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문제 정의
- 본 연구에서는 소리쟁이 뿌리의 항산화제로서의 활용 가능성에 대한 검정을 하기 위하여 소리쟁이 뿌리 추출물의 항산화 활성, 생체기관의 광피해 억제 효과 등을 연구하였다.
제안 방법
- 다양한 소리쟁이 뿌리 추출물에 대한 단일항산소 억제 효과를 검증하기 위하여 광증감 반응(Type-II photosensitization)에 의해 발생되는 단일항산소의 억제 효과를 분석하였다. 시료의 농도별 처리에 따른 단일항산소 억제 효과는 Fig.
- 반면 ascorbic acid, EE 및 BE를 첨가하였을 때 생육 저지환의 크기가 감소하는 것으로 보아 이들이 활성산소를 억제하거나 제거한 것으로 판단되며, 그로 인해 대장균 생존에 영향을 끼친 것으로 생각할 수 있었다. 또한 자외선 및 강한 직사광선에 의한 생체기관의 파괴로부터 소리쟁이 뿌리 추출물의 역할을 알아보기 위해 유전자 수준에서 DNA 손상 억제력 시험을 실시하였다(Fig. 7).
- 정제가 되지 않은 추출물 상태에서 우수한 항산화 활성이 나타난 것으로 보아 자외선을 포함한 강한 직사광선에 노출되었을 경우 발생하는 활성산소를 소거하는 능력이 뛰어나리라 판단이 되었으며, 빛에 의해 발생되는 단일항 산소에 대한 피해로부터 보호해 주는 광피해 억제 효과에 대한 연구를 수행하였다. 우선 광증감 반응(Type-II photosensitization)으로 생성되는 활성산소에 의한 대장균의 피해로부터 소리쟁이 뿌리 추출물의 역할을 알아보기 위해 단일항 산소 억제 효과가 우수하였던 EE, BE 추출물의 광보호(photoprotection)효과를 분석하였다. 무처리군, 광증감제 처리군 및 광증감제+시료(추출물 또는 아스코르브산) 처리군으로 구분하여 빛에 노출시킨 후 페이퍼디스크 주변의 대장균 생육상태(생육 저지환 크기)를 관찰하였다.
- 2 여지로 여과하여 고형물을 제거하고, 70% 에탄올 추출액을 감압농축기(EYELA N1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 40℃에서 농축하였다. 획득한 소리쟁이 추출물에 일정량의 물을 첨가하여 1 L로 부피를 맞춘 후, 극성도가 다른 추출용매인 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄 올 1:1 비율로 차례대로 넣어 각 분획을 얻었다. 먼저 분액여두에 헥산을 소리쟁이 추출물과 동량을 넣고, 잘 혼합한 후 수층과 추출용매의 두 층으로 나눈다.
대상 데이터
- 소리쟁이 뿌리는 경상북도 영천시 금호강변에서 2012년 6월 말에 채취해 음지에서 5일간 자연 건조하였으며, 시료의 추출 및 분획 과정은 Fig. 1과 같다.
이론/모형
- ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt] 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS radical cation decolorization 방법(19)에 의하여 측정하였는데, 7 mM ABTS와 2.4 mM potassium persulphate를 섞어 12시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 ABTS 라디칼을 형성시켜 냉장 보관하였으며, radical stock solution은 734 nm에서 흡광도 값이 0.70(±0.02)이 되도록 에탄올로 희석하였다. 이 용액 0.
- Brand-Williams 등의 방법(18)에 따라 DPPH(2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성을 평가하였다. 6×10-5 MDPPH를 메탄올에 녹인 후, DPPH 라디칼 용액 900 μL와 시료 100 μL를 혼합한 후 5분간 반응시킨 후 분광광도계 (UV-1800, Shimadzu) 사용하여 517 nm에서 흡광도를 평가 하였다.
- Rose bengal(RB)의 광증감 반응에 의해 생성된 단일항산소를 측정하기 위하여 imidazole-RNO bleaching 방법(20)을 이용하였다. 단일항산소 분석은 2 μM rose bengal, 5 mM imidazole 그리고 4 μM RNO를 녹인 20 mM Tris-succinate buffer(pH 6.
- 생체기관의 광피해 억제력 시험은 소리쟁이 추출물이 빛에 의해 야기되어진 활성산소로부터 생체 기관을 보호하는 지를 검증하는 실험으로서, 본 연구에서는 단일항산소에 의한 대장균 사멸억제 및 DNA 손상억제에 대한 연구를 Suh 등의 방법(21)으로 수행하였다. 대장균 사멸억제 효과 검증을 위하여 Escherichia coli Luria-bertari 고체배지와 멸균 처리된 페이퍼디스크, 광증감제(10 μg rose bengal)가 사용되었다.
- 총 페놀 함량은 다양한 용매로 추출된 소리쟁이 뿌리 추출물(HE, CE, EE, BE, ME, WE)에 대하여 총 폴리페놀 함량을 평가하기 위해 Folin-Ciocalteu법(17)을 이용하였다. 즉 시료 100 μL와 Folin-ciocalteu시약 50 μL, 20% Na2CO3 850 μL를 혼합한 후 2시간 동안 암실에서 보관한 후, 분광광 도계(UV-1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 765 nm에서 측정하였다.
