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문제 정의
- 여기에 추가적으로 쥐에서 적출한 흉선과 비장세포의 증식율에 대한 영향을 분석한 결과 C6 세포주에 처리한 비자 열수추출물과 같은 농도에서 흉선세포는 증식을 촉진하는 경향이 확인(Figure 3B)되었고, 비장세포는 별다른 경향성이 확인되지 않았다(Figure 3C). 따라서 본 연구에서 사용한 비자 열수추출물은 뇌신경 아교종 세포주에는 독성을 나타내지 않았지만 오히려 생체에서 적출한 흉선세포와 비장 세포에 대해서는 증식율이 증가되어 안전성을 확인한 바 본 연구를 통해 비자 과육과 종자피를 이용해 다양한 제품으로의 활용이 가능하리라 판단하였다.
- 그동안 비자는 추출물 자체에 대한 항산화 기능에 대한 연구가 진행된바 있으나, 알츠하이머, 치매 등 현대인의 고령화에 따른 뇌신경변성질환에 대한 활용가능성을 검토하기 위해서는 뇌신경세포에 대한 항산화 활성에 대한 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 비자의 항산화 기능성 소재로서 연구개발가능성을 탐색하기 위하여, 항산화 활성 성분들의 함량을 분석하고, 비자 열수추출물(Torreyae Semen hot water extracts, TS)의 항산화 활성을 확인하고, 세포 단위에서 안전성을 확인한 농도에서 산화적 스트레스에 대한 세포보호 효능을 확인하였다.
- 따라서 본 연구에서는 일반적으로 알려져 있는 비자 및 유사식물에서 확인된 활성성분 중 항산화 활성이 있는 성분들의 질량분석 조건을 선택적으로 추적하기 위하여, multiple reaction monitoring(MRM)이 가능한 액체크로마토그래피- 질량분석기(LC-MS/MS)를 활용하여 활성성분의 screening분석을 시도하였다.
- 본 연구는 비자의 열수 추출물에 대한 항산화 활성 및 뇌신경세포에 대한 산화적 손상에 대한 보호효과를 확인하여 천연소재로서의 활용가능성을 높일 수 있는 결론을 얻었다.
- 이러한 결과를 바탕으로 같은 농도에서 다양한 산화적 스트레스에 의한 뇌신경세포 손상에 대한 보호효과를 확인하였다. 먼저 아무것도 처리하지 않은 C6 세포주 생존율에 비하여, H2O2를 처리한 결과 30.
제안 방법
- 100 ㎜ dish에 각각 1×106개의 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2를 유지하면서 24시간 pre-incubation시킨 후 시료를 처리한 다음 다시 24시간 배양하였다. 24시간 배양이 끝나고, 세포를 수집한 다음 -20℃에서 20분간 냉동 후 항온 수조를 이용하여 37℃에서 10분간 방치하기를 2회 반복하여 세포를 파쇄한 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 기질로 사용하여, glutathione 함량을 측정하였다. 측정 과정은 제조자가 제시한 지침에 따라 ELIZA reader를 사용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포가 부착한 후 최적의 증식율을 나타낸 시료를 처리하고 동일한 환경에서 24시간 방치하였다. 24시간 배양이 끝난 후 sodium nitroprusside (SNP), 과산화수소 (hydrogen peroxide, H2O2) 그리고 rotenone를 각각 처리하고 37℃, 5% CO2가 유지되는 환경에 3시간 배양 후 배양액을 제거하고 각 well에 새로운 배지를 넣고 21시간 배양하였다. 그리고 세포에 Ezcytox를 10 ㎕씩 넣어 2시간 후 Microplate Reader 를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 2 M구연산 완충액을 가하여 총 부피를 10 ㎖로 하였다. 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 각 반응액 1 ㎖를 취하여 2% 초산용액 3 ㎖와 30% 초산용액으로 용해한 Griess 시약(1% sulfanilicacid: 1% naphtylamine= 1:1) 0.4 ㎖를 차례로 가한 후 진탕 혼합하여 실온에서 15분간 방치 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 Griess 시약 대신 증류수를 가하여 측정하였다.
- Ez-cytox assy 방법을 이용하여 시료가 C6 뇌교세포주의 증식율에 미치는 영향을 확인하였다. C6 뇌교세포주를 96 well plate에 7×103 cell/well의 농도로 분주하고 배양기에서 37℃, 5% CO2를 유지하면서 24시간 pre-incubation 시킨 후 시료를 농도별(15.
