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문제 정의
- 약재로 사용되는 뿌리 부분은 골다공증에 관해 보고된 것이 없는 실정이다. 본 연구에서는 건조되지 않은 소리쟁이 뿌리로부터 ethanol 추출물을 얻은 후 계통적 추출방법에 의해 ethyl acetate, chloroform 분획물을 얻은 후 이를 시료로 하여 조골 세포의 생존율과 분화 정도에 미치는 영향을 연구하였다.
- 본 연구에서는 소리쟁이 뿌리 ethanol 추출물과 그로부터 극성에 따라 제조한 ethyl acetate 및 chloroform 분획을 대상으로 HPAEC-PAD를 이용하여 그 구성당 성분을 분석하고 인체 조골세포주인 MG-63 세포를 이용하여 세포생존율과 ALP 활성, 석회화 형성 정도에 미치는 영향을 연구하였다. 소리쟁이 뿌리의 ethanol 추출물은 농도 의존적으로 세포의 증식을 증가시키는 경향을 나타냈으며 세포 독성을 나타내지 않는 농도 범위에서 ALP 활성과 석회화 결절 형성 정도를 유의하게 농도 의존적으로 상승시켰다.
제안 방법
- 15) 조골세포를 24-well plate에 2×104 cells/well의 농도로 분주하고 시료를 첨가한 DMEM 배지로 교환하고 72시간 배양하였으며 아무것도 처리하지 않은 DMEM 배지를 대조군으로 하였다.
- 20 µg/ml에서 세포의 생존율이 대조군에 비하여 61%로 감소하였으므로 소리쟁이 ethanol 추출물이 MG-63세포의 ALP 활성과 석회화 결절 형성에 미치는 영향을 관찰하는 실험에서는 소리쟁이 추출물을 2 µg/ml 이하의 농도로 사용하였다.
- 21) 그러므로 시료가 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보는 biomarker로서 ALP 활성을 측정하였다. 양성 대조군으로 사용한 daidzein은 0.
- ALP 활성도는 p-nitrophenyl phosphate(pNPP, Sigma-Aldrich)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하여 생성되는 p-nitrophenol의 양을 405 nm 파장에서 microplate reader를 이용하여 측정함으로써 산출하였다.15) 조골세포를 24-well plate에 2×104 cells/well의 농도로 분주하고 시료를 첨가한 DMEM 배지로 교환하고 72시간 배양하였으며 아무것도 처리하지 않은 DMEM 배지를 대조군으로 하였다.
- 소리쟁이 뿌리를 3차 증류수로 수세하고 얇게 절단하여 3일간 음건 후 분쇄하였다. Ethanol 추출은 소리쟁이 뿌리 분쇄물 3 g에 70% ethanol 30 ml를 가하고 실온에서 교반하며 18시간 추출하여 3회 반복 추출하였다. 이 추출액을 2000 rpm, 60분간 원심분리하고 상층액을 취하여 0.
- MG-63 세포를 96-well plate에 2×103 cells/well의 농도로 분주하고 시료를 농도별로 희석하여 첨가한 DMEM 배지를 각 well에 투여하였으며, 아무 처리하지 않은 DMEM 배지에 배양한 세포군을 대조군으로 하여 72시간 동안 배양하였다.
- 석회화 결절 형성은 조골세포의 후기 분화 단계의 biomarker로서 alizarin red S(ARS) 염색법을 이용하여 확인할 수 있으며, alizarin은 무기질화된 세포 기질의 칼슘을 염색하므로 석회화 결절을 형성한 정도와 염색 정도가 비례한다. MG-63 세포를 소리쟁이 ethanol 추출물을 포함하는 조골세포 분화용 배지에서 12일 간 배양하고 alizarin red S로 염색하여 석회화물의 형성 정도를 비교하였다. 소리쟁이 ethanol 추출물은 유의하게 농도 의존적으로 MG-63 세포의 석회화 형성능을 상승시켰고 특히 0.
- 1% Triton X-100을 처리한 후 -70℃에서 얼리고 37℃에서 녹이는 방법으로 세포막을 파괴하였다. 그 후, 4℃, 14,000 g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 모아 ALP 활성도를 측정하였다. 세포수 차이에 따른 ALP 활성도 변화를 고려하기 위해 총단백질 양은 bovine serum albumin(BSA)을 표준 단백질로 bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 측정하였으며 효소 활성은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
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단당분석
단당류(Fuc, Ara, Gal, Glc, Man, Xyl, GalN, GlcN), 이당류(fructose, sucrose), 당알코올류(mannitol) 등 총 11종류의 표준당을 포함하는 표준용액을 단계적으로 희석한 것을 Carbopac-PA10 column으로 분석함으로써 각 단당의 용출시간을 확인하였고(Fig. 1A), 성분당 정량을 위한 검량선을 도출하여 정량에 이용하였다. HPAEC-PAD를 이용하여 이동상은 20 mM NaOH, 유속은 0.
