[논문]구미강활탕의 성분 분석 및 LDL 산화억제 효능 연구

김온순; 서창섭; 신현규

구미강활탕의 성분 분석 및 LDL 산화억제 효능 연구
Simultaneous Determination of Gumiganghwal-tang and Its Anti-atherosclerotic Effect 원문보기

대한예방한의학회지 = Journal of Society of Preventive Korean Medicine, v.17 no.3, 2013년, pp.165 - 176

김온순 (한국한의학연구원 한약연구본부 한약방제연구그룹) , 서창섭 (한국한의학연구원 한약연구본부 한약방제연구그룹) , 신현규 (한국한의학연구원 한약연구본부 한약방제연구그룹)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : The purpose of this study was to establish the simultaneous analysis for six compounds in Gumiganghwal-tang (GMGHT, Jiuweiqianghuo-tang) and to investigate the anti-atherosclerotic effects of GMGHT in vitro. Methods : The column for separation of six compounds was used Luna $C_{18}$ column and maintained at $40^{\circ}C$. The mobile phase for gradient elution consisted of two solvent systems, 1.0% acetic acid in water and 1.0% acetic acid in acetonitrile. The analysis was carried out at a flow rate of 1.0 mL/min with pothodiode array (PDA) detection at 254, 280, and 320 nm. The injection volume was 10 ${\mu}L$. The antioxidant activities of GMGHT were evaluated by measuring free radical scavenging activities on 2,2'-Azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) and 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). The inhibitory effects on low-density lipoprotein (LDL) oxidation were evaluated by the formation of thiobarbituric acid relative substances (TBARS), relative electrophoretic mobility (REM), and fragmentation of apolipoprotein B (ApoB)-100. Results : Calibration curves were acquired with $r^2{\geq}0.9998$. The contents of liquiritin, ferulic acid, baicalin, baicalein, glycyrrhizin, and wogonin in GMGHT were 1.784, 1.693, 37.899, 0.258, 1.869, and 0.034 mg/g, respectively. The GMGHT showed the radical scavenging activity in a dose-dependent manner. The concentration required for 50% reduction ($RC_{50}$) against ABTS and DPPH radicals were 72.51 ${\mu}g/mL$ and 128.49 ${\mu}g/mL$. Furthermore, GMGHT reduced the oxidation properties of LDL induced by $CuSO_4$. Conclusion : HPLC-PDA is considered as an available and convenient method for quality control and standardization of GMGH and GMGHT has potentials on anti-atherosclerosis by anti-oxidative effect and suppressive effect on LDL oxidation.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

거품세포는 대식세포의 염증 반응 및 평활근 세포의 분화·증식 및 혈관내피세포의 변화를 유도하여 플라크를 생성함으로써 동맥경화를 유발하게 된다^22,23). 동맥경화 초기 발병 및 진행에 있어 주요 기전으로 알려진 산화 LDL의 형성을 억제하는 효능을 평가하여 구미강활탕의 새로운 응용가능성을 검토하고자 하였다. 구미강활탕은 농도의존적인 항산화효과와 더불어,Cu ²⁺에 의한 LDL산화를 억제하여 oxLDL의 형성을 억제하는 효과를 관찰하였다.
본 연구에서는 구미강활탕의 품질관리를 위하여 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin, 천궁의 feruli cacid 및 황금의 baicalin, baicalein 및 wogonin 등 6종 성분에 대하여 광다이오드 어레이 (photodiode array, PDA)가 결합된 고성능 액체크로마토그래피 (high perfomance liquide chromatography, HPLC)를 이용하여 동시 정량을 실시하였다. 또한 본 처방에 대하여 항산화 효과와 LDL산화 억제 효과를 분석하여 동맥경화질환의 예방 및 치료의 적용 가능성을 검토하였다.
총 9종의 생약으로 구성된 한약 처방인 구미강활탕의 품질개선 및 표준화방법에의 응용 가능성을 목적으로 본 연구에서는 총 9종의 성분에 대하여 HPLC-PDA를 이용하여 동시분석을 실시하여, liquiritin,ferulicacid,baicalin,baicalein, glycyrrhizin및 wogonin등 6종의 성분에 대해서 정량적인 결과를 도출하였다.구미강활탕을 구성하고 있는 생약 및 지표 성분의 항산화 및 LDL산화 억제 효능은 많은 연구를 통해 알려져 왔다^19,20,21).

