[국내논문]버섯 세균성갈색무늬병원균(Pseudomonas tolaasii)의 분비 독소(tolaasin)를 저해하는 미생물 Pseudomonas sp. HC1 Isolation of the Bacterium Pseudomonas sp. HC1 Effective in Inactivation of Tolaasin Produced by Pseudomonas tolaasii원문보기
Pseudomonas tolaasii에 의해 발생하는 세균갈색무늬병은 버섯재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 독소저해균의 항균활성과 선발된 독소저해균에 대해 폿트수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 느타리버섯 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균이 분비하는 독소(tolaasin)를 가장 강하게 억제하는 미생물 HC1를 선발하였으며, 생리 생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC1균주는 Pseudomonas sp.로 동정되었다. 생물검정을 위하여 독소분해균 Pseudomonas sp. HC1을 양송이, 팽이, 느타리에 처리한 결과 각각 69%, 68%, 55%의 방제효과를 보였다. 따라서 Pseudomonas sp. HC1이 버섯 세균갈색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경적인 방제방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.
Pseudomonas tolaasii에 의해 발생하는 세균갈색무늬병은 버섯재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 독소저해균의 항균활성과 선발된 독소저해균에 대해 폿트수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 느타리버섯 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균이 분비하는 독소(tolaasin)를 가장 강하게 억제하는 미생물 HC1를 선발하였으며, 생리 생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC1균주는 Pseudomonas sp.로 동정되었다. 생물검정을 위하여 독소분해균 Pseudomonas sp. HC1을 양송이, 팽이, 느타리에 처리한 결과 각각 69%, 68%, 55%의 방제효과를 보였다. 따라서 Pseudomonas sp. HC1이 버섯 세균갈색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경적인 방제방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.
A Gram-negative bacterium was isolated from mushroom media that markedly reduces the level of extracellular toxins (i.e., tolaasins) produced by Pseudomonas tolaasii, the most destructive pathogen of cultivated mushrooms. The HC1 strain was selected as detoxifying tolaasin by bioassay on potato and ...
A Gram-negative bacterium was isolated from mushroom media that markedly reduces the level of extracellular toxins (i.e., tolaasins) produced by Pseudomonas tolaasii, the most destructive pathogen of cultivated mushrooms. The HC1 strain was selected as detoxifying tolaasin by bioassay on potato and it was identified Pseudomonas sp. by the cultural, morphological and physiological characteristics, and analysis of the 16S rRNA. The isolated bacterium is saprophytic but not parasitic nor pathogenic to cultivation mushroom. The isolated bacterium for P. tolaasii cell, was sufficient for detoxification in vitro. Inoculation of the isolated bacterium prevents the development of bacterial disease in Pleurotus ostreatus, Flammunia velutipes and Agaricus bisporus. Control efficacy of brown blotch of strain HC1 treatment was 69, 68 and 55% on Agaricus bisporus, Flammulina velutipes and Pleurotus ostreatus, respectively. The suppressive bacterium may be useful in future for the development of biocontrol system and the construction of genetically modified edible fungi resistant to the disease caused by P. tolaasii.
A Gram-negative bacterium was isolated from mushroom media that markedly reduces the level of extracellular toxins (i.e., tolaasins) produced by Pseudomonas tolaasii, the most destructive pathogen of cultivated mushrooms. The HC1 strain was selected as detoxifying tolaasin by bioassay on potato and it was identified Pseudomonas sp. by the cultural, morphological and physiological characteristics, and analysis of the 16S rRNA. The isolated bacterium is saprophytic but not parasitic nor pathogenic to cultivation mushroom. The isolated bacterium for P. tolaasii cell, was sufficient for detoxification in vitro. Inoculation of the isolated bacterium prevents the development of bacterial disease in Pleurotus ostreatus, Flammunia velutipes and Agaricus bisporus. Control efficacy of brown blotch of strain HC1 treatment was 69, 68 and 55% on Agaricus bisporus, Flammulina velutipes and Pleurotus ostreatus, respectively. The suppressive bacterium may be useful in future for the development of biocontrol system and the construction of genetically modified edible fungi resistant to the disease caused by P. tolaasii.