- 그 후, 4℃, 14,000 g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 모아 ALP 활성도를 측정하였다. 세포수 차이에 따른 ALP 활성도 변화를 고려하기 위해 총단백질 양은 bovine serum albumin(BSA)을 표준 단백질로 bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 측정하였으며 효소 활성은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
- 소리쟁이 뿌리를 3차 증류수로 수세하고 얇게 절단하여 3일간 음건 후 분쇄하였으며, ethanol 추출은 소리쟁이 뿌리 분쇄물 3g에 70% ethanol 30 ml를 가하고 실온에서 교반하며 18시간 추출하여 3회 반복 추출하였다. 이 추출액을 2000 rpm에 60분간 원심분리하고 상층액을 취하여 0.
- 소리쟁이 추출물이 뼈의 신생 및 재생에 관여하는 인체 조골세포인 MG-63 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 WST assay를 실시하였다. MG-63 세포의 생존율은 배양액만 처리한 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
- 45 µm syringe filter로 여과하였다. 여과된 추출액을 rotary evaporator로 감압, 농축하여 추출 농축액을 얻은 다음 동결 건조하여 ethanol 추출 분말을 얻었다. 이 추출 분말을 30 ml의 3차 증류수에 현탁시킨 후 n-hexane, chloroform, ethylacetate, 1-butanol 순으로 분액여두에서 진탕 추출 후 분획하였다.
- 여과된 추출액을 rotary evaporator로 감압, 농축하여 추출 농축액을 얻은 다음 동결 건조하여 ethanol 추출 분말을 얻었다. 이 추출 분말을 30 ml의 3차 증류수에 현탁시킨 후 n-hexane, chloroform, ethylacetate, 1-butanol 순으로 분액여두에서 진탕 추출 후 분획하였다.
- 조골세포를 24-well plate에 3×103 cells/well이 되도록 분주하고, 50 µg/ml ascorbic acid(Sigma-Aldrich), 10 mM β-glycerophosphate(Sigma-Aldrich), 10−7 M dexamethasone(Sigma-Aldrich)이 포함된 DMEM 배지에 시료를 첨가하여 각 well에 투여하였고, 3~4일마다 식물 추출물을 포함한 새 배지로 교환하면서 배양하였다.
- 추출 및 분획에는 3차 증류수, absolute ethanol(HPLC grade, Fisher), n-hexane, chloroform, ethylacetate, 1-butanol(extra pure, Samchun pure chemical), SmartPor PTFE syringe filter with 25 mm 0.45 µm, SmartPor GHP syringe filter with 25 mm 0.45 µm, rotary evaporator(N-1200A, EYELA), freeze drier(FD-1000, EYELA) 등을 사용하였다.
- 추출물 중의 단당 분석을 위해 high-performance anionexchange chromatography-pulsed amperometric detector(HPAEC-PAD)를 사용하였으며, 데이터는 Chromelon 6.80 소프트웨어(Dionex)를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 column은 AminoTrap(Dionex) column이 연결된 CarboPac-PA10(Dionex) column이며, 온도는 27℃를 유지하였다.
- 표준용액과 소리쟁이 추출물은 0.2 µm PVDF syringe filter를 이용하여 여과 후 분석을 실시하였다.
대상 데이터
- Human osteoblast-like MG-63 세포는 서울대학교 한국 세포주 은행에서 구입하였으며, 10%의 FBS(Gibco BRL)와 1%의 penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL.)이 포함된 Dulbecco's modification of Eagle's medium(DMEM, Corning) 배지로 37℃, 5% CO2의 환경을 유지시켜주며 배양하였고, 세포가 배양 flask에 70~80% 정도 증식되었을 때 계대하였다.
- 본 실험에 사용한 소리쟁이는 제주도 소재 제주자원식물 산업연구소에서 구입하여, 외부형태를 비교 조사 후 사용하였다.
- 80 소프트웨어(Dionex)를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용된 column은 AminoTrap(Dionex) column이 연결된 CarboPac-PA10(Dionex) column이며, 온도는 27℃를 유지하였다. 이동상은 20 mM NaOH(Fischer)로 하고 0.
- 5 ml/min의 유속을 유지하며 AgCl을 작용 전극으로 하였다. 표준용액은 Sigma에서 구입한 단당류 fucose(Fuc), arabinose(Ara), galactose(Gal), glucose(Glc), mannose(Man), xylose(Xyl), galactosamine(GalN), glucosamine(GlcN)), 이당류 fructose, sucrose, 당알코올류(mannitol)를 각각 800 pmole 씩 포함하도록 제조하고 단계적으로 희석하여 사용하였다. 표준용액과 소리쟁이 추출물은 0.
