선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 13,14) 본 연구에서는 건강 추출물과 건강 추출물의 수용성 분획물 및 비수용성 분획물의 뇌세포 보호효과와 항산화 효과를 측정하고자 생쥐의 해마 유래 HT22 세포에서 글루타메이트 세포독성으로부터의 뇌 세포 보호 효과를 검색하였다.
- 특히 뇌 세포 보호 기전에 있어 HO-1은 그 부산물과 함께 ROS 제거 및 세포 보호, 항산화 등의 역할을 통하여 산화적 스트레스로 인한 뇌세포 손상을 억제하는 것으로 현재 많은 연구가 진행되고 있다.9,10) 따라서, 본 연구는 건강 에탄올 추출물의 비수용성분획물이 Heme oxygenase-1의 발현을 통한 뇌 세포 보호 효과와 그 세포 보호 기전을 탐색하였고, 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- ROS 측정 − 배양된 세포를 PBS로 세척한 후, 10 µM 2',7'-dichlofluorescein diacetate (DCFDA, 35845) 를 포함하는 Hank’s balanced salt 용액에 30분 동안 암실에서 반응한 후 세포의 형광광도 (SpectramaxGemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.)를 측정했다.
- Western Blot Analysis − HT22 세포를 60 mm dish에 3×105 cells/well 농도로 24시간 배양한후 각각의 시료를 농도별로 처리하였다.
- 1% Tween 20 in Tris-buggered saline) 에서 blocking한후 HO-1 antibody를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 다시 2차 안티바디 (Anti-mouse IgG)를 1:1000으로 희석하여 넣고 1시간 동안 반응한 다음, ECL 용액을 1:1로 잘 섞어서 NC membrane 위에 부어서 발광시키고 암실에서 X선 필름에 감광한후 현상하였다. 같은 방법으로 Actin antibody를 이용하여 Actin 을 측정한다.
- HT22 세포에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4℃, 14,000×g 에서 25분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDS-polyacrylamide gel에서 영동하고 Nitrocellulose membrane (NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer (0.
- 또한, 모든 실험치는 대조군에 대한 세포보호율을 mean±S.D.로 표시하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
- 05 g을 얻었다. 수득한 건강 추출물 6.05 g에 정제수 100 ml을 넣고 교반하여 잘 녹인 뒤 18시간 동안 냉침후 원심분리기에서 3000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로서 건강 추출물의 비수용성 분획 (NNMBS098)과 수용성 분획 (NNMBS099)을 제조하였다. 상기 건강 추출물들을 실험에 사용한 배지에 녹여서 사용하였다.
- 즉, HT22 세포 (2×105 cells/well)를 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 IU/ml)와 streptomycin (100µg/ml)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37℃에서 24시간 배양한 다음, 각각의 시료 용액 (5, 10, 20, 40 µg/ml)과 5 mM Glutamate를 처리한 후 12시간 동안 5% CO2 배양기 내에서 배양하였으며, 세포생존율은 MTT법을 활용하여 측정하였으며, 양성대조약물로는 Trolox 50 µM를 사용하였다.
- 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
- HT22 세포배양 및 뇌 세포 보호활성 측정 − 생쥐 해마 유래 HT22 세포주는 Dr. Inhee-Mook (Seoul National University, Seoul, Korea)로부터 분양하여 사용하였으며, 글루타메이트로 독성을 유발한 세포주에 대한 보호활성 측정은 정 등의 방법11) 에 따라 실시하였다.
- L-glutamate, Trolox와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
- 뇌 세포 보호 효과물질로 알려진 trolox 50 µM을 양성 대조약물로 사용하였다 (Fig. 1).
- 05 g에 정제수 100 ml을 넣고 교반하여 잘 녹인 뒤 18시간 동안 냉침후 원심분리기에서 3000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로서 건강 추출물의 비수용성 분획 (NNMBS098)과 수용성 분획 (NNMBS099)을 제조하였다. 상기 건강 추출물들을 실험에 사용한 배지에 녹여서 사용하였다.
- 시약 및 기기 −DMEM 배지와 trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Gibco Laboratories사에서 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS)는 Hyclone Laboratories사에서 구입하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용한 건강은 2009년 4월 익산시 소재 대학한약국에서 구입하였으며, 건강 추출물과 각 분획물 (NNMBS097, NNMBS098 NNMBS099)은 천연물신약 표준화소재 은행에서 분양하여 사용하였다.
이론/모형
- Heme Oxygenase Activity − HO 효소 활성을 Tenhunen 등의 방법12)에 의해 다음과 같이 측정하였다.
- 4), 50 mM glycerophosphate, 20 mM NaF, 20 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM Na3VO4, protease inhibitors]를 첨가하고 4℃에서 15분간 혼합한후 4℃, 16,000×g에서 15분간 원심분리 한다. 이후의 과정은 상술된 western blotting 방법을 이용하였다.