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문제 정의
따라서 본 연구는 병원균이 분비하는 독소(tolaasin)를 저해하여 병의 발생을 억제하고 버섯 병해의 친환경적 방제를 위한 독소저해 미생물을 선발하여, 항균력 및 특성을 조사하였다.
병원균 P. tolaasii는 독소(tolaasin)를 분비하여 버섯에 병을 일으키는 것으로 알려 있으며, 이들 병원균이 분비하는 독소를 저해하는 미생물을 이용하여 병의 발생을 억제하고자 실험을 실시하였다. 병원균이 분비하는 독소에 대해 저해를 나타내는 미생물을 선발하기위하여 버섯배지로 부터 약 3,500균주의 미생물을 분리하여 저해정도를 조사하였다.
Pseudomonas tolaasii에 의해 발생하는 세균갈색무늬병은 버섯재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 독소저해균의 항균활성과 선발된 독소저해균에 대해 폿트 수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 느타리버섯 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균이 분비하는 독소(tolaasin)를 가장 강하게 억제하는 미생물 HC1를 선발하였으며, 생리·생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC1균주는 Pseudomonas sp.
제안 방법
DNA는 Quiagen Genomic DNA Isolation Kit(Quiagen, USA)을 사용하여 분리하였고, PCR 증폭은 Techne thermocycler(Techne LTD, Duxford, Cambridge, U.K.)로 수행하였다. PCR 반응혼합액은 1×buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.
FAMEs profile은 25 mm × 0.2 mm의 methyl phenyl silicone fused silica capillary column을 사용하여 MIDI Hewlett-Packard Microbial Identification System(MIDI Inc., Newark, DE, USA) software를 가진 마이크로프로세스를 장착한 Gas Chromatography(HP 5890A, Avondale, Pa)로 분석하였다.
PCR은 94ºC에서 1분, 56ºC에서 1분 그리고 72ºC에서 2분간 30cycles로 수행하였고, 반응 후 primer와 dNTP는 High Pure PCR Product Purification Kit(Bioneer Co., Chungbuk, Korea)을 사용하여 PCR 산물로부터 제거하였다.
병원균이 분비하는 독소에 대해 저해를 나타내는 미생물을 선발하기위하여 버섯배지로 부터 약 3,500균주의 미생물을 분리하여 저해정도를 조사하였다. 독소저해균의 선발은 감자 조각 위에 독소(tolaasin)와 분리 균을 일정한 비율로 혼합하여 접종한 후 24시간이 지난 후에 감자의 갈변정도에 따라 저해균을 선발하였다. 실험 결과 대부분의 분리 미생물은 저해정도가 약하거나 거의 없었지만 분리균 HC1 균주가 높은 갈변 증상과 감자에 병원성을 보이지 않아 독소저해균으로 선발하였다(Fig.
버섯 자실체에 병원균 현탁액을 분무살포하고 30분 후 유용미생물 현탁액을 분무살포하여 온도 15ºC, 습도 95%의 생육실에서 재배하면서 병 발생율을 조사하였다.
병원균 P. tolaasii에 대한 독소저해균 HC1 균주를 16S rDNA의 PCR 증폭에 의해 약 1.5 kb의 유전자를 확보하였으며, 그 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 Ribosomal database project를 이용하여 표준균주와 상동성을 비교 분석하였다.
병원균이 분비하는 독소에 대해 저해를 나타내는 미생물을 선발하기위하여 버섯배지로 부터 약 3,500균주의 미생물을 분리하여 저해정도를 조사하였다.
선발 유용미생물의 생화학적인 특성을 조사하기 위하여 기본배지(Stanier et al., 1966)에 다양한 종류의 탄소원과 질소원, 유기산 등을 0.1%(w/w)씩 첨가하여 생육정도를 조사하였으며, 부가적으로 API 20E, API 20NE, 50CH 키트(BioMerieus, Marcy I’Etoile, France)를 사용하였고, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Palleroni, 1984)에 준하여 실험을 하였다.
5 kb의 유전자를 확보하였으며, 그 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 Ribosomal database project를 이용하여 표준균주와 상동성을 비교 분석하였다. 그 결과 Pseudomonas otitidis와 94% 유사성을 보였으며, Pseudomonas aeruginosa와는 93%의 유사성을 보였다.