- 1% formic acid와 5 mM ammonium acetate를 포함하는 methanol을 사용하였다. LC-MS/MS에서 성분별 MRM 조건은 Table 1과 같이 설정하였으며, 공통적으로 negative ESI mode에서 분석을 실시하였다.
- 을 변형하여 측정하였다. Methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 0 ∼ 500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- 흰쥐의 뇌세포에서 유래한 교세포주인 C6 glioma cell은 한국 세포주은행 (서울, 한국)에서 동결 상태로 구입하여 사용하였다. 교세포주를 RPMI 배지에 10% (v/v) Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco)과 항생제 (Antibiotic antimycotic)를 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 배양기에서 배양하였다. 세포는 T-75 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 세포의 탈착을 위하여 인산완충액 (Phosphate buffered saline, PBS)으로 가볍게 세척한 다음, Trypsin-EDTA (Sigma, USA)를 처리한 후 37℃에서 5분간 방치하였다가 세포를 채집하였으며, 계대 배양은 2∼3일에 1회씩 시행하였다.
- 5, 125, 250 ㎍/㎖)로 처리한 다음 24시간 배양하였다. 그리고 Ez-cytox 를 처리하여 2시간 배양한 후 Microplate Reader (Biorad, USA)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 뇌신경 세포의 항산화 성분 함량을 확인하기 위하여 C6 세포주에 농도별로 비자열수추출물을 처리하고 총 glutathione함량을 분석하였다. 그 결과 비자열수추출물을 처리하지 않은 군에서 100.
- 4 ㎖를 차례로 가한 후 진탕 혼합하여 실온에서 15분간 방치 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 Griess 시약 대신 증류수를 가하여 측정하였다.
- 분리된 흉선 세포 부유액을 RPMI 1640 배지로 희석하고 96 well plate에 5.0×105cells/well 농도로 접종한 다음 흉선 세포에 Con A 10 ㎍/㎖와 시료를 농도별(15.6, 31.2, 62.5, 125, 250 ㎍/㎖)로 첨가한 후 37℃의 CO2 배양기에서 48 시간 배양한 다음 Ez-cytox 15 ㎕를 각 well에 첨가하고 차광상태에서 2시간 정도 배양한 이후, 각 well의 흡광도를 Microplate Reader로 450 ㎚에서 측정하였다.
- 산화적 스트레스에 의한 세포의 사멸 보호효과는 Ez-cytox법을 변형하여 측정하였다. 세포주를 96 well plate에 well 당 5×103 cells/well개씩 분주한 후 37℃, 5% CO2가 유지되는 환경에 24시간 방치한 다음 부착을 시행하였다.
- 생쥐의 비장을 적출한 뒤 분리된 비장 세포 부유액을 RPMI 1640 배지로 희석하고 96 well plate에 5.0×105 cells/well 농도로 접종한 다음 비장 세포에 LPS 10 ㎍/㎖와 시료를 농도별(15.6, 31.2, 62.5, 125, 250 ㎍/㎖)로 첨가한 후 37℃의 CO2 배양기에서 48 시간 배양한 다음 Ez-cytox 15 ㎕를 각 well에 첨가하고 차광상태에서 2시간정도 배양한 후, 각 well의 흡광도를 Microplate Reader로 450 ㎚에서 측정하였다.
- 세포는 T-75 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 세포의 탈착을 위하여 인산완충액 (Phosphate buffered saline, PBS)으로 가볍게 세척한 다음, Trypsin-EDTA (Sigma, USA)를 처리한 후 37℃에서 5분간 방치하였다가 세포를 채집하였으며, 계대 배양은 2∼3일에 1회씩 시행하였다.
- 세포에 대한 안전성이 확인된 농도에서 항산화 효능이 있는지를 확인하기 위하여 free radical과 hydrogen peroxide등으로부터 세포를 보호하는 항산화제인 glutathione17)의 함량을 측정하였다. 쥐의 뇌신경아교종세포주인 C6 세포에 비자열수 추출물을 0 ㎎/㎖, 0.
- 위 항산화 효능을 토대로 하여 뇌신경 세포 수준의 항산화효능을 확인하고자 먼저 뇌신경세포 증식율에 미치는 영향을 분석하여 보았다. 그 결과 쥐의 뇌신경아교종세포주인 C6 세포의 생존율에 대하여 0 ㎎/㎖ 농도부터 0.
