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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라에 서식하는 밀기울의 육모 효능을 조사하여 이들을 탈모방지제 및 탈모 치료제로 이용할 수 있는 근거를 마련하고자 하였다.
- 본 연구에서는 밀기울 n-hexane 추출물이 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 모유두 세포에서 cell cycle proteins, Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 활성화에 의한 세포의 성장 증식을 촉진 효과를 통해 모낭의 성장기를 유도하거나 성장기를 유지시킴을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 밀기울 n-hexane 추출물이 탈모치료 및 예방제로 이용될 수 있는 가능성을 가지고 있다는 근거를 제시하는 것이다.
- 본 연구에서는 밀기울 n-hexane 추출물이 모발의 성장에서 중요한 역할을 하는 모유두 세포에서 cell cycle proteins, Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 활성화에 의한 세포의 성장 증식을 촉진 효과를 통해 모낭의 성장기를 유도하거나 성장기를 유지시킴을 밝혔다. 이와 같은 연구결과는 밀기울 n-hexane 추출물이 탈모치료 및 예방제로 이용될 수 있는 가능성을 가지고 있다는 근거를 제시하는 것이다.
제안 방법
- 24) Dermal papilla 세포(1.0×104 cells/ml)를 1% FBS를 포함한 DMEM 배지에 혼탁하여 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후 밀기울 n-hexane 추출물(0.1, 1, 10 및 50 µg/ml)을 처리하였다.
- 하루에 한 번씩 시료를 200 µl씩 제모부위에 떨어뜨린 다음에 두드리면서 도포하고 대조군에는 50% 에탄올을 도포하였다.
- 실험군은 5개의 군으로 설정하여 대조군, 양성 대조군(MINOXYLTM, 현대약품)과 밀기울 n-hexane 추출물(10, 50 및 100 µg/ml) 처리군으로 하였다.
- 밀기울 n-hexane 추출물(1, 10 및 50 µg/ml) 및 양성 대조물질인 minoxidil은 10 µM의 농도로 처리하였다.
- − 실험재료인 밀기울(wheat bran)은 경상북도에서 재배된 우리밀의 밀기울을 정미소에서 공급받아 사용하였다. 총 시료 5kg을 90%에탄올에 4시간씩 3회 Water Bath에서 중탕으로 추출하였으며, 상층액을 회수하고 rotary evaporator를 사용하여 감압 농축한 후 조추출물을 337 g 수득하였다. 이중 300 g은 n-hexane을 이용하여 용매 분획하여 n-hexane층 133 g을 얻었고 이 분획물을 실험의 시료로 사용하였다.
- Rat 왼쪽과 오른쪽 mystacial pads를 분리하여 100 units/ml penicillin-100 µg/ml streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 E/P buffer[Earle's balanced salts solution(EBSS, Sigma MO, USA) + phosphate-buffered saline(PBS, Sigma MO, USA)]에 넣었다. 해부 현미경으로 관찰하며 vibrissa follicles을 조심스럽게 분리하였다. 모낭이 모두 분리될 때까지 E/P buffer를 넣은 Petri dish에 분리된 모낭을 넣고 37℃, 5% CO2 항온기에서 1시간 정도 배양하였다.
- 24 well plate의 각 well에 2 mM L-glutamine(Gibco Inc, NY, USA), 10 µg/ml insulin(Sigma MO, USA), 50 nM hydrocortisone(Sigma MO, USA)과 100 units/ml penicillin100 µg/ml streptomycin을 포함하는 500 µl의 William E medium(Gibco Inc, NY, USA)을 넣고, 하나의 well에 하나씩의 모낭을 넣어서 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 한 실험군에 8-12개의 모낭을 이용하였으며, 배양 중에 배지는 3 일마다 교환하였다. 밀기울 n-hexane 추출물(1, 10 및 50 µg/ml) 및 양성 대조물질인 minoxidil은 10 µM의 농도로 처리하였다.
- − 배양중인 vibrissa follicle 형태는 현미경(Olympus, Japan)을 사용하여 촬영하였다. 모낭 길이는 image analyzer(DP controller; Olympus, Japan)를 사용하여 측정하였다. 모낭 길이 변화의 평균값을 구하고 대조군의 평균길이와 비교하여 성장 정도를 측정하였다.
- 모낭 길이는 image analyzer(DP controller; Olympus, Japan)를 사용하여 측정하였다. 모낭 길이 변화의 평균값을 구하고 대조군의 평균길이와 비교하여 성장 정도를 측정하였다.
- 하루에 한 번씩 시료를 200 µl씩 제모부위에 떨어뜨린 다음에 두드리면서 도포하고 대조군에는 50% 에탄올을 도포하였다. 실험 시작 후 1일, 15일 22일, 29일 및 35일에 털이 자라는 상태를 확인하기 위하여 사진촬영을 실시하였고, 정량적 평가를 위해 dotmatrix planimetry를 수행하였다.22)
- 상층액은 제거하고 DMSO 200 µl을 가하여 침전물을 용해시킨 후 microplate reader(Amersham Pharmacia Biotech, NY, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 증식정도를 조사하였다.