, Chungbuk, Korea)을 사용하여 PCR 산물로부터 제거하였다. 정제된 PCR 산물은 pT7 blue Vector(Novagen Co., Madison, WI, USA)에 클로닝 하여 Big Dye Terminator Kit와 ABI Prism 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer, New Jersey, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 결정한 16S rRNA 유전자의 염기서열은 GenBank Database에 등록하였다.
대상 데이터
저해균 HC1의 생육은 7ºC에서 생장이 가능하였지만 4ºC와 47ºC에서는 생장하지 않았다. Urease를 이용하였고, gelatin을 액화시켰으며, 4% NaCl과 5% NaCl에서 생장이 가능하였다. 그리고 이 균은 glycerol, D-sorbitol, D-fructose, L-fucose, D-trehalose, D-galacturonic acid, D-glucuronic acid, L-arginine, L-histidine, L-ornithine, L-phenylalanine, D-serine, L-serine, 그리고 β-phenylethylamine 등과 같은 당과 산을 이용하였다.
그리고 이 균은 glycerol, D-sorbitol, D-fructose, L-fucose, D-trehalose, D-galacturonic acid, D-glucuronic acid, L-arginine, L-histidine, L-ornithine, L-phenylalanine, D-serine, L-serine, 그리고 β-phenylethylamine 등과 같은 당과 산을 이용하였다.
독소 저해균의 선발은 동결건조된 tolaasin powder를 30%(w/v)로 희석하여 분리된 미생물과 1:1로 혼합하여 감자조각 위에 50 µl씩 접종하여 25ºC 항온기에 보관하면서 갈변정도를 조사하여 독소저해균을 선발하였다(Murata and Magae, 1996; Tsukamoto et al., 1998).
그러나 N-Acetyl-D-glucosamine, D-arabitol, D-mannitol, D-galactose, Sucrose, Dxylose, gentiobiose, maltose, clucuronamide, L-isoleucine, L-leucine, cytosine 그리고 acetic acid 등은 이용하지 못했다(Table 1). 부가적인 특성조사는 API 20E, 20NE 그리고 50CH 키트를 사용하였다. 독소저해균에 대한 fatty acid의 구성성분은 Table 2에서 나타내었다.
세균갈색무늬병의 방제효과를 검정하기 위해 병재배된 느타리와 팽이버섯 그리고 폿트(90×30 cm)에 재배된 양송이버섯을 실험에 사용하였다.
순수 분리한 미생물은 R2A배지에서 2일 동안 배양한 후 균체를 모아서 20%(v/v) 글리세롤 용액에 넣어 70ºC에 보존하면서 검정용 시료로 사용하였다.
유용한 미생물을 분리하기 위해 재배중인 느타리버섯 폐면배지와 양송이 퇴비를 농가별 3점씩 채취하여 실험에 사용하였다. 미생물의 분리는 R2A배지(Reasoner and Geldreich, 1985)에 단계별로 희석 배양하여 50~60개의 colony를 형성한 plate로부터 독립적으로 분리하였다.
데이터처리
결정한 16S rRNA 유전자의 염기서열은 GenBank Database에 등록하였다. 종 유사성 결정을 위해 Clustral W 분석프로그램(Thompson et al., 1994)을 사용하여 GenBank에 있는 다른 염기서열들과 비교하였다. Jukes와 Cantor(1969) 방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
이론/모형
, 1994)을 사용하여 GenBank에 있는 다른 염기서열들과 비교하였다. Jukes와 Cantor(1969) 방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
세포의 지방산 조성에 의한 분류동정은 상법에 따라 약 50 mg의 균체로부터 지방산을 추출하여(Sasser, 1990) fatty acid methyl esters(FAMEs) 분석으로 수행하였다. FAMEs profile은 25 mm × 0.
성능/효과
전체 지방산 중에서 주요성분은 Sum In Feature 8(18:1 w7), Summed Feature 8(18:1 w6c) 였고, 낮은 양의 16:1 w5c의 fatty acid가 존재하였다. FAME 분석에서는 유사도가 0.94로 P. aeruginosa로 동정되었으나, 생리생화학적 특성과 16S rDNA의 분석결과를 종합해 보면 P. aeruginosa와 다른 특성을 보였다. Tsukamoto 등(2002)이 독소(tolaasin)를 저해하는 미생물로 Mycetocola, Acinetobacter, Bacillus, Pedobacter, Sphinogobactgerium 등이 분리 동정되었다는 보고와는 다른 균이 분리되었다.
