초록 ▼

버섯의 대표적 질병인 갈반병(brown blotch disease)은 세균성 갈색무늬병으로 알려져 있으며, 경제적 피해가 심각하다. 갈반병은 버섯의 자실체 형성초기에 발생하는데, Pseudomonas tolaasii가 원인균으로 알려져 있다. 이 세균은 tolaasin이라는 독소를 생산하여 버섯의 자실체를 짓무르게 하여 결국 갈색으로 변하게 만든다. 본 연구에서는 Pseudomonas tolaasii에서 tolaasin 생합성 혹은 분비과정에 관련되는 유전자에 대한 연구를 진행하였다. 이를 위해 먼저, tolaasin을 생산하지 못

버섯의 대표적 질병인 갈반병(brown blotch disease)은 세균성 갈색무늬병으로 알려져 있으며, 경제적 피해가 심각하다. 갈반병은 버섯의 자실체 형성초기에 발생하는데, Pseudomonas tolaasii가 원인균으로 알려져 있다. 이 세균은 tolaasin이라는 독소를 생산하여 버섯의 자실체를 짓무르게 하여 결국 갈색으로 변하게 만든다. 본 연구에서는 Pseudomonas tolaasii에서 tolaasin 생합성 혹은 분비과정에 관련되는 유전자에 대한 연구를 진행하였다. 이를 위해 먼저, tolaasin을 생산하지 못하는 돌연변이 균주를 선발하였다. Random transposon mutagenesis를 시행하여 transposon이 삽입된 6500여종의 균주로부터 최종적으로 tolaasin을 합성하지 못하는 44종의 돌연변이체를 선발하였다. Transposon이 삽입된 부위의 DNA 염기서열을 결정하여 PKS와 상동성을 보이는 유전자를 포함하는 3 종의 돌연변이체와 ABC transporter 와 상동성을 보이는 유전자를 포함하는 2 종의 돌연변이체를 선별하였다. Pseudomonas tolaasii의 DNA를 포함하도록 제조한 cosmid library로부터 PKS 유전자 클러스터와 ABC transporter의 유전자를 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. 본 연구에서는 총 74 kb의 DNA 염기서열을 결정하였다. PKS 유전자의 총 길이는 60 kb이었으며, nonribosomal perptide synthase(NRPS) family의 구성원과 비교적 높은 상동성을 보였다. PKS 유전자는 adenylation domain, condensation domain, thiolation domain이 차례로 나열된 패턴을 보였으며, 이 같은 나열이 18번 반복되는 구조를 가지고 있었다. PKS 유전자의 3‘-말단에는 thioesterase domain이 하나 존재하였다. NCBI의 데이터베이스에는 이미 3 종류
(Pseudomonas tolaasii PM117, Pseudomonas tolaasii가6264, Pseudomonas tolaasii NCPBB2192)의 전체 DNA 염기 서열이 Next Generation Sequencing(NGS) 기법으로 분석되어 보고되어 있는데, 본 연구에서 결정한 Pseudomonas tolaasii KACC10082의 PKS 유전자는 Pseudomonas tolaasii PM117과 약 85%의 염기서열 상동성을 보였으나, Pseudomonas tolaasii 6264, Pseudomonas tolaasii NCPBB2192와는 50% 미만의 저조한 상동성을 보였다. PKS 유전자의 3’-말단에서 12 bp 떨어진 바로 뒤에 세 개의 유전자, 즉 macA 유전자, macB 유전자, Diaminobutyrate-2-oxoglutarate aminotransfersae 유전자가 클러스터를 형성하고 있었다. 이들 중 macA 유전자, macB 유전자는 PKS 유전자의 산물을 분비하는 transporter로 예측되지만 아직 정확한 증거는 없다.

Diaminobutyrate-2-oxoglutarate aminotransfersae 유전자는 PKS 유전자의 산물에 대해 어떤 역할을 하는지는 분명치 않다. 이 지점에서 약 4 kb 떨어진 곳에 succinate-semialdehyde dehydrogenase 유전자, alcohol dehydrogenase 유전자, aldehyde activating protein 유전자, ribonucleotide diphosphate redectase 유전자등 4개의 유전자가 클러스터를 형성하고 있었다. 이 유전자들은 에너지 대사에 중요한 역할을 할 것으로 보이지만, 직접적으로 tolaasin의 생산과 어떠한 관계를 가진 것인지 알 수 없었다. 그뒤로 major-facillitator transperter(MFS) 유전자가 1.3 kb 떨어진 위치에 자리하고 있었으며, 이 또한 tolaasin의 분비와 어떠한 관계가 있는지를 확인해야 할 것으로 판단되었다. 이와는 별도로 tolaasin을 생산하지 못하는 균주의 돌연변이에서 ABC transpoerter의 유전자를 선발하여 염기 서열을 결정하였다. 이단백질은 아직 Pseudomonas 종의 다른 균주와는 상동성이 낮은 DNA 서열을 가지고 있었다. 이transporter가 tolaasin의 합성에 필요한 물질 수송에 필요한 것인지, 아니면 분비에 필요한 것인지는 알수 없으나, tolaasin과 관련이 있음은 확실하였다. 이를 확인하기 위하여 complement test를 수행하였고, 이 ABC trasnsporter의 유전자가 회복 되면 tolaasin의 생성이 다시 일어남을 확인하였다. 최종적으로, 본 연구를 통하여 tolaasin을 합성하는 PKS 유전자의 전체 염기 서열을 결정하였으며, 부수적으로 8개 유전자의 염기 서열을 확인할 수 있었다. 또한 하나의 ABC transporter가 tolaasin의 합성에 필수적임을 확인하였다.