- 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)은 자체가 매우 안정한 유리기로서 517 ㎚에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물로서, 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화기작 중 양자라디칼의 안정화에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있다. 전자공여능은 Bios의 방법9)을 변형하여 DPPH 200 ㎛을 methanol에 녹인 다음 이 용액을 900 ㎕와 시료 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 30분간 방치한 다음 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 유리기 소거활성(% inhibition)은 아래와 같이 계산을 하고, 양성대조군으로 높은 항산화활성을 갖는 ascorbic acid를 사용하였다.
- 쥐의 뇌신경아교종세포주인 C6 세포의 산화적 손상에 대한 세포 보호 효과를 확인하기 위하여 산화적 스트레스를 일으켜 신경세포에 손상을 주는 sodium nitroprusside (SNP)와 hydrogen peroxide18), 살충제 용도로 사용되어 생체의 각종 세포에 산화적 영향을 주는 rotenone19) 등을 처리하여 산화적 스트레스에 의한 세포손상을 유발한 다음 비자열수추출물이 0 ㎎/㎖, 0.031 ㎎/㎖, 0.063 ㎎/㎖ 농도에서의 보호효과가 있는지에 대하여 확인하였다. 그 결과 H2O2 유발 산화적 손상시 세포생존율 30.
- 총 플라보노이드 함량은 다음과 같이 Moreno 등의 방법8)을 변형하여 측정하였다. Methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출물 중에 존재하는 항산화 활성 성분의 screening 분석을 위해 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)를 활용한 분석을 실시하였다. LC-MS/MS를 활용한 screening 분석은 1200 series LC와 연동된 6410A MS(Aglient, USA) 기기를 이용하였다.
- 24시간 배양이 끝나고, 세포를 수집한 다음 -20℃에서 20분간 냉동 후 항온 수조를 이용하여 37℃에서 10분간 방치하기를 2회 반복하여 세포를 파쇄한 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 기질로 사용하여, glutathione 함량을 측정하였다. 측정 과정은 제조자가 제시한 지침에 따라 ELIZA reader를 사용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 표준물질로 chlorogenic acid를 0∼500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 표준 검량선을 작성하고 총 polyphenol 함량을 ㎎/g로 나타내었다.
- 표준물질로 quercetin을 0 ∼ 500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
대상 데이터
- 추출물 중에 존재하는 항산화 활성 성분의 screening 분석을 위해 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)를 활용한 분석을 실시하였다. LC-MS/MS를 활용한 screening 분석은 1200 series LC와 연동된 6410A MS(Aglient, USA) 기기를 이용하였다. 분석용 column은 Phenomenex C18 (150 × 4.
- 고농도에서 나타나는 세포독성이 동물의 흉선세포와 비장세포에서도 나타나는지 확인하기 위하여 실험동물윤리위원회(승인번호:2016-10-03)의 승인을 받고 7주령 수컷, Balb/c 마우스를 1주일간 실험실에 적응 시킨 다음 흉선과 비장의 적출을 진행하였다.
- 본 실험에 사용된 비자(Torreyae Semen)는 전남 나주시 다도면 덕용산 일대에서 자생하고 있는 朱木科에 속한 상록교목인 비자나무 Torreya nucifera Siebold et Zuccarini 의 성숙한 열매2) 중 과육과 비자종자피 등을 음건한 상태로 사용하였다.
- 에서 확인된 109 ㎎/g 의 함량과는 근소한 차이가 있는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 사용한 비자는 전남 나주시 덕용산에서 자생하는 비자를 채취하여 사용하였고, 전의 연구에서 사용한 비자는 대구광역시 약령시장에서 한방생약재료로 판매하는 비자를 사용하였다는 점에서 원재료 상의 차이가 있다. 그리고, 추출방식으로서 열수 환류 추출을 사용한 점은 같으나, 본 연구에서는 105℃에서 2시간 동안 추출하였으나, 전의 연구에서는 80℃에서 3시간 동안 추출하였다는 차이가 있다.
- 분석용 column은 Phenomenex C18 (150 × 4.6 ㎜, 3 ㎛)을 사용하였으며, column oven의 온도는 35℃로 설정하였다.
