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문제 정의
- 본 연구는 마치현 추출물의 뇌세포 보호 효과와 그 메커니즘에 관하여 연구하였으며, 그 결과 에틸아세테이트 분획층에서 글루타메이트로 유도한 HT22세포의 독성에 대하여 우수한 보호 효과를 나타내었다. 이와 같은 효과는 마치현 에틸아세테이트 분획물이 HT22 세포에서 ERK, JNK 인산화와 Nrf2의 핵 내 전사를 유도하고, 뇌세포 보호효과는 이와 같은 기전을 통하여, HO-1 단백질 발현조절에 의한 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 글루타메이트를 고농도로 처리하여 생쥐 해마 유래 HT22 세포의 산화적 손상을 유도하였으며, 마치현 70% 에탄올 추출물과 분획물의 뇌세포손상 억제효과와 그 기전을 연구하였다. 마치현 70% 에탄올 추출물과 분획물을 HT22세포에 0~200 µg/ml의 농도로 처리하여 세포 독성을 측정한 결과, 세포 독성을 일으키지 않았다.
제안 방법
- 최근에는 HO-1과 그 부산물의 작용으로 뇌세포 보호를 비롯한 다양한 생리활성을 가진다는 연구 보고가 있으며, 특히 HO-1은 뇌세포 보호활성의 marker protein으로 많이 활용하고 있다.16,17) 본 연구에서는 마치현 에탄올 추출물과 그 분획물이 Heme oxygenase-1 발현을 통한 뇌세포 보호 기전을 탐색하였다.
- 21-24) 마치현 ethyl acetate 분획물이 HO-1발현에 MAPK가 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 마치현 ethyl acetate 분획물을 200 µg/ml을 시간별(15, 30, 45, 60분)로 처리하고 단백질 발현을 확인하였다.
- HT22세포를 96 well microplate에 2×105 cells/well이 되게 분주한 후, 37o C의 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, 5 mM의 글루타메이트와 각 추출물과 분획물(50, 100, 200 µg/ml)을 농도별로 처리하였다.
- cells/well이 되도록 배양한 후 시료를 다양한 농도별 시간별로 처리한 한 후 배양하였다. RIPA buffer를 첨가하여 세포를 용해시키고 원심분리하여 얻은 단백질은 Bradford assay로 정량하여 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동한 후 PVDF membrane에 옮긴 다음 5% skim milk로 1시간 blocking한 후 1차 항체(HO-1)를 1:1000으로 희석하여 넣고 4시간 이상 반응한 다음, 다시 2차 항체를 반응시키고, ECL 용액을 1:1로 잘 섞어서 membrane 위에 가하여 발광시키고 LAS4000을 이용하여 확인하였다.
- 또한, 뇌세포의 보호기전에서 중요한 역할을 하는 단백질인 heme oxygenase (HO)-1는 HT22세포에 ethyl acetate 분획물을 12시간 처리한 후 western blot을 통하여 단백질 발현정도를 확인하였다. 그 결과, ethyl acetate 분획물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 HO-1 발현이 증가하였다(Fig.
- 모든 실험은 대조군에 대한 세포 보효율을 mean±S.D.로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
- 시료 처리 12시간 후 세포 생존률을 MTT 방법으로 측정하였으며, Trolox 50 µM을 양성대조군으로 하여 비교하였다.
- 96 well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 세포배양에 사용된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지와 trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco Laboratories사에서 구입하였으며, L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96 well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
- 세포배양 − 마우스 해마유래의 HT22 세포주는 묵인희 교수(서울대학교)로부터 분양받아 사용하였다. D-MEM 배지에 10% FBS와 1% antibiotics를 첨가하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 1-2일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
- HO-1 발현정도의 비교는 HO-1 유도 약물로 알려진 cobalt protoporphyrin (CoPP) 20 µM을 사용하였다.
- 세포배양 − 마우스 해마유래의 HT22 세포주는 묵인희 교수(서울대학교)로부터 분양받아 사용하였다.
- 세포배양에 사용된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지와 trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), fetal bovine serum(FBS)은 Gibco Laboratories사에서 구입하였으며, L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
- 시약 및 기기 −시료 추출 및 분획에 사용된 용매인 ethanol, n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate 그리고 n-butanol은 특급시약을 사용하였다.
- 실험 재료 − 본 실험에 사용된 마치현(Portulaca oleracea L.)은 2013년 3월 대구광역시 약령 시장에서 건조된 것을 구입하여 사용하였으며, 형태학적 평가를 통하여 동정하였고 표본(KMP2013-03)을 제작하여 계명대학교 약학대학 생약학연구실에 보관하였다.
이론/모형
- (A) Cells were treated with samples and then incubated for 12 h. Cell viability was measured by MTT assay. (B) After incubated 12 h with the treatment of glutamate (5 mM).
- 글루타메이트 유도 뇌세포 보호효과 측정 − glutamate로 유도한 뇌세포 독성에 대한 보호 효과는 정등의 방법18)에 따라 실시하였다.
성능/효과
- 12) 치매 중에서도 알츠하이머성 치매는 가장 흔한 질환중의 하나이며, 알츠하이머는 뇌세포의 통신에 필요한 시스템 2종에 문제가 발생하여 일어나는데, 하나는 뇌신경 전달물질인 아세틸콜린의 감소이며, 하나는 또 다른 신경전달 물질인 글루타메이트가 과다 활성화되어 신경세포의 손상과 사멸이 진행되는 것이다.13,14)
- 또한, 뇌세포의 보호기전에서 중요한 역할을 하는 단백질인 heme oxygenase (HO)-1는 HT22세포에 ethyl acetate 분획물을 12시간 처리한 후 western blot을 통하여 단백질 발현정도를 확인하였다. 그 결과, ethyl acetate 분획물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 HO-1 발현이 증가하였다(Fig. 2). HO-1 발현정도의 비교는 HO-1 유도 약물로 알려진 cobalt protoporphyrin (CoPP) 20 µM을 사용하였다.
