과는 국가적으로는 물론이고 국제적인 연구 및 모니터링과 같은 수산생물질병 관리에 유용한 자료한 자료가 될 것이다.
- , 1997), 다른 한편으로는 각각의 국내 분리주의 nucleotide 서열의 변이와 함께 지역적 변이 역시 확인할 수 있어 점진적 진화의 관점에서도 설명이 가능하다. 본 연구에서 확인된 아시아에서 분리된 VHSV 분리주들의 특이적 염기서열의 변이양상은 향후 VHSV의 서열변이양상에 대한 연구와 모니터링 및 검역에 중요한 유전적 마커로 활용될 수 있을 것이다.
- 또한 중국 유래 VHSV 분리주의 특이적 염기서열 11 부위 (C498, C545, C548, C642, G648, T678, A738, C804, C834, G851, C1139)와 일본 유래 VHSV 분리주의 특이적 염기서열 1부위 (C179)를 확인하였다. 이상의 연구결과는 국내 특이적인 염기서열을 확보하여, 구역화된 수산생물 질병의 예찰, 모니터링 및 질병 관리에 유용하게 사용될 것으로 사료된다.
- Genotype IVa의 Asian VHSV 분리주들을 포함한전 세계적으로 동정된 VHSV의 genotype들 (I-IV)의 G-region의 국내 VHSV 분리주들의 특이적인 서열을 확인하기 위하여 총 40종의 분리주들의 염기서열을 분석하여 Asian VHSV의 분리주들과의 비교결과 국내 VHSV 분리주의 특이적 부위였던 8 부위 (G34, C528, A755, T834, T951, T1147, T1221, T1336) 중3 부위의 국내VHSV 분리주 특이적 염기서열들(A755, T834, T1221)을 확인하였고, 4종의 일본분리주들만의 특이적 염기서열은 존재하지 않았다. 중국분리주의 경우는 비교가능한 분리주의 서열이 1종 뿐이라 추가적인 연구가 필요할 것이다. WebLogo 3 (http://weblogo.
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