제안 방법

ABTS 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 ABTS+· cation decol orization assay 방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다.
HPLC-PDA를 이용하여 구미강활탕을 구성하는 9종의 생약 중 천궁의 ferulicacid,백지의 imperatorin과 isoimperatorin,황금의 baicalin, baicalein및 wogonin,생지황의 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde(5-HMF)및 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin등 9종의 성분에 대하여 동시 분석조건을 설정하였다.물-아세토나이트릴 또는 물-메탄올 등과 같은 이동상과 꼬리 끌림 현상을 줄이기 위하여 초산을 첨가하여 최적의 분석조건을 탐색하였다.
LDL산화 억제 활성을 검색하고자 Cu²⁺에 의해 LDL산화를 유도하고, 추출물을 처리하여 LDL산화 정도를 비교 분석하였다.TBARSassay결과 구미강활탕 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 저해효과를 나타냈으며, IC50값이 55.
Liquiritin, ferulicacid, baicalin, baicalein, glycyrrhizin 및 wogonin등 6종의 표준용액에 대하여 메탄올을 이용하여 모두 1,000 ug/mL의 농도로 제조하였다.
구미강활탕 내 주요 구성 성분의 함량을 분석하기 위하여 사용된 칼럼은 Luna C18(5 um, 4.6×250 mm, Torrance, CA, USA)칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40℃로 유지하였다.
동맥경화 초기 발병 및 진행에 있어 주요 기전으로 알려진 산화 LDL의 형성을 억제하는 효능을 평가하여 구미강활탕의 새로운 응용가능성을 검토하고자 하였다. 구미강활탕은 농도의존적인 항산화효과와 더불어,Cu ²⁺에 의한 LDL산화를 억제하여 oxLDL의 형성을 억제하는 효과를 관찰하였다.
구미강활탕의 구성 생약 중 황금의 baicalin의 정량을 위하여 검액 5 mL을 취하여 물을 넣어 20 mL로 한 뒤 정량분석을 실시하였다.
구미강활탕의 항산화 활성을 평가하고자 추출물을 농도별로 조제한 후 ABTS와 DPPH라디칼 소거활성을 측정하였다.ABTS라디칼의 소거활성을 비교한 결과 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다.
HPLC-PDA를 이용하여 구미강활탕을 구성하는 9종의 생약 중 천궁의 ferulicacid,백지의 imperatorin과 isoimperatorin,황금의 baicalin, baicalein및 wogonin,생지황의 5-(hydroxymethyl)-2-furaldehyde(5-HMF)및 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin등 9종의 성분에 대하여 동시 분석조건을 설정하였다.물-아세토나이트릴 또는 물-메탄올 등과 같은 이동상과 꼬리 끌림 현상을 줄이기 위하여 초산을 첨가하여 최적의 분석조건을 탐색하였다.그 결과 1.
반응 후 thiobarbituric acidreactingsubstance(TBARS)의 형성,16) relativeelectrophoreticmobility(REM)17) 및 apolipoproteinB(ApoB)-100의 fragmentation18)을 측정하였다.
본 연구에서는 구미강활탕의 품질관리를 위하여 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin, 천궁의 feruli cacid 및 황금의 baicalin, baicalein 및 wogonin 등 6종 성분에 대하여 광다이오드 어레이 (photodiode array, PDA)가 결합된 고성능 액체크로마토그래피 (high perfomance liquide chromatography, HPLC)를 이용하여 동시 정량을 실시하였다. 또한 본 처방에 대하여 항산화 효과와 LDL산화 억제 효과를 분석하여 동맥경화질환의 예방 및 치료의 적용 가능성을 검토하였다.
산화 반응이 끝난 LDL10 ug을 0.8% agarose gel에 loading하여 TAE buffer (40 mM Tris, 40mM acetic acid 및 1 mM EDTA)에서 100 V로 30분 동안 전기영동 한 후, Coomassie brilliant blue R-250로 염색하여 이동 거리를 측정하였다.
산화 반응이 끝난 LDL20 ug을 6% SDS-PAGE에 loading하여 TAE buffer(40 mM Tris,40 mM aceticacid 및 1 mM EDTA)에서 100 V로 6시간 동안 전기영동한 후, Coomassie brilliant blueR-250로 염색하여 관찰하였다.
산화 반응이 끝난 LDL50 ug을 취하여 TBARS AssayKit(BioAssaySystems, Hayward, CA, USA)를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 malondialdehyde (MDA)표준곡선에 대입시켜 MDA 양으로 환산하였다.
15 mM의 DPPH 용액과 시료를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 DMSO를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
USA)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.
0 mL/min으로 흘려주었으며 주입량은 10 uL 였다. 이동상은 1.0% acetic acid가 함유된 water (A)와 1.0% acetic acid가 함유된 acetonitrile (B)을 사용하여 0-40분 5-70% B, 40-45분 70-100% B, 45-50분 100% B, 50-55분 100-5% B, 55-70분 5% B로 흘려주었으며 검출파장은 glycyrrhizin은 254 nm, liquiritin, baicalin, bai calein 및 wogonin은 280 nm 및 ferulic acid는 320 nm에서 검출하였다.
산화 반응이 끝난 LDL50 ug을 취하여 TBARS AssayKit(BioAssaySystems, Hayward, CA, USA)를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 malondialdehyde (MDA)표준곡선에 대입시켜 MDA 양으로 환산하였다.