- 비자열매 100g을 증류수 1,200 ㎖로 105℃에서 2시간동안 煎湯한 다음 추출액을 3,000 rpm하에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액을 rotary vacuum evaporator로 감압 농축하고, 이를 -84℃ deep freezer에서 24시간 동안 방치 한 후 freeze dryer로 동결건조한 결과 4.8 g의 건조분말(수득율 4.8%)을 획득하였다.
- 6 ㎜, 3 ㎛)을 사용하였으며, column oven의 온도는 35℃로 설정하였다. 이동상 A로서 0.1% formic acid와 5 mM ammonium acetate를 포함하는 증류수를, 이동상 B로서 0.1% formic acid와 5 mM ammonium acetate를 포함하는 methanol을 사용하였다. LC-MS/MS에서 성분별 MRM 조건은 Table 1과 같이 설정하였으며, 공통적으로 negative ESI mode에서 분석을 실시하였다.
- 흰쥐의 뇌세포에서 유래한 교세포주인 C6 glioma cell은 한국 세포주은행 (서울, 한국)에서 동결 상태로 구입하여 사용하였다. 교세포주를 RPMI 배지에 10% (v/v) Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco)과 항생제 (Antibiotic antimycotic)를 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- 본 연구의 통계학적 분석은 SigmaPlot 11을 사용하였고, 각 군의 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었다. 모든 대조군과 실험군의 통계적 유의성 검증은 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)으로 분석하여, 사후검정은 Tukey`s multiple range test를 실시하고, 분석 시 p 값이 0.05 미만일 때 유의하다고 판단하였다.
- 본 연구의 통계학적 분석은 SigmaPlot 11을 사용하였고, 각 군의 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었다. 모든 대조군과 실험군의 통계적 유의성 검증은 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)으로 분석하여, 사후검정은 Tukey`s multiple range test를 실시하고, 분석 시 p 값이 0.
이론/모형
- Total glutathione 함량 측정은 Total glutathione Quantification kit (Dojindo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 100 ㎜ dish에 각각 1×106개의 세포를 분주하고 37℃, 5% CO2를 유지하면서 24시간 pre-incubation시킨 후 시료를 처리한 다음 다시 24시간 배양하였다.
- 아질산염 (Nitrite) 소거작용 측정은 Kato 등과 김 등의 방법10)에 따라 1 mM NaNO2 1 ㎖에 각 시료 1 ㎖를 가하고 0.1N HCl를 이용하여 pH 2.5로 보정하고 0.2 M구연산 완충액을 가하여 총 부피를 10 ㎖로 하였다. 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 각 반응액 1 ㎖를 취하여 2% 초산용액 3 ㎖와 30% 초산용액으로 용해한 Griess 시약(1% sulfanilicacid: 1% naphtylamine= 1:1) 0.
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② Splenocytes 증식율 측정
정상 생쥐의 비장 세포 분리는 Wysocki 및 Mizel 등의 방법에 의하여 실시하였다
. 생쥐의 비장을 적출한 뒤 분리된 비장 세포 부유액을 RPMI 1640 배지로 희석하고 96 well plate에 5. -
① Thymocytes 증식율 측정
정상 생쥐의 흉선 세포 분리는 Wysocki11) 및 Mizel12)등의 방법에 의하여 실시하였다. 분리된 흉선 세포 부유액을 RPMI 1640 배지로 희석하고 96 well plate에 5.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법7)을 응용하였다. Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 Folin-Denis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 후, 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간 동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96 well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 1. 비자열수추출물의 총 플라보노이드 함량은 0.36 ± 0.14 ㎍/㎎ 였으며, 총 폴리페놀 함량은 0.36 ± 0.14 ㎍/㎎ 로 확인되었으며, gallic acid, gallocatechin, catechin, caffeic acid, chlorogenic acid 등이 함유되어 있는 것으로 확인 되었다.
- 2. 비자열수추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성과 아질산염소거능은 농도 의존적인 것으로 확인 되었다.
- 3. 비자열수추출물은 0-0.250 ㎎/㎖ 농도에서 C6 뇌아교종세포주와 쥐에서 적출한 흉선 및 비장 세포에 대하여 안전한 것으로 확인되었다.
- 4. 비자열수추출물은 0.031 ㎎/㎖, 0.063 ㎎/㎖ 농도에서 유의성 있게 Total glutathione 함량이 증가하는 것으로 확인되었다.