생물검정을 위하여 독소분해균 Pseudomonas sp. HC1을 양송이, 팽이, 느타리에 처리한 결과 각각 69%, 68%, 55%의 방제효과를 보였다. 따라서 Pseudomonas sp.
이 염기서열을 Ribosomal database project를 이용하여 표준균주와 상동성을 비교 분석하였다. 그 결과 Pseudomonas otitidis와 94% 유사성을 보였으며, Pseudomonas aeruginosa와는 93%의 유사성을 보였다. 그러나 Neighbor Joining방법을 이용한 유연 관계를 분석한 결과 저해균 HC1는 P.
그리고 팽이버섯에서는 무처리에서 89.8%의 이병율을 보였고, HC1처리에서는 29.3%의 이병율을 보여 68%의 방제효과가 있었다.
느타리버섯에 세균갈색무늬병균을 접종한 후에 HC1을 처리한 결과 무처리구에서는 93.8%의 이병율을 보였지만 HC1처리에서는 42.8%의 이병율을 보여 55%의 방제효과가 있었다. 양송이버섯에서는 무처리에서 56.
독소저해균의 선발은 감자 조각 위에 독소(tolaasin)와 분리 균을 일정한 비율로 혼합하여 접종한 후 24시간이 지난 후에 감자의 갈변정도에 따라 저해균을 선발하였다. 실험 결과 대부분의 분리 미생물은 저해정도가 약하거나 거의 없었지만 분리균 HC1 균주가 높은 갈변 증상과 감자에 병원성을 보이지 않아 독소저해균으로 선발하였다(Fig. 1). P.
8%의 이병율을 보여 55%의 방제효과가 있었다. 양송이버섯에서는 무처리에서 56.3%의 이병율을 보였고, HC1처리에서는 16.8%의 이병율을 보여 70%의 방제 효과를 보였다. 그리고 팽이버섯에서는 무처리에서 89.
3%의 이병율을 보여 68%의 방제효과가 있었다. 이상의 결과로 HC1균주는 세균갈색무늬병을 일으키는 거의 모든 버섯에 높은 병방제 효과가 있는 것으로 판단된다(Table 3, Fig. 3). P.
후속연구
따라서 Pseudomonas sp. HC1이 버섯 세균갈색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경적인 방제방법이 될 수 있을 것으로 생각된다.
Tsukamoto 등(2002)이 독소(tolaasin)를 저해하는 미생물로 Mycetocola, Acinetobacter, Bacillus, Pedobacter, Sphinogobactgerium 등이 분리 동정되었다는 보고와는 다른 균이 분리되었다. 따라서 독소(tolaasin)를 저해하는 Pseudomonas 균에 대한 정확한 동정을 위해서는 더욱 세밀한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
버섯에 병을 일으키는 세균은?
버섯에 병을 일으키는 세균으로는 Pseudomonas tolaasii, P. agarici, P. gingeri 그리고 병원성 P. reactans 등이 보고되었고(Wells et al., 1996; Wong et al.
세균갈색무늬병의 발생 상의 특성은?
, 1982). 이 병은 병 발생의 예측이 매우 어렵고, 병 발생 후에는 방제가 거의 불가능하며, 한번 발생하면 재배사 전체로 급격하게 전염되어 심한 경우에는 버섯을 전혀 수확하지 못하게 하는 특성이 있다(Kim et al., 1994).
세균갈색무늬병이 인공재배 버섯에 미치는 영향은?
, 1982). 인공재배 버섯에 발생하는 세균갈색무늬병은 주로 버섯의 갓 부분에 갈색무늬를 형성하는 병으로서, 버섯의 양적, 질적인 저하를 초래하여 시장에서의 상품가치를 떨어뜨리는 하나의 큰 원인이 되고 있다. 세균갈색무늬병은 Tolaas(1915)에 의하여 처음으로 보고된 병으로, 이 병의 병원세균은 Paine(1919)에 의하여 P.
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