성능/효과
- 소리쟁이 뿌리 추출물의 전자 공여능을 측정한 결과는 Fig. 3과 같은데, DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 IC50 값이 WE 0.057 mg/mL, ME 0.077 mg/mL, BE 0.015 mg/mL, EE 0.005 mg/mL, CE 0.039 mg/mL, HE 0.093 mg/mL를 나타내어 소리쟁이 뿌리 추출물의 DPPH 소거 활성이 우수하다는 것을 알 수 있었다. 특히 에틸아세 테이트 추출물(EE)과 부탄올 추출물(BE)에서 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었는데, 비교 물질로 주로 사용되는 ascorbic acid의 0.
- 결론적으로 소리쟁이 뿌리 추출물의 총 페놀 함량, DPPH, ABTS 및 단일항산소 분석 결과를 종합해 볼 때 모든 실험에서 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물에서 아주 우수한 항산화 활성을 보였고, 강한 광에 노출되었을 때 일어날 수 있는 생체기관의 광피해로부터 생명체를 보호하는 중요한 반응을 할 것이라고 판단한다. 향후 in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되며.
- 7에서와 같이 EE를 첨가하지 않고 광에 노출된 3, 5 시료에 비해 EE를 첨가한 4, 6 시료에서 DNA의 손상이 적은 것을 확인할 수 있었다. 소리쟁이 뿌리 추출물인 EE가 광조건 하에서 발생한 활성산소에 의한 DNA손상을 억제하는 효과를 보인 것을 알 수 있었다.
- 083 mg GA/mg extract를 나타내 상대적으로 적게 검출되었다. 일반적으로 페놀성 화합물의 함량은 항산화력과 정의 상관관계를 나타내며, 소리쟁이 뿌리 추출물에 따른 총 페놀 함량으로 보아 소리쟁이 뿌리의 항산화력은 아주 우수한 것으로 판단되었다.
- 정제가 되지 않은 추출물 상태에서 우수한 항산화 활성이 나타난 것으로 보아 자외선을 포함한 강한 직사광선에 노출되었을 경우 발생하는 활성산소를 소거하는 능력이 뛰어나리라 판단이 되었으며, 빛에 의해 발생되는 단일항 산소에 대한 피해로부터 보호해 주는 광피해 억제 효과에 대한 연구를 수행하였다. 우선 광증감 반응(Type-II photosensitization)으로 생성되는 활성산소에 의한 대장균의 피해로부터 소리쟁이 뿌리 추출물의 역할을 알아보기 위해 단일항 산소 억제 효과가 우수하였던 EE, BE 추출물의 광보호(photoprotection)효과를 분석하였다.
- 093 mg/mL를 나타내어 소리쟁이 뿌리 추출물의 DPPH 소거 활성이 우수하다는 것을 알 수 있었다. 특히 에틸아세 테이트 추출물(EE)과 부탄올 추출물(BE)에서 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었는데, 비교 물질로 주로 사용되는 ascorbic acid의 0.010 mg/mL과 비교될 정도로 상당히 높은 수준의 항산화력을 가지는 것을 확인하였다. 또한 클로로포름 추출물(CE)과 물 추출물의(WE) 경우도 비교적 우수한 활성을 띄고 있었으며, 헥산 추출물(HE)과 메탄올 추출물(ME)은 비교적 라디칼 소거 활성이 낮게 나타났다.
- 4 μg/mL로 상대적으로 낮았으며 헥산 분획의 경우 ABTS 라디칼 소거활성을 확인할 수 없었다. 항산화제로 잘 알려져 있는 ascorbic acid의 IC50 값이 3.35 μg/mL로 측정되어진 것을 볼 때 본 연구에 사용되어진 에틸아세테이트 추출물(EE)은 매우 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 가진 다는 것을 알 수 있었다. 또한 DPPH 라디칼 저해 활성이 ABTS 라디칼 저해 활성보다 높게 나온 경향을 볼 수 있는데 이는 ABTS 라디칼이 DPPH 라디칼 보다 좀 더 강력한 산화 물질이기 때문인 것으로 사료된다(25).
후속연구
- 총 페놀 함량도 에틸아세테이트와 부탄올 추출물에서 높은 수준을 나타내었다. 결론적으로 소리쟁이 뿌리의 추출물은 생물체의 산화적 스트레스로부터 야기되는 활성산소를 억제하는 중요한 역할을 하며, 보다 심도 깊은 연구를 진행한다면 새로운 생물 소재로 활용성이 높을 것으로 사료된다.
- 향후 in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되며. 식품산업, 향장산업 및 의약산업에 적용한다면 활용성이 높을 것으로 사료된다.
- 결론적으로 소리쟁이 뿌리 추출물의 총 페놀 함량, DPPH, ABTS 및 단일항산소 분석 결과를 종합해 볼 때 모든 실험에서 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물에서 아주 우수한 항산화 활성을 보였고, 강한 광에 노출되었을 때 일어날 수 있는 생체기관의 광피해로부터 생명체를 보호하는 중요한 반응을 할 것이라고 판단한다. 향후 in vivo 실험 및 순물질 정제를 통해 심도 깊은 연구가 진행되어야 할 것으로 판단되며. 식품산업, 향장산업 및 의약산업에 적용한다면 활용성이 높을 것으로 사료된다.
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