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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 환경친화적 안전 농산물 생산을 위하여 Bacillus amyloliquefaciens CC110 균주를 이용하여 오이 노균병 방제효과를 검정하기 위해 오이 잎 절편을 이용한 예방 및 치료효과 검정, 배지 선발, 처리농도와 유묘검정을 통한 분리한 세균의 처리효과를 구명하고자 실시하였다.
가설 설정
- a)Means, followed by a common letter are not significantly different at the 1% level by DMRT.
제안 방법
- 2엽기의 오이 유묘에 균주 CC110을 TSB배지에서 배양한 배양액을 분무처리하고 5시간 후에 배양한 노균병균을 붓을 사용하여 유주자낭을 수거하여 유주자낭 1×105 ml-1로 조절하여 상온에 2시간 방치하였다.
- 2엽기의 오이 유묘에 배양액을 분무처리하고 5시간 후에 직경 25 mm 잎 절편을 만들어서 24×24 cm 사각플레이트에 키틴타올을 깔아 플레이트 내 습도를 유지한 후에 오이 잎 절편을 일정한 간격으로 배열하였다.
- CC110 균주의 분류학적 계통분석을 위해서는 gyrB 유전자 염기서열 분석을 이용하였다. 즉, CC110 균주의 균체에서 PureHelixTM Genomic DNA Prep Kit (Nanohelix Co.
- Pseudoperonospora cubensis에 의한 오이 노균병의 생물적 방제를 위하여 오이 재배단지의 오이 식물체 126균주를 분리하였다.
- , 2011)을 이용하여 진화계통수를 작성하였다. branch의 안정성은 1,000회의 resampling (bootstrap value)을 통하여 조사하였다.
- 5%, w/v)의 가수분해능은 Smibert & Krieg(1994)의 방법에 준해 수행하여 배양 7일 후에 판정하였다. pH에 따른 생육 범위는 0.5 간격 citric acid/Na2HPO4(pH 5.0와 6.0), NaH2PO4/Na2HPO4(pH 6.5와 8.0), Tris/HCl (pH8.5와 pH9.0), Na2CO3/Na HCO3 (pH 9.5와 10.0) (Gomori, 1955)의 완충액을 이용하여 시험하였다. 생육 온도범위는 10~55℃로 조절된 배양기에서 2일간 배양 후 생육여부를 조사하였다.
- 그 중에서 잎 절편 생물검정 통하여 5균주를 선발하였다.
- 0%, 1×107/ml 이하 처리에서는 무처리구와 노균병 발생이 비슷하여 방제효과가 거의 없었다 (Table 4). 그러므로 CC110균주의 배양액이나 배양여액을 이용하는 방법을 선택하였다.
- 노균병균은 붓을 사용하여 포자낭을 수거하여 포자낭 1×105 ml-1로 조절하여 상온에 2시간 방치한 다음, 오이 잎 절편의 중앙에 노균병균의 포자낭 현탁액을 10 µl씩 점접종하여, 20℃로 조절하여 하루에 12시간씩 형광등이 조사되는 항온기에 넣어 7일 후에 노균병균의 병반면적율을 조사하였다.
- 배양액은 원액, 2배액과 5배액으로, 배양여액은 원액, 2배액과, 5배액으로 희석하고, 세포(cell)는 1×108/ml, 5×107/ml, 1×107/ml, 5×106/ml, 1×106/ml 농도별로 오이 잎에 처리한 후에 상기와 같이 잎 절편을 만들어서 노균병균의 포자낭을 1×105/ml을 10 µl씩 점접종하여, 20℃ 항온기에서 형광등을 하루에 12시간 조사하면서 처리 8일 후에 노균병 병반면적율을 조사하였다.
- 배양한 균주를 2엽기의 오이에 분무 처리하여 5시간 후에 오이 잎을 직경 25 mm로 잘라내어 습실처리한 24×24 cm의 페트리디쉬에 넣고 20℃로 조절하여 하루에 12시간씩 형광등이 조사되는 배양기에 넣어 7일 후에 노균병의 병반면적율을 조사하였다.