성능/효과
- 15,16) NNMBS098을 40 µg/ml 처리하여 시간별로 측정한 결과 Nrf2가 핵내로 전사 되면서 nuclear의 Nrf2가 증가하는 반면cytosol의 Nrf2가 현저히 줄어드는 양상을 보였다 (Fig. 5).
- 19,20) NNMBS098을 40 µg/ml 농도로 처리한 결과 ERK와 p38 경로는 변화가 없는 반면, JNK는 30분에서부터 인산화과정이 이루어 지는 것을 확인하였으며 NNMBS098 40 µg/ml과 JNK 억제제인 SP600125를 함께 처리했을 때 HO-1의 발현이 억제되고 NNMBS098의 세포보호 효과 역시 감소하는 것을 확인하였다.
- 40 µg/ml 농도에서 NNMBS098에 의한 HO-1 단백질의 발현을 시간별로 측정한 결과 6시간 에서부터 발현이 시작되어 18시간에서 제일 많이 발현되었으며 HO activity 역시 18 시간에서 가장 높은 활성을 나타냈다 (Fig. 3).
- 3). NNMBS098에 의해 증가 했던 세포 보호활성과 ROS 소거 활성이 HO-1의 억제제인 SnPP로 인해 감소 되는 것을 통하여 NNMBS098은 HO-1을 발현 함으로서 뇌세포 보호활성과 ROS 소거 활성을 나타냈다 (Fig. 4).
- 각 시료를 농도별로 12 시간 처리한 결과 건강 추출물의 비수용성 분획물 (NNMBS098)이 세포 독성이 나타나지 않은 농도 (5-40 µg/ml)에서 글루타메이트로 인한 독성으로부터 유의한 뇌 세포보호 활성을 보였으며, 동시에 동일한 농도에서 강력한 ROS 소거 활성을 나타냈다.
- 5). 기존의 연구결과와 마찬가지로 NNMBS098는 Nrf2의 핵내전사를 통하여 HO-1 단백질의 발현을 조절하는 것을 실험을 통하여 확인하였다.
- 한편, 뇌 세포 보호 기전에 있어 중요한 단백질인 Heme oxygenase (HO)-1의 발현 여부에 관하여 실험한 결과 건강의 추출물 (NNMBS097)이 40 µg/ml 농도에서 약간의 HO-1 발현이 관찰되고 수용성 분획물 (NNMBS099) 은 아무런 작용이 없는 반면, 비수용성 분획물인 NNMBS098은 HO-1단백질을 농도 의존적으로 발현시키는 것을 확인하였다. 또한 HO activity 역시 NNMBS098에 의해 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 40 µg/ml 농도에서 NNMBS098에 의한 HO-1 단백질의 발현을 시간별로 측정한 결과 6시간 에서부터 발현이 시작되어 18시간에서 제일 많이 발현되었으며 HO activity 역시 18 시간에서 가장 높은 활성을 나타냈다 (Fig.
- 본 연구는 건강 추출물의 뇌 세포 보호활성과 그 메커니즘을 탐색하였으며 그 결과 비수용성 분획물인 NNMBS098이 글루타메이트로 유발한 HT22 세포주에 대해 훌륭한 보호 활성을 나타냈으며, Nrf2 핵내전사와 JNK 인산화를 통하여 항산화 및 세포보호 효소인 HO-1 단백질을 발현함으로써 뇌 세포보호활성과 ROS소거 활성을 나타내는 메커니즘을 규명하였다.
- 한편, 뇌 세포 보호 기전에 있어 중요한 단백질인 Heme oxygenase (HO)-1의 발현 여부에 관하여 실험한 결과 건강의 추출물 (NNMBS097)이 40 µg/ml 농도에서 약간의 HO-1 발현이 관찰되고 수용성 분획물 (NNMBS099) 은 아무런 작용이 없는 반면, 비수용성 분획물인 NNMBS098은 HO-1단백질을 농도 의존적으로 발현시키는 것을 확인하였다.
후속연구
- 19,20) NNMBS098을 40 µg/ml 농도로 처리한 결과 ERK와 p38 경로는 변화가 없는 반면, JNK는 30분에서부터 인산화과정이 이루어 지는 것을 확인하였으며 NNMBS098 40 µg/ml과 JNK 억제제인 SP600125를 함께 처리했을 때 HO-1의 발현이 억제되고 NNMBS098의 세포보호 효과 역시 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 본연구를 통하여 건강 추출물의 비수용성 분획 물인 NNMBS098은 HT22 세포에서 Nrf2 핵내전사와 JNK 인산화를 통하여 HO-1 단백질을 발현함으로써 글루타메이트에 의한 독성으로부터 뇌 세포보호활성과 ROS소거 활성이 있음을 확인하였으며, 향후 NNMBS098의 뇌세포 보호기전과 지표물질의 분리 및 성분분석에 관한 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.