대상 데이터

2,2'-Azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 및 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하였다. HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile 및 water는 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, acetic acid는 특급시약으로 Junsei (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 그 외 모든 시약은 분석용 특급 시약을 사용하였다.
본 실험에 사용된 구미강활탕의 구성 한약재는 (주)옴니허브 (Yeongcheon, Korea)와 (주) HMAX (Jecheon, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 각각의 구성 한약재들의 표본 (2008-KE16-1 ∼ 2008-KE16-9)은 한국한의학연구원 한약방제연구그룹에 보관하였다.
표준물질인 baicalin, baicalein, ferulic acid, glycyrrhizin, liquiritin 및 wogonin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, 각 표준물질의 순도는 98% 이상이었다. 표준물질의 구조는 Fig.
함량분석을 위한 HPLC는 LC-20A 시스템 (Shimadzu Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고, 시스템은 pump (LC-20AT), on-line degasser (DGU-20A₃), column oven (CTO-20A), auto-sampler (SIL-20AC) 및 PDA detector (SPD-M20A)로 구성되어 있다. 분석 data는 LCsolution software (Version1.
시료의 항산화능은 시료를 녹인 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 vitamin C를 사용하였다.

데이터처리

실험결과에 대한 통계학적 유의성 검정은 ANOVA 검정을 적용하였으며, Dunnet’s multiple comparison test를 이용하여 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.