- 배지종류별 오이노균병에 대한 생물검정을 위하여 바로 커상토를 직경 7 cm 비닐포트에 담아 싱싱백다다기 오이를 파종하여 2엽기의 오이를 사용하였다. 선발균주를 TSB, LB(Luria-Bertani), KB(King's B broth)와 NB(nutrient broth, Difco) 배지별로 28℃에서 120 rpm으로 24시간 진탕배양하였다.
- 0) (Gomori, 1955)의 완충액을 이용하여 시험하였다. 생육 온도범위는 10~55℃로 조절된 배양기에서 2일간 배양 후 생육여부를 조사하였다. 염농도 따른 생육 범위는 NaCl을 배지에 첨가해 1% 간격으로 0~16%로 조정한 후 수행하였다.
- 생육 온도범위는 10~55℃로 조절된 배양기에서 2일간 배양 후 생육여부를 조사하였다. 염농도 따른 생육 범위는 NaCl을 배지에 첨가해 1% 간격으로 0~16%로 조정한 후 수행하였다.
- 2엽기의 오이 유묘에 균주 CC110을 TSB배지에서 배양한 배양액을 분무처리하고 5시간 후에 배양한 노균병균을 붓을 사용하여 유주자낭을 수거하여 유주자낭 1×105 ml-1로 조절하여 상온에 2시간 방치하였다. 오이노균병균을 배양액을 처리한 2엽기의 오이 식물체에 처리당 6반복으로 분무 접종하여 상대습도 100%이며, 20oC로 조절한 접종상에 넣어 7일 후에 오이 노균병의 병반면적율을 조사하였다.
- 유리온실에서 육묘한 3엽기의 싱싱백다다기오이를 비닐하우스 포장에 정식하여 오이 노균병이 발생하기 전에 선발 균주를 TSB배지에 배양하여 5일 간격 4회와 7일 간격 3회 3반복으로 처리하고, 대조약제로 디메토모르프수화제 1,000배를 7일 간격으로 3회 3반복으로 처리하여 최종 처리 7일 후에 오이 노균병의 병반면적율을 조사하였다.
- CC110 균주의 분류학적 계통분석을 위해서는 gyrB 유전자 염기서열 분석을 이용하였다. 즉, CC110 균주의 균체에서 PureHelixTM Genomic DNA Prep Kit (Nanohelix Co., Korea)로 추출한 DNA를 UP1과 UP2r 프라이머(Yamamoto and Harayamaet al.,, 1995)를 이용하여 PCR을 통해 gyrB 유전자를 증폭하였다. 증폭 산물은 다시 UP1과 UP2r primer와 DNA sequencing kit (BigDye terminator Cycle Sequencing Ready Reacions v3.
- ,, 1995)를 이용하여 PCR을 통해 gyrB 유전자를 증폭하였다. 증폭 산물은 다시 UP1과 UP2r primer와 DNA sequencing kit (BigDye terminator Cycle Sequencing Ready Reacions v3.1, Applied Biosystem, USA)를 사용하여 반응시킨 후, 3700 Genetic Analyser (Applied Biosystems)로 1,489 bp의 염기서열을 결정하였다. 표준균주와의 염기서열 유사도는 NCBI의 megablast를 통해 계산하였고, 유연관계를 분석하기 위하여 CLUSTAL W program을 이용하여 염기서열을 정렬한 후 MEGA version 5.
- 5% agarose가 얇게 코팅된 슬라이드 글라스에 접종하고, 형광현미경(DM2500, Leica)을 사용하여 1,000배의 배율로 관찰하였다. 포자가 미처 형성되지 못하였거나, 이미 포자가 나출된 균주는 배양 시간을 증가 또는 감소시켜 관찰하였다.