- 5. 비자열수추출물은 H2O2, SNP, Rotenone이 유발하는 산화적 스트레스에 의한 세포손상에 대하여 0.031 ㎎/㎖, 0.063 ㎎/㎖ 농도에서 보호효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 0 %로 보호효과를 확인(Figure 4B)할 수 있었다. SNP 유발 산화적 손상시 세포생존율 7.3 %에 대하여 0.031 ㎎/㎖ 처리시는 15.6 %, 0.063 ㎎/㎖ 처리시 17.3 %로 농도가 상승함에 따라 보호효과도 상승하는 것을 확인(Figure 4C)할 수 있었다. 그리고 Rotenone 유발 산화적 손상시 세포생존율 58.
- 결론적으로 비자열수추출물은 항산화 활성 효과가 있다고 보여 지며, 산화적 스트레스에 의한 뇌세포보호효과를 갖는 천연소재로서 활용가능성을 확인할 수 있었다.
- 063 ㎎/㎖ 농도에서의 보호효과가 있는지에 대하여 확인하였다. 그 결과 H2O2 유발 산화적 손상시 세포생존율 30.7 % 에 대하여 0.031 ㎎/㎖ 처리시는 24.0 %로 보호효과가 없었으나, 0.063 ㎎/㎖ 처리시 41.0 %로 보호효과를 확인(Figure 4B)할 수 있었다. SNP 유발 산화적 손상시 세포생존율 7.
- 그 결과 비자열수추출물을 처리하지 않은 군에서 100.0 ± 1.4 %에 비하여 0.031 ㎎/㎖ 농도에서 130.6± 2.2 %, 0,063 ㎎/㎖ 농도에서 166.9 ± 2.7 % 로 확인되어 비자열수추출물의 농도에 의존적으로 총 glutathione 함량이 상승하는 것으로 확인(Fig 4A)되었다.
- 그 결과 생쥐에서 적출한 흉선세포에 대해서 비자 추출물 0 ㎎/㎖ 농도를 처리한 증식율을 100 ± 2.2 %라 하였을 때, 0.016 ㎎/㎖ 농도에서는 104.6 ± 2.8 %, 0.031 ㎎/㎖ 농도에서는 91.9 ± 4.0 %로 감소하는 듯 하였으나 투여농도가 증가할수록 0.063 ㎎/㎖ 농도에서는 111.3 ± 3.7 %, 0.125 ㎎/㎖ 농도에서는 121.1 ± 3.4 %, 0.250 ㎎/㎖ 농도에서는 155.4 ± 22.8 %로 나타나서 농도의존적으로 증식을 촉진시키는 것으로 확인되었다(Fig 3B.).
- 위 항산화 효능을 토대로 하여 뇌신경 세포 수준의 항산화효능을 확인하고자 먼저 뇌신경세포 증식율에 미치는 영향을 분석하여 보았다. 그 결과 쥐의 뇌신경아교종세포주인 C6 세포의 생존율에 대하여 0 ㎎/㎖ 농도부터 0.250 ㎎/㎖ 농도에 이르기까지 독성은 확인되지 않았다(Figure 3A). 여기에 추가적으로 쥐에서 적출한 흉선과 비장세포의 증식율에 대한 영향을 분석한 결과 C6 세포주에 처리한 비자 열수추출물과 같은 농도에서 흉선세포는 증식을 촉진하는 경향이 확인(Figure 3B)되었고, 비장세포는 별다른 경향성이 확인되지 않았다(Figure 3C).
- 0 %의 소거 활성을 나타내었다. 그래서 비자 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 농도의존적으로 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 대조구로 사용한 Ascorbic acid는 0.
- 3 %로 농도가 상승함에 따라 보호효과도 상승하는 것을 확인(Figure 4C)할 수 있었다. 그리고 Rotenone 유발 산화적 손상시 세포생존율 58.8 %에 대하여 0.031 ㎎/㎖ 처리시는 65.5 %, 0.063 ㎎/㎖ 처리시 80.0 %로 농도의존적인 세포보호효과를 확인(Figure 4D)할 수 있었다.