성능/효과

구미강활탕의 항산화 활성을 평가하고자 추출물을 농도별로 조제한 후 ABTS와 DPPH라디칼 소거활성을 측정하였다.ABTS라디칼의 소거활성을 비교한 결과 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다.구미강활탕 추출물 25,50,100, 200및 400ug/mL농도에서 각각 16.
31ug/mL로 관찰되었다(Table 5).DPPH라디칼의 소거활성 또한 ABTS라디칼의 소거활성과 유사하게 농도의존적인 증가를 나타냈다.추출물 25,50,100,200및 400 ug/mL농도에서 각각 2.
Liquiritin,ferulic acid,baicalin,baicalein, glycyrrhizin 및 wogonin등 6종 성분의 peak 면적에 대한 검량선 작성 결과 검량선의 상관계수 (r²)가 모두 0.9998이상으로 1에 가까운 양호한 직선성을 나타내었다(Table3).
에 의해 LDL산화를 유도하고, 추출물을 처리하여 LDL산화 정도를 비교 분석하였다.TBARSassay결과 구미강활탕 추출물의 처리에 의해 농도 의존적으로 저해효과를 나타냈으며, IC50값이 55.29 ug/mL으로 계산되었다(Fig.3). Fig.
검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retentiontime 과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, liquiritin, ferulicacid, baicalin, baicalein, glycy- rrhizin 및 wogonin등 6종의 성분은 16.891분, 17.649분, 22.373분, 28.916분, 31.656분 및 33.911분에 각각 검출되었다(Fig2).
ABTS라디칼의 소거활성을 비교한 결과 추출물의 농도가 증가함에 따라 ABTS라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였다.구미강활탕 추출물 25,50,100, 200및 400ug/mL농도에서 각각 16.01,27.79, 51.81,79.51및 99.45%의 라디칼 소거활성을 나타냈으며, 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양 (RC₅₀)은 72.51ug/mL로 관찰되었다.양성대조군인 vitamin C의 RC₅₀ 값은 2.
4는 Cu²⁺에 의해 유도된 산화 LDL의 전기적 이동차 (REM)에 대한 구미강활탕의 효과를 나타내고 있다. 구미강활탕을 62.5,125,250,500ug/mL 농도로 처리하였을 때 산화 LDL의 REM이 각각 42.93,73.66,82.93,85.85% 감소되었다. 산화 반응을 유도한 LDL에서는 apoB-100가 거의 분절되어 온전한 단백질 band를 관찰할 수 없었지만,구미강활탕 추출물과 함께 산화 반응을 유도한 LDL의 apoB-100은 농도 의존적으로 분절화가 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
물-아세토나이트릴 또는 물-메탄올 등과 같은 이동상과 꼬리 끌림 현상을 줄이기 위하여 초산을 첨가하여 최적의 분석조건을 탐색하였다.그 결과 1.0% 초산이 각각 함유된 물과 아세토나이트릴을 이용하여 기울기용리를 사용하여 9종의 성분을 양호하게 분리하였다. 따라서 확립된 용매조건을 이용하여 본 처방을 분석한 결과 liquiritin, ferulicacid, baicalin, baicalein, glycyrrhizin및 wogonin등 6종의 성분만이 검출이 되었다.
0% 초산이 각각 함유된 물과 아세토나이트릴을 이용하여 기울기용리를 사용하여 9종의 성분을 양호하게 분리하였다. 따라서 확립된 용매조건을 이용하여 본 처방을 분석한 결과 liquiritin, ferulicacid, baicalin, baicalein, glycyrrhizin및 wogonin등 6종의 성분만이 검출이 되었다. 확립된 HPLCPDA 분석법에서 이들 6종의 성분들은 35분 이내에 분리능 등 1.
85% 감소되었다. 산화 반응을 유도한 LDL에서는 apoB-100가 거의 분절되어 온전한 단백질 band를 관찰할 수 없었지만,구미강활탕 추출물과 함께 산화 반응을 유도한 LDL의 apoB-100은 농도 의존적으로 분절화가 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.5).
DPPH라디칼의 소거활성 또한 ABTS라디칼의 소거활성과 유사하게 농도의존적인 증가를 나타냈다.추출물 25,50,100,200및 400 ug/mL농도에서 각각 2.55,15.79,35.60,68.34 및 88.31%의 라디칼 소거활성을 나타냈으며, RC₅₀는 128.49ug/mL로 관찰되었다.양성대조군인 vitaminC의 DPPH 라디칼에 대한 RC₅₀값은 7.
따라서 확립된 용매조건을 이용하여 본 처방을 분석한 결과 liquiritin, ferulicacid, baicalin, baicalein, glycyrrhizin및 wogonin등 6종의 성분만이 검출이 되었다. 확립된 HPLCPDA 분석법에서 이들 6종의 성분들은 35분 이내에 분리능 등 1.6이상으로 양호하게 검출되었으며, 용량인자,분리인자 및 이론단수 등 시스템 적합성도 양호하게 나타났다(Table2). 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retentiontime 과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, liquiritin, ferulicacid, baicalin, baicalein, glycy- rrhizin 및 wogonin등 6종의 성분은 16.
확립된 분석법을 이용하여 구미강활탕의 주요 성분인 liquiritin, ferulicacid, baicalin, baicalein, glycyrrhizin 및 wogonin을 동시정량한 결과 1.784,1.693,37.899,0.258,1.869, and 0.034 mg/g으로 각각 검출되었다(Table4).