- 형태학적 특성은 TSA 배지에서 1~2일 동안 배양된 균을 1.5% agarose가 얇게 코팅된 슬라이드 글라스에 접종하고, 형광현미경(DM2500, Leica)을 사용하여 1,000배의 배율로 관찰하였다. 포자가 미처 형성되지 못하였거나, 이미 포자가 나출된 균주는 배양 시간을 증가 또는 감소시켜 관찰하였다.
대상 데이터
- 2010년 4월 12일에 순천의 낙안읍, 구례, 공주, 서천, 춘천, 양평 등 오이 재배 단지에서 건전한 오이 잎을 채취하여 오이의 잎을 10% 차아염소산나트륨 용액에 30초간 소독하여 멸균수로 3회 수세한 후 멸균된 유발로 마쇄하여 80℃에서 10분간 처리한 다음 1/10 Tryptic soy agar 배지(TSA, Difco.)에 도말하여 20℃에서 2일간 배양한 후 단콜로니를 분리하여, 다시 20℃에서 새로운 TSA배지에 획선 배양하여 재분리한 단콜로니를 새로운 TSA배지에 이식하여 28℃에서 배양한 균체를 20% glycerol 용액에 담아서 -70℃ 초저온냉동고에 보관하면서 사용하였다.
- Bar, 5 substitutions per 100 nucleotide positions. Bacillus cereus ATCC 14579T (AE016877) was used as an outgroup.
- amyloliquefaciens CC110균주의 배지종류별 오이노균병에 대한 생물검정 결과 LB(Luria-Bertani)와 KB(King's B broth)배지에서 배양한 배양원액 처리에서 전혀 발병하지 않았지만 배양액의 5배 희석액에서 TSB배지의 배양원액보다 많은 오이 노균병이 발생하였다(Table 3). 그러므로 4종의 배지 중에서 오이노균병 발생량이 적은 TSB배지를 선발하였다.
- 오이 노균병균(P. cubensis)은 국립농업과학원 오이 재배 포장에서 채집한 병든 오이 잎에서 노균병균의 포자낭을 수거하여 현탁액으로 제조하여 건전한 오이 잎 뒷면에 접종하여 습실 처리한 플라스틱 상자안에 넣고 20℃ 조절한 하루에 12시간씩 형광등이 조사되는 배양기에 넣어 7~10일간 배양하면서 오이 잎에 형성한 노균병균을 수거하여 건전한 오이 잎에 접종하는 계대배양을 하면서 실험에 이용하였다. 오이 식물체는 바로커상토(서울바이오)를 직경 7 cm 비닐포트에 담아 싱싱백다다기 오이(동부한농)를 파종하여 온실에서 재배한 오이 잎을 사용하였다.
- cubensis)은 국립농업과학원 오이 재배 포장에서 채집한 병든 오이 잎에서 노균병균의 포자낭을 수거하여 현탁액으로 제조하여 건전한 오이 잎 뒷면에 접종하여 습실 처리한 플라스틱 상자안에 넣고 20℃ 조절한 하루에 12시간씩 형광등이 조사되는 배양기에 넣어 7~10일간 배양하면서 오이 잎에 형성한 노균병균을 수거하여 건전한 오이 잎에 접종하는 계대배양을 하면서 실험에 이용하였다. 오이 식물체는 바로커상토(서울바이오)를 직경 7 cm 비닐포트에 담아 싱싱백다다기 오이(동부한농)를 파종하여 온실에서 재배한 오이 잎을 사용하였다.
- 원예용 장기육묘용 상토(부농상토)와 바로커상토(서울바이오)를 1:1로 비율로 혼합하여 직경 7 cm 비닐포트에 담아 은성백다다기 오이(농우종묘)를 파종하여 온실에서 재배하였다. 2엽기의 오이 유묘에 균주 CC110을 TSB배지에서 배양한 배양액을 분무처리하고 5시간 후에 배양한 노균병균을 붓을 사용하여 유주자낭을 수거하여 유주자낭 1×105 ml-1로 조절하여 상온에 2시간 방치하였다.