- 0 ㎎/㎖ 농도에서 농도가 높을수록 아질산염 소거 활성이 높아지는 것을 확인((Figure 2B)할 수 있었다. 단일 성분인 ascorbic acid와 효능을 비교하면, 0.2 ㎎/㎖ 농도에서 11.4 %, 1.0 ㎎/㎖ 농도에서는 56.2 %, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서는 36.3 %로 전체 농도에 걸쳐 비교적 약한 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 이와 같이, 비자열수추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성과 아질산염 소거능을 분석한 결과, 농도에 따라 효능이 높아지는 것을 확인할 수 있었으나, 단일성분인 ascorbic acid에 비하면 낮은 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 0 ㎎/㎖ 농도에서 농도가 높을수록 라디칼 소거 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 단일 성분인 ascorbic acid와 효능을 비교하면, 0.2 ㎎/㎖ 농도에서 19.5 %, 1.0 ㎎/㎖ 농도에서는 47.4 % 정도로 낮았으나 10.0 ㎎/㎖ 농도에서는 99.4 %로 대등한 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 한편, 아질산염 소거능을 분석(Figure 2B)한 결과 0.
- 대조구로 사용한 Ascorbic acid는 0.2 ㎎/㎖ 농도에서 18.3 ± 3.0 %, 1.0 ㎎/㎖ 농도에서 60.4 ± 0.3 %, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서 95.3 ± 0.1 %의 소거 활성을 나타내었다.
- 대조구로 사용한 Ascorbic acid는 0.2 ㎎/㎖ 농도에서 74.1 ± 0.5 %, 1.0 ㎎/㎖ 농도에서 96.5 ± 0.0 %, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서 96.5 ± 0.0 %의 소거 활성을 나타내었다.
- 따라서 비자열수추출물이 함유하는 폴리페놀, 플라보노이드 성분함량을 분석함으로써 항산화 효능을 가질 것으로 추측할 수 있었다.
- 또한 대조군의 C6 세포주 생존율에 비하여, Rotenone을 처리한 결과 58.8 ± 3.6 %의 생존율이 확인되었으나, 비자열수추출물을 0.031 ㎎/㎖ 농도로 함께 처리한 결과 65.5 ± 6.4 %, 0.063 ㎎/㎖ 농도로 처리한 결과 80.0 ± 5.5 % 로 확인되어 산화적 손상에 대한 보호효과를 확인할 수 있었다(Fig 4C).
- 또한 대조군의 C6 세포주 생존율에 비하여, SNP를 처리한 결과 7.3 ± 0.6 %의 생존율이 확인되었으나, 비자열수추출물을 0.031 ㎎/㎖ 농도로 함께 처리한 결과 15.6 ± 1.7 %, 0.063 ㎎/㎖ 농도로 처리한 결과 17.3 ± 1.4 % 로 확인되어 산화적 손상에 대한 보호효과를 확인할 수 있었다(Fig 4C).
- 또한 본 연구에서 사용한 LC-MS/MS 기기를 활용하여 분석한 결과 비자 열수추출물에는 gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, gallocatechin, catechin 등이 함유되어 있는 것으로 확인되었다(Fig 1, Table 3). 활성성분 screening 분석에서 확인된 성분들은 대부분 폴리페놀이나 플라보노이드로 분류할 수 있는 성분들이었으며, 특히 항산화활성을 포함하는 다양한 생리활성에 기여도가 높은 것으로 보고되고 있는 성분들이었다.
- 의 연구에 따르면 비자에는 palmitic acid, oleic acid, stearic acid 등의 지방유와 tannin, 정유, 다당류 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한 비자는 비자나무의 줄기나 잎에 비하여 탄수화물, 조지방, 수용성 단백질, 환원당, 유리당의 함량이 높아 식용유지자원으로서 이용가치가 높으며, 특히 종자 내피에 함유된 폴리페놀 함량이 높다. 비자의 열수추출물에는 flavonoids, polyphenol 성분이 함유되어 있어, tyrosinase 저해, 아질산염 소거능, SOD 유사활성, 전자공여능, Xanthine oxidase 저해효능을 확인할 수 있었으며, 따라서 물을 용매로 하여 추출하는 것이 다른 용매를 이용한 추출방식에 비하여 다양한 항산화 활성에 기여하는 것으로 확인4)된 바있다.