- 21-24) 마치현 ethyl acetate 분획물이 HO-1발현에 MAPK가 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 마치현 ethyl acetate 분획물을 200 µg/ml을 시간별(15, 30, 45, 60분)로 처리하고 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과, 시간이 경과함에 따라 ERK와 JNK 인산화가 증가하는 것으로 확인되었으며(Fig. 4B), 다른 단백질에는 크게 영향을 미치지 않았다(Fig. 4A, 4C). 마치현 ethyl acetate 분획물의 HO-1발현증가가 이들 두 단백질의 인산화를 통하여 일어나는 것인지 확인하기 위하여, 분획물을 처리한 다음 ERK,25) JNK,26) p38의 inhibitor를27) 처리하여 HO-1발현정도를 확인한 결과, p38의 억제제인 SB203580를 함께 처리했을 시에는 HO-1의 발현과 세포보호 효과에 큰 영향을 미치지 못했지만, ERK의 억제제인 PD98059와 JNK의 억제제인 SP600125 처리했을 시에는 HO-1의 발현이 줄어들고 세포 보호 효과 또한 감소하는 것을 확인하였다.
- 따라서 본 연구를 통하여 마치현 ethyl acetate 분획물은 생쥐유래 해마 세포 HT22에서 글루타메이트로 유도한 세포손상 억제에 강력한 효과를 나타내었으며, HO-1 단백질 발현을 크게 증가시켰다. 이는 MAPKs중 ERK, JNK pathway 인산화와 Nrf2 단백질의 핵내 전사 유도를 통하여 세포 보호 효과 및 HO-1 단백질 발현을 증가시킨다는 사실을 확인하였다.
- 마치현 ethyl acetate 분획물의 HO-1발현증가가 이들 두 단백질의 인산화를 통하여 일어나는 것인지 확인하기 위하여, 분획물을 처리한 다음 ERK,25) JNK,26) p38의 inhibitor를27) 처리하여 HO-1발현정도를 확인한 결과, p38의 억제제인 SB203580를 함께 처리했을 시에는 HO-1의 발현과 세포보호 효과에 큰 영향을 미치지 못했지만, ERK의 억제제인 PD98059와 JNK의 억제제인 SP600125 처리했을 시에는 HO-1의 발현이 줄어들고 세포 보호 효과 또한 감소하는 것을 확인하였다. 또한 HO-1 inhibitor로 알려진 SnPP와 마치현 ethyl acetate 분획물을 함께 처리하였을 때 HO-1이 발현되는 것을 확인되었다(Fig. 5).
- 4A, 4C). 마치현 ethyl acetate 분획물의 HO-1발현증가가 이들 두 단백질의 인산화를 통하여 일어나는 것인지 확인하기 위하여, 분획물을 처리한 다음 ERK,25) JNK,26) p38의 inhibitor를27) 처리하여 HO-1발현정도를 확인한 결과, p38의 억제제인 SB203580를 함께 처리했을 시에는 HO-1의 발현과 세포보호 효과에 큰 영향을 미치지 못했지만, ERK의 억제제인 PD98059와 JNK의 억제제인 SP600125 처리했을 시에는 HO-1의 발현이 줄어들고 세포 보호 효과 또한 감소하는 것을 확인하였다. 또한 HO-1 inhibitor로 알려진 SnPP와 마치현 ethyl acetate 분획물을 함께 처리하였을 때 HO-1이 발현되는 것을 확인되었다(Fig.
- 1A). 세포를 배양한 후 5 mM의 글루타메이트를 12시간 처리하였을 때 글루타메이트 비 처리군에 비해 세포생존률이 60%이하로 감소하여 세포 손상을 유도하였으며, 이에 마치현 추출물과 분획물을 농도별로 처리한 결과 각 층에서 세포 보호 활성을 나타내었으며, 그 중 Ethyl acetate 층이 다른 분획층에 비해 우수한 보호 활성을 나타내었다(Fig. 1B).
- 따라서 본 연구를 통하여 마치현 ethyl acetate 분획물은 생쥐유래 해마 세포 HT22에서 글루타메이트로 유도한 세포손상 억제에 강력한 효과를 나타내었으며, HO-1 단백질 발현을 크게 증가시켰다. 이는 MAPKs중 ERK, JNK pathway 인산화와 Nrf2 단백질의 핵내 전사 유도를 통하여 세포 보호 효과 및 HO-1 단백질 발현을 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 추후 마치현 ethyl acetate 분획물의 추가적인 뇌세포 보호기전 연구와 활성 물질 분리, 구조 및 동물 실험에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이와 같은 결과를 바탕으로 HO-1발현을 증가시킨 마치현 ethyl acetate 분획물이 Nrf2 단백질을 핵내 이동에 미치는 영향을 확인해보기 위해 HT22 세포에 200 µg/ml 농도로 시간별로 처리하고 단백질 발현 정도를 확인해 본 결과, 0.5, 1, 1.5시간이 증가함에 따라 세포질의 Nrf2 발현이 감소하는 것과는 대조적으로 핵내의 발현은 증가하였다(Fig. 3).
후속연구
- 이는 MAPKs중 ERK, JNK pathway 인산화와 Nrf2 단백질의 핵내 전사 유도를 통하여 세포 보호 효과 및 HO-1 단백질 발현을 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 추후 마치현 ethyl acetate 분획물의 추가적인 뇌세포 보호기전 연구와 활성 물질 분리, 구조 및 동물 실험에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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