- − Dermal papilla cell 세포는 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양한 후에 밀기울 n-hexane 추출물(1, 10 및 50 µg/ml) 및 10 µM minoxidil을 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다.
- 밀기울이 모유두 세포의 성장증식 효능이 있는지 불멸화된 모유두 세포를 사용하여 조사하였다. 모유두 세포는 모낭의 기저에 위치하는 중배엽 유래 세포로써, 상피세포로 이루어진 모기질 세포(matrix cells)와의 상호작용을 통해 모발의 형성 및 성장에 중요한 요소로 작용한다고 알려져 있다.
- 밀기울 hexane 추출물이 모유두 세포의 성장증식을 증가시키는 분자적 기전을 밝히기 위해 cell cycle 단백질의 발현을 관찰하였다. 포유류 세포는 세포증식의 주요 과정인 cell cycle 진행을 위해 cyclin E/CDK2 complex의 활성화, cyclin D1 증가 및 pRB의 인산화 증가 등을 필요로 함이 알려져 있다.
- 33-35) Minoxidil은 모유두 세포에서 cyclin E 및 CDK2의 level 증가, p27kip1 level 감소를 통해 cell cycle 진행을 촉진하고 모유두 세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다.30) 밀기울 n-hexane 추출물의 모유두 세포증식 증가 효과가 cell cycle proteins에 의해 조절되는지 확인하기 위해, cyclin D1, cyclin E, phospho-CDK2, phospho-pRB의 발현을 조사하였다. 그 결과, Fig.
- − 흰쥐 수염에서 분리된 모낭 유두 세포를 불멸화한 세포(Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell)23)를 100 units/ml penicillin-100 µg/ml streptomycin(Gibco Inc, NY, USA)과 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS; Gibco Inc, NY, USA)이 함유된 DMEM(Hyclone Inc, USA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다.
- 29) 따라서 밀기울 n-hexane 추출물이 5α-reductase 활성을 억제하는지 rat prostatic enzyme fraction을 이용하여 조사하였다.
- Membrane은 여러 단백질의 발현을 조사하기 위해 Cyclin D1(1:1000), phospho-CDK2(1:1000), Cyclin E(1:2000), phospho(ser780)-pRB(1:1000), phospho-ERK1/2(1:1000), ERK1/2(1:1000), phospho(ser552)-β-catenin (1:1000), phospho(ser675)-β-catenin(1:1000), β-catenin(1:2000), phospho(ser9)-GSK3β(1:1000), GSK3β(1:1000) and β-actin (1:5000)에 대한 primary antibody로 4℃에서 overnight 실시하였다.
- The transparency was put on a photo of a mouse to mark the areas that were in different stages (pink = telogen, anagen = black). Afterward a dotmatrix (sheet with a uniform defined dot pattern) was placed under the marked foil to calculate the percentages of the regions of interest by counting the dots. The percentage of anagen induction was calculated by the equation [(black skin/total skin) × 100].
대상 데이터
- − 실험재료인 밀기울(wheat bran)은 경상북도에서 재배된 우리밀의 밀기울을 정미소에서 공급받아 사용하였다.
- − 육모 효과를 살펴보기 위해, 등 쪽 피부의 색이 분홍색인 휴지기 체모의 7주령을 사용하였다.
- − 생후 6주된 암컷 C57BL/6 마우스를 ㈜오리엔트바이오로부터 구입하여 1주간 동물 사육실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- − 생후 3주령인 Wistar rat 수컷을(Japan SLC, Hamamatsu, Janpan) ㈜중앙실험동물로부터 구입하여 ethyl ether로 마취 후 경추도살하였다.
- 총 시료 5kg을 90%에탄올에 4시간씩 3회 Water Bath에서 중탕으로 추출하였으며, 상층액을 회수하고 rotary evaporator를 사용하여 감압 농축한 후 조추출물을 337 g 수득하였다. 이중 300 g은 n-hexane을 이용하여 용매 분획하여 n-hexane층 133 g을 얻었고 이 분획물을 실험의 시료로 사용하였다. 밀기울(wheat bran) 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 녹여 실험에 사용하였으며, DMSO의 최종 농도는 0.
- 이중 300 g은 n-hexane을 이용하여 용매 분획하여 n-hexane층 133 g을 얻었고 이 분획물을 실험의 시료로 사용하였다. 밀기울(wheat bran) 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 녹여 실험에 사용하였으며, DMSO의 최종 농도는 0.2%를 초과하지 않도록 하였다.
- 동물 사육실은 온도 23±3℃, 12시간씩 밤낮을 유지하였다. 실험동물은 격리용 마우스 케이지에서 사육하였고, 실험용 사료를 자유로이 급여하였다. 실험군은 5개의 군으로 설정하여 대조군, 양성 대조군(MINOXYLTM, 현대약품)과 밀기울 n-hexane 추출물(10, 50 및 100 µg/ml) 처리군으로 하였다.