- 먼저 아무것도 처리하지 않은 C6 세포주 생존율에 비하여, H2O2를 처리한 결과 30.7 ± 7.5 %의 생존율이 확인되었으나, 비자열수추출물을 0.031 ㎎/㎖ 농도로 함께 처리한 결과 24.0± 4.5 %, 0.063 ㎎/㎖ 농도로 처리한 결과 41.0 ± 5.5 % 로 확인되어 0.031 ㎎/㎖ 농도에서는 보호효과가 확인되지 않았으나, 0.063 ㎎/㎖ 농도에서는 H2O2로 유발한 산화적 손상에 대한 보호효과를 확인할 수 있었다(Fig 4B).
- 본 연구에서 분석한 성분들 중에서 비자 열수추출물에 존재하는 항산화활성 성분 중 가장 많은 함량을 가지는 것으로 추정되는 성분은 gallic acid였으며, 다음으로는 chlorogenic acid로 나타났으며, caffeic acid와 일부 catechin 류 등이 확인되었다. 이는 Table 2의 총 폴리페놀 함량과 연관지어볼 때 대표적인 phenolic acid류로서 총 폴리페놀에 포함되는 성분인 gallic acid나 chlorogenic acid 등이 상당량 함유되어 있는 분석 결과가 총 폴리페놀 함량에도 기여한 것으로 판단할 수 있었다.
- 그 중에서 플라보노이드는 식물이 자외선으로부터 자신을 보호하기 위해 만들어내는 천연물질로서 대표적인 항산화 물질 중의 하나16)이다. 본 연구에서 확인된 비자 열수추출물의 폴리페놀 함량은 92.00 ㎎/g 내외로 확인(Table 1)되었고, 플라보노이드 함량은 0.36 ㎎/g으로 확인되었다.
- 비자 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 0.2 ㎎/㎖ 농도에서 14.5 ± 1.3 %, 1.0 ㎎/㎖ 농도에서 45.8 ± 0.5 %, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서 96.0 ± 0.0 %의 소거 활성을 나타내었다.
- 비자 열수추출물의 수율은 4.8%였으며, 총 플라보노이드 함량은 총 폴리페놀함량은 92.00 ± 1.24 ㎎/g이었으며, 총 폴리페놀 함량은 0.36 ± 0.14 ㎎/g 으로 나타났다.
- 비자 열수추출물의 아질산염 소거활성은 0.2 ㎎/㎖ 농도에서 2.1 ± 2.7 %, 1.0 ㎎/㎖ 농도에서 34.0 ± 0.7 %, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서 34.6 ± 1.9 %의 소거 활성을 나타내었다.
- 9 %의 소거 활성을 나타내었다. 비자 열수추출물의 아질산염 소거활성은 농도의존적으로 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 대조구로 사용한 Ascorbic acid는 0.
- 0 %의 소거 활성을 나타내었다. 비자열수추출물은 0.2 ㎎/㎖ 농도와 1.0 ㎎/㎖ 농도에서는 Ascorbic acid에 비해서 낮은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈으나, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서는 유사한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈다. (Fig.
- 비자열수추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 뇌신경아교종세포주인 C6 세포에 농도별로 처리하여 24시간 배양한 결과 0 ㎎/㎖ 농도의 생존율을 100%로 환산할 때, 0.016 ㎎/㎖ 농도에서는 96.2 ± 0.4 %, 0.031 ㎎/㎖ 농도에서는 82.5 ± 11.6 %, 0.063 ㎎/㎖ 농도에서는 96.7 ± 0.4 %, 0.125 ㎎/㎖ 농도에서는 95.4 ± 0.5 %, 0.250 ㎎/㎖ 농도에서는 93.1 ± 0.7 %로 나타났다.
- 또한 비자는 비자나무의 줄기나 잎에 비하여 탄수화물, 조지방, 수용성 단백질, 환원당, 유리당의 함량이 높아 식용유지자원으로서 이용가치가 높으며, 특히 종자 내피에 함유된 폴리페놀 함량이 높다. 비자의 열수추출물에는 flavonoids, polyphenol 성분이 함유되어 있어, tyrosinase 저해, 아질산염 소거능, SOD 유사활성, 전자공여능, Xanthine oxidase 저해효능을 확인할 수 있었으며, 따라서 물을 용매로 하여 추출하는 것이 다른 용매를 이용한 추출방식에 비하여 다양한 항산화 활성에 기여하는 것으로 확인4)된 바있다.
