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문제 정의
- 본 연구자들은 세신에서 독성을 일으킬 수 있는 성분 즉, aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종 성분에 대하여 초고성능 액체크로마토그래피 질량분석기(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometer; UPLC-MS)를 이용하여 함량분석을 실시하였으며, safrole 1종에 대하여 가스크로마토그래피 질량분석기(gas chromatography-mass spectrometer; GC-MS)를 이용하여 함량을 분석함으로써 품질관리의 기초 자료로 제공하고자 본 연구를 실시하였다.
제안 방법
- 70% 에탄올 추출물 및 용매분획물 조제 − 세신 약 2.0 kg을 분쇄한 후 70% 에탄올을 이용하여 60분간 3회 초음파 추출하였다.
- 70% 에탄올 추출물을 증류수(1 L)에 현탁시킨 후 n-hexane(1.0 L×3회), ethyl acetate(1.0 L×3회) 및 butanol(1.0 L×3회) 순으로 용매분획을 실시하였다.
- Aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 성분 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였다.
- LC-MS/MS 및 GC-MS 분석조건 − 세신의 주요성분인 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol의 정량분석을 위해 Waters사의 UPLC와 질량분석기를 사용하여 Table II와 같은 조건으로 분석을 하였다.
- LC-MS/MS 및 GC-MS 분석조건 확립 − 세신의 주요성분인 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 성분을 LCMS/MS를 이용한 선택성과 민감도가 우수한 MRM 검출 방법으로 함량분석을 실시하였다.
- LC-MS/MS에서 정량분석을 위한 aristolochic acid I의 MRM 조건은 m/z 342.1(precursor ion)에서 COO−가 떨어진 [M−COO−+H]+ 형태의 m/z 298(product ion), aristolochic acid II는 m/z 312.1(precursor ion)에서 COO−가 떨어진 [M−COO−+H]+ 형태의 m/z 268(product ion), α-asarone, β-asarone 및 elemicin은 m/z 209.1(precursor ion)에서 CH3가 떨어진 [M−CH3+H]+형태의 m/z 194(product ion) 및 methyl eugenol은 m/z 179.1(precursor ion)에서 CH3가 떨어진 [M−CH3+H]+ 형태의 m/z 164(product ion)로 설정한 후 정량을 실시하였다.
- 검량선 작성 − Aristolochic acid I, aristolochic acid II, αasarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 표준품에 대한 검량선은 10, 100, 500 및 1000 ng/mL의 농도로 작성하였으며, safrole은 100, 500, 1000 및 2000 ng/mL의 농도로 희석하여 피크 면적과 농도에 대해서 작성하였다.
- 검액의 조제 − LC-MS/MS 정량분석을 위하여 70% 에탄올 추출물, n-hexane 분획, ethyl acetate 분획, butanol 분획 및 물 분획을 각각 100 mg을 정확히 측정한 후 메탄올을 넣어 10 mL로 맞춘 후 30분간 초음파 추출하였다.
- 그 후 메탄올을 이용하여 70% 에탄올 추출물 100배, n-hexane 분획 2000배, ethyl acetate 분획, butanol 분획 및 물 분획을 각각 10배 희석 후 0.22 µm 멤브레인 여과하여 검액으로 하였다.
- 3). 또한 safrole의 함량분석을 위해 GC-MS를 이용하여 Table III과 같은 조건으로 분석을 실시하여 m/z 162에서 [M]+ 형태의 분자이온 피크를 확인하였다(Fig. 4). 토탈이온크로마토그램(total ion chromatogram; TIC)에서 7.
- 세신 중 주요성분의 함량분석 − 세신 추출물에 대하여 LC-MS/MS와 GC-MS를 사용하여 설정된 분석법으로 7종 성분에 대한 함량을 분석하였다.
- 세신의 주요성분인 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin, methyl eugenol 및 safrole 등 7종의 성분에 대하여 LC-MS/MS와 GC-MS를 이용한 함량분석을 실시하였다.
- LC-MS/MS 및 GC-MS 분석조건 확립 − 세신의 주요성분인 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 성분을 LCMS/MS를 이용한 선택성과 민감도가 우수한 MRM 검출 방법으로 함량분석을 실시하였다. 역상 UPLC 조건에 의한 ESI 방법의 양이온 모드에서 6종 성분의 분리를 위해 0.1%(v/v) 개미산이 각각 함유된 물과 아세토나이트릴의 이동상을 이용하여 Table I과 II의 조건을 이용하여 검출하였다. MS 분석 결과 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 6종 모두 m/z 342.
- Aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종의 성분 분리를 위해 pump, digasser, column oven 및 autosampler로 구성된 Waters의 UPLC(Milford, MA, USA)를 사용하였다. 질량분석기는 electrospray ionization(ESI) source가 장착된 LC-MS/MS(Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 데이터 처리는 Waters MassLynx software(version 4.1, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 또한 safrole의 분석을 위해 질량분석기가 장착된 GC-MS는 Shimadzu(Kyoto, Japan)사의 QP-2010 Ultra 모델을 사용하였다.
대상 데이터
- aristolochic acid II와 elemicin은 ChromaDex(Irvine, CA, USA)와 Synchem OHG(FelsbergAltenburg, Germany)에서 각각 구입하였으며, α-asarone과 β-asarone은 ROTH(Karlsruhe, Germany)로부터 구입하였다.
- 시약 및 기기 − 표준물질인 aristolochic acid I, methyl eugenol 및 safrole은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용된 세신(Asarum sieboldii)은 HMAX(Jecheon, Korea)에서 규격품을 구입하여 전문가로부터 감정 후 사용하였다.
- 0%이상으로 확인되었다. 정량분석을 위한 메탄올, 아세토나이트릴 및 물은 J. T, Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, 개미산은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 그 외의 시약은 HPLC 또는 특급 시약을 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 1, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 또한 safrole의 분석을 위해 질량분석기가 장착된 GC-MS는 Shimadzu(Kyoto, Japan)사의 QP-2010 Ultra 모델을 사용하였다.
- LC-MS/MS 및 GC-MS 분석조건 − 세신의 주요성분인 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol의 정량분석을 위해 Waters사의 UPLC와 질량분석기를 사용하여 Table II와 같은 조건으로 분석을 하였다. 이들 6종 성분의 LC-MS/MS 정량 분석을 위하여 각 성분의 precuusor ion, product ion, cone voltage 및 collision energy 등에 대한 최적의 조건은 Table III과 같이 설정하여 다중반응탐색법(multiple reaction monitoring; MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다. 또한 세신의 성분 중 하나인 safrole의 정량분석을 위해 Shimadzu사의 QP-2010 Ultra 모델의 GC-MS를 사용하여 Table IV와 같이 분석하였다.
성능/효과
- LC-MS/MS 정량분석을 위한 MRM 조건은 aristolochic acid I m/z 342.1/298, aristolochic acid II m/z 312.1/268, α-asarone, β-asarone 및 elemicin m/z 209.1/194 및 methyl eugenol m/z 179.1/164으로 분석을 실시하였으며, safrole은 GC-MS를 이용하여 m/z 194에서 분석을 실시한 결과 헥산 분획물에서 methyl eugenol, elemicin 및 safrole이 143.66 mg/g, 17.02 mg/g 및 5.66 mg/g으로 다른 성분과 분획물에 비해 많이 함유되어 있음을 확인하였다.
- MS 분석 결과 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, β-asarone, elemicin 및 methyl eugenol 6종 모두 m/z 342.1, m/z 312.1, m/z 209.1, m/z 209.1, m/z 209.1 및 m/z 179.1에서 각각의 [M+H]+ 형태의 분자이온 피크를 확인하였다(Fig. 2).
- 검량선 − LC-MS/MS를 이용하여 ESI 방법의 MRM 모드에서 aristolochic acid I, aristolochic acid II, α-asarone, βasarone, elemicin 및 methyl eugenol 등 6종 성분의 농도에 따른 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성한 결과 상관 계수(r2) 값이 0.9972, 0.9991, 0.9959, 0.9992, 0.9998 및 0.9992의 양호한 직선성을 각각 나타내었으며, GC-MS를 이용하여 작성한 safrole 역시 0.9982의 양호한 상관 계수 값을 나타내었다(Table IV).
- Safrole은 GC-MS를 이용하여 m/z 194에서 함량을 분석하였다. 함량 분석 결과 세신 추출물 중 aristolochic acid I은 에틸아세테이트 분획에서만 0.22 mg/g으로 검출되었으며, safrole은 헥산분획에서만 5.66 mg/g으로 검출되었다. Elemicin과 methyle eugerol의 경우 0.
- 확립된 세신의 LC-MS/MS MRM 모드 결과 6종의 성분인 aristolochic acid II, elemicin, β-asarone, methyl eugenol, aristolochic acid I 및 α-asarone은 6.10분, 6.81분, 6.96분, 6.96분, 6.99분 및 7.82분에서 각각 검출되었다(Fig. 3).
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