- 실험군은 5개의 군으로 설정하여 대조군, 양성 대조군(MINOXYLTM, 현대약품)과 밀기울 n-hexane 추출물(10, 50 및 100 µg/ml) 처리군으로 하였다. 한 실험군에 각 8마리의 마우스를 실험에 이용하였다.
- 밀기울 n-hexane 추출물에 의한 in vitro 육모 효과가 실제 in vivo 동물모델에서도 나타나는지 C57BL/6 마우스를 사용하여 평가하였다. C57BL/6 마우스는 피부의 melanocyte가 모낭에만 존재하며, 모발 주기가 휴지기(telogen)에서 성장기(anagen)로 진행이 되면 피부색깔이 핑크색에서 검은색으로 변하는 것을 확인할 수 있다.
- Cell proliferation was measured using a MTT assay for 4 days. All experiments were performed in triplicate. Data are presented as the mean ± the S.
데이터처리
- − 모든 측정결과는 평균±표준편차 또는 표준오차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검정은 student's t-test으로 검정하였으며, p-value가 0.05이하일 경우 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양 하였다. Rat vibrissa immortalized dermal papilla cell의 증식은 MTT assay를 이용하여 측정하였다.24) Dermal papilla 세포(1.
- Cell lysate는 15,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었고 실험에 사용전까지 -20℃에 보관하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 Bradford method에 의하여 정량하였다.25) 20-30 µg의 lysate를 8-12% mini gel SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 변성분리하여 PVDF(polyvinylidene fluoride) membranes(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 200 mA에서 2시간 동안 transfer하였다.
- 밀기울 n-hexane 추출물이 육모 효능이 있는지 조사하기 위하여 rat vibrissa follicle culture model을 이용하였다. Rat vibrissa follicles은 나이에 따라 모발주기가 동일하며, 분리된 vibrissa follicles은 in vitro에서 23일 정도까지 배양이 가능하다.
성능/효과
- MINOXYL™ 도포군은 제모 후 15일 이후부터 피부색상의 변화 및 뚜렷한 모발 성장 효과를 확인 할 수 있었다(Fig. 2).
- 밀기울 n-hexane 추출물 도포군의 모발의 성장기 유도 효능을 dotmatrix 면적측정법22)을 이용하여 정량적으로 분석한 결과, 35일째에 50 µg/ml의 농도에서 밀기울 n-hexane 추출물 도포군은 대조군에 비해 유의하게 높은 성장기 유도 효능을 나타냄을 확인하였다(Fig. 2).
- 21일째 밀기울 n-hexane 추출물 처리군과 대조군과의 모낭의 길이 차이(%)를 비교한 결과, 1, 10 및 50 µg/ml을 각각 처리하였을 때 대조군(100.0±18.5%)보다 hair fiber의 성장이 150.0±21.7%(P<0.001), 203.6±7.6%(P<0.001) 및 246.4±19.8% (P<0.001)로 증가하였으며, 양성대조군인 10 µM minoxidil은 156.3±11.5%(P<0.05) 성장을 나타내었다(Fig. 1).
- 실험된 모든 농도에서 밀기울 n-hexane 추출물의 모유두 세포의 증식 효과는 양성대조물질로 사용한 10 µM minoxidil의 118.±4.3%(P<0.01) 증식 증가 효과보다 높았다(Fig. 3).
- 그 결과, Fig. 4A에서 보는 바와 같이, 밀기울 n-hexane 추출물을 모유두 세포에 24시간 동안 1, 10 및 50 µg/ml 농도로 처리하였을 때, cyclin D1, cyclin E, phospho-CDK2 및 phospho-pRB의 발현이 증가함을 확인할 수 있었고, minoxidil의 처리 역시 밀기울 n-hexane 추출물과 비슷한 결과를 보임을 확인하였다(Fig. 4A) 한편, Wnt/β-catenin 신호전달 경로는 모발성장, 세포증식 조절에서 중요한 역할을 한다.
- 3). 이러한 결과를 통하여 밀기울 n-hexane 추출물이 모유두 세포의 증식을 통해 육모 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
- 14) 이러한 결과들은 밀기울 n-hexane 추출물이 cyclin D1, cyclin E, phospho-CDK2, phospho-pRB 같은 cell cycle 단백질뿐만 아니라 GSK3β, PKA및 Akt 경로를 통한 Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 활성화에 의해 모유두 세포의 증식증가 효능을 나타냄을 시사한다.
- 18,20) 본 실험 결과를 보면 밀기율 n-hexane 추출물 처리에서는 Phospho(ser552)-β-catenin, Phospho(ser675)-β-catenin, Phospho(ser9)-GSK3β의 활성화가 증가함을 확인하였고, minoxidil의 처리는 Wnt/β-catenin 경로를 다소 활성화시킴을 관찰하였다(Fig. 4B).
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