후속연구

본 연구에 의해 확립된 HPLC-PDA 동시정량법은 한약처방인 구미강활탕의 품질관리를 위한 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 구미강활탕의 우수한 항산화활성 및 LDL의 산화 억제활성을 통해 산화적 스트레스에 의한 동맥경화질환의 초기단계를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에 의해 확립된 HPLC-PDA 동시정량법은 한약처방인 구미강활탕의 품질관리를 위한 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 구미강활탕의 우수한 항산화활성 및 LDL의 산화 억제활성을 통해 산화적 스트레스에 의한 동맥경화질환의 초기단계를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	연구보고를 통해 확인한 구미강활탕의 효과는 무엇인가?	구미강활탕은 해표작용 (解表作用)과 제습작용 (除濕作用)을 통하여 병인을 다스리는 처방으로 강활 (羌活),방풍 (防風),천궁 (川芎),백지 (白芷),창출 (蒼朮),황금 (黃芩),생지황 (生地黃),세신 (細辛)및 감초 (甘草)등 9종의 생약으로 구성되어 있다.다양한 연구보고를 통해 세포 및 실험동물 수준에서의 항염증효과8,9,10)및 해열 및 진통 효과11)를 확인하였으며,이에 대한 임상증례가 보고되어 있다12).또한 급성독성에 대한 안정성 연구를 통해 신뢰성 있는 독성 및 안전성 자료가 확보되어 있다12,13).
	구미강활탕은 어떨 때에 사용되던 처방인가?	1,2)또한 한약처방은 합성의약품이나 양약에 비하여 비교적 부작용이 적어 오늘날에도 관심과 수요가 증가하고 있다.3,4)이러한 한약처방 중 하나인 구미강활탕 (九味羌活湯)은 사계절을 막론하고 감모풍한 (感冒風寒)으로 두통이 있고 골절이 아프며,발열오한에 사용해온 처방으로5,6),현재 건강보험 한약제제 56종 중 전체 처방투약 일수의 6.1%,총약제비의 7.
	구미강활탕은 어떠한 생약들로 구성되어있는가?	구미강활탕은 해표작용 (解表作用)과 제습작용 (除濕作用)을 통하여 병인을 다스리는 처방으로 강활 (羌活),방풍 (防風),천궁 (川芎),백지 (白芷),창출 (蒼朮),황금 (黃芩),생지황 (生地黃),세신 (細辛)및 감초 (甘草)등 9종의 생약으로 구성되어 있다.다양한 연구보고를 통해 세포 및 실험동물 수준에서의 항염증효과8,9,10)및 해열 및 진통 효과11)를 확인하였으며,이에 대한 임상증례가 보고되어 있다12).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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