- 생쥐에서 적출한 비장세포에 대해서 0 ㎎/㎖ 농도에서 증식율 100 ± 2.0 %에 비하여, 0.016 ㎎/㎖ 농도에서는 110.6 ± 3.8 %, 0.031 ㎎/㎖ 농도에서는 116.6 ± 5.4 %, 0.063 ㎎/㎖ 농도에서는 95.4 ± 3.8 %, 0.125 ㎎/㎖ 농도에서는 110.6 ± 3.7 %, 0.250 ㎎/㎖ 농도에서는 107.6 ± 0.8 %로 나타나서 전체적으로 증식을 촉진시키는 경향이 있는 것으로 확인되었다.
- 250 ㎎/㎖ 농도에 이르기까지 독성은 확인되지 않았다(Figure 3A). 여기에 추가적으로 쥐에서 적출한 흉선과 비장세포의 증식율에 대한 영향을 분석한 결과 C6 세포주에 처리한 비자 열수추출물과 같은 농도에서 흉선세포는 증식을 촉진하는 경향이 확인(Figure 3B)되었고, 비장세포는 별다른 경향성이 확인되지 않았다(Figure 3C). 따라서 본 연구에서 사용한 비자 열수추출물은 뇌신경 아교종 세포주에는 독성을 나타내지 않았지만 오히려 생체에서 적출한 흉선세포와 비장 세포에 대해서는 증식율이 증가되어 안전성을 확인한 바 본 연구를 통해 비자 과육과 종자피를 이용해 다양한 제품으로의 활용이 가능하리라 판단하였다.
- 본 연구에서 분석한 성분들 중에서 비자 열수추출물에 존재하는 항산화활성 성분 중 가장 많은 함량을 가지는 것으로 추정되는 성분은 gallic acid였으며, 다음으로는 chlorogenic acid로 나타났으며, caffeic acid와 일부 catechin 류 등이 확인되었다. 이는 Table 2의 총 폴리페놀 함량과 연관지어볼 때 대표적인 phenolic acid류로서 총 폴리페놀에 포함되는 성분인 gallic acid나 chlorogenic acid 등이 상당량 함유되어 있는 분석 결과가 총 폴리페놀 함량에도 기여한 것으로 판단할 수 있었다.
- 이와 같은 결과를 통해 본 연구에서는 비자 열수추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 분석(Figure 2A)한 결과 0.2 ㎎/㎖농도, 1.0 ㎎/㎖ 농도, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서 농도가 높을수록 라디칼 소거 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 단일 성분인 ascorbic acid와 효능을 비교하면, 0.
- 3 %로 전체 농도에 걸쳐 비교적 약한 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 이와 같이, 비자열수추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성과 아질산염 소거능을 분석한 결과, 농도에 따라 효능이 높아지는 것을 확인할 수 있었으나, 단일성분인 ascorbic acid에 비하면 낮은 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
- 의 함량을 측정하였다. 쥐의 뇌신경아교종세포주인 C6 세포에 비자열수 추출물을 0 ㎎/㎖, 0.031 ㎎/㎖, 0.063 ㎎/㎖ 농도로 처리한 결과 Total glutathione 함량이 각각 130.6 %, 166.9 %로 농도의존적으로 증가하는 것을 확인(Figure 4A)할 수 있어 비자 추출물은 DPPH 라디칼 소거 활성과 아질산염소거능 등과 함께 분석한 결과 항산화 효능이 있는 것으로 생각된다.
- 4 %로 대등한 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 한편, 아질산염 소거능을 분석(Figure 2B)한 결과 0.2 ㎎/㎖ 농도, 1.0 ㎎/㎖ 농도, 10.0 ㎎/㎖ 농도에서 농도가 높을수록 아질산염 소거 활성이 높아지는 것을 확인((Figure 2B)할 수 있었다. 단일 성분인 ascorbic acid와 효능을 비교하면, 0.
후속연구
- 이와 같이 비자의 성분분석, 열수추출물의 항산화 효능, 세포수준에서 안전성을 확인한 농도에서 뇌신경세포에 대한 항산화효능 및 세포보호효과를 확인하여, 향후 뇌신경 퇴행성 질환에 대한 활용가능성을 확인할 수 있었다. 다만 비자의 독성에 대한문헌연구20)를 볼 때 과량복용시 滑腸하게 하여 泄瀉를 유발할 수 있고, 肺胃의 實熱로 인한 해수 증상을 악화시킬 수 있으며, 墮胎의 가능성이 있으므로 이와 같은 환자의 경우에는 내복시 신중해야할 것으로 사료된다.
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