데이터처리
- 1, Applied Biosystem, USA)를 사용하여 반응시킨 후, 3700 Genetic Analyser (Applied Biosystems)로 1,489 bp의 염기서열을 결정하였다. 표준균주와의 염기서열 유사도는 NCBI의 megablast를 통해 계산하였고, 유연관계를 분석하기 위하여 CLUSTAL W program을 이용하여 염기서열을 정렬한 후 MEGA version 5.1 프로그램(Tamura et al., 2011)을 이용하여 진화계통수를 작성하였다. branch의 안정성은 1,000회의 resampling (bootstrap value)을 통하여 조사하였다.
이론/모형
- 단백질(10% skimmed milk, w/v), 전분(1.0%, w/v), 지질(1.0% tributyrin), 섬유소(CM-cellulose, 0.1%, w/v), 키틴(0.5%, w/v)의 가수분해능은 Smibert & Krieg(1994)의 방법에 준해 수행하여 배양 7일 후에 판정하였다.
성능/효과
- B. amyloliquefaciens CC110균주의 배지종류별 오이노균병에 대한 생물검정 결과 LB(Luria-Bertani)와 KB(King's B broth)배지에서 배양한 배양원액 처리에서 전혀 발병하지 않았지만 배양액의 5배 희석액에서 TSB배지의 배양원액보다 많은 오이 노균병이 발생하였다(Table 3).
- CC110 균주의 생리생화학 특성을 조사한 결과, 그람 양성, 호기성이며 포자를 형성하는 간균(2.9×0.9 µm)으로 편모를 통해 운동하는 하는 것으로 관찰되었다.
- CC110균주를 TSB배지에서 배양한 배양액은 LB, NB와 KB 배지에서 배양한 배양액보다 오이 노균병 발생이 적어 효과적이었다.
- 배양액은 원액, 2배액과 5배액으로, 배양여액은 원액, 2배액과, 5배액으로 희석 처리하고, 세포(cell)는 농도별로 오이 잎에 처리하여 생물검정을 한 결과 배양액 처리와 배 양여액처리에서 희석배수가 높을수록 오이 노균병 발생량이 많았으며, cell 처리에서 cell 농도가 높을수록 오이 노균병이 발생량이 많았지만, cell이 1×108/ml 처리는 9.4%, 5×107/ml 처리구에서 10.0%, 1×107/ml 이하 처리에서는 무처리구와 노균병 발생이 비슷하여 방제효과가 거의 없었다 (Table 4).
- 분리균주를 Tryptic Soy Broth 배지(TSB, Becton, Difco.) 에 이식하여 28°C에서 150 rpm으로 24시간 배양하였고, 2엽기의 오이 잎절편을 이용한 생물검정한 결과에서 분리 균주의 배양액을 분무처리하고 노균병균을 접종하는 예방 효과에서 모든 균주가 전혀 노균병이 발생하지 않았지만, 노균병을 접종하고 분리균주의 배양액을 처리하는 치료효과에서는 균주 CC110을 제외한 모든 균주는 노균병이 발생하여 균주 CC110을 선발하였다(Table 1).
- 비닐하우스 포장에서 오이 노균병에 대하여 B. amyloliquefaciens CC110균주를 5일 간격 4회 처리가 7일 간격 3회 처리보다 방제효과가 높았다.
- 오이 노균병균을 배양액을 처리한 2엽기의 오이 식물체에 분무 접종하여 상대습도가 100%이며 20°C로 조절한 접종상에 넣어 7일후에 오이 노균병 발생을 조사한 결과 CC 110균주의 배양액처리구가 35.0%, 무처리구가 82.0%노균병이 발생하여 57.3%의 방제효과를 나타내었다(Table 5, Fig. 3).
후속연구
- 본 연구에서 선발한 B. amyloliquefaciens CC110균주도 이와 유사한 항균물질 생산 유전자를 가질 수 있어 식물병방제에 우수한 균주로 생각되며, 추후에 오이 노균병균에 대한 작용기작 연구가 필요하며 포장에서 경엽처리보다도 종자처리와 함께 경엽 처리하면 오이노균병에 대한 생물적 방제 효과를 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.
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