데이터처리
- 실험의 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.
- 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(WST-8)은 Dojindo에서 구입하였으며, WST-8의 정량은 Tominaga 방법14)에 따라 실시하였다. MG-63 세포를 96-well plate에 2×103 cells/well의 농도로 분주하고 시료를 농도별로 희석하여 첨가한 DMEM 배지를 각 well에 투여하였으며, 아무 처리하지 않은 DMEM 배지에 배양한 세포군을 대조군으로 하여 72시간 동안 배양하였다.
- 2 − Effects of (A) daidzein, (B) ethanol extract, and (C) ethyl acetate (left) and chloroform (right) extracts on the proliferation of MG-63 cells. Cells were treated with the extract for 72 hrs in 96-well plates, and their viability was measured using the WST assay. Results represent the mean±SD values of three independent samples.
성능/효과
- 20) Daidzein은 조골세포 생존율을 농도 의존적으로 증가시켜 1 µg/ml의 농도에서는 대조군에 비해 129.4%의 세포생존율을 나타내었고, 그 이상의 농도에서는 세포생존율을 저하시켰다(Fig. 2A).
- 먼저 골 전구세포의 증식을 통해 collagen matrix 합성과 골결절 형성을 위한 기반을 형성하고 collagen 합성과 ALP 발현이 증가하면서 matrix의 성숙을 거쳐 최종적으로 석회화 과정이 일어난다.22) 소리쟁이의 ethanol 추출물은 조골세포의 생존을 높이고 분화 과정 전반에 걸쳐 anabolic effect를 갖는 것으로 사료되며, ethly acetate 분획을 통해 얻은 성분은 세포 생존에는 영향을 미치지 않으나 초기 분화 단계를 촉진하는 것으로 판단된다. 이러한 결과를 고려하여 볼 때 소리쟁이 뿌리성분은 조골세포의 증식과 분화에 관여하는 우수한 소재로 골다공증 예방 및 치료제로서의 개발 가능성을 가진 천연물 소재로 평가되며, 현재는 소리쟁이 추출물을 column으로 분리 후 얻어진 개별 물질의 조골세포 분화에 대한 활성을 확인하고 있다.
- 1A), 성분당 정량을 위한 검량선을 도출하여 정량에 이용하였다. HPAEC-PAD를 이용하여 이동상은 20 mM NaOH, 유속은 0.5 ml/min의 조건으로 시료 0.01 mg을 주입하여 분석한 결과, 당알코올인 mannitol과 단당류인 Fuc, Glc 및 이당류인 fructose, sucrose가 검출되었다(Fig. 1B). 이를 검량선에 대입 후 환산한 결과, 소리쟁이 추출물의 주요 구성당은 sucrose 148.
- 소리쟁이 ethanol 추출물은 유의하게 농도 의존적으로 MG-63 세포의 석회화 형성능을 상승시켰고 특히 0.02 µg/ml 처리군은 116.2%로 가장 높은 상승을 보였다(Fig. 4).
- 본 연구에서는 소리쟁이 뿌리 ethanol 추출물과 그로부터 극성에 따라 제조한 ethyl acetate 및 chloroform 분획을 대상으로 HPAEC-PAD를 이용하여 그 구성당 성분을 분석하고 인체 조골세포주인 MG-63 세포를 이용하여 세포생존율과 ALP 활성, 석회화 형성 정도에 미치는 영향을 연구하였다. 소리쟁이 뿌리의 ethanol 추출물은 농도 의존적으로 세포의 증식을 증가시키는 경향을 나타냈으며 세포 독성을 나타내지 않는 농도 범위에서 ALP 활성과 석회화 결절 형성 정도를 유의하게 농도 의존적으로 상승시켰다. 골다공증에 대한 효과가 있는 것으로 알려진 대두 isoflavone 성분의 daidzein과 비교시 ALP 활성 증가 효과는 유사하였으며 조골세포에 대한 증식 효과는 미약하였다.
- 소리쟁이 뿌리의 ethanol 추출물은 세포 독성을 나타내지 않는 농도 범위 내에서 MG-63 세포의 ALP 활성을 유의하게 증가시켰으며 0.01~0.1 µg/ml 농도 범위에서 농도 의존적인 경향을 보였다.
- 골다공증에 대한 효과가 있는 것으로 알려진 대두 isoflavone 성분의 daidzein과 비교시 ALP 활성 증가 효과는 유사하였으며 조골세포에 대한 증식 효과는 미약하였다. 소리쟁이의 ethly acetate 분획물은 세포 독성 없이 농도 의존적으로 ALP의 활성을 촉진하는 경향을 나타내었다.
- 소리쟁이의 ethyl acetate 분획물은 0.1 µg/ml 이하의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았으며 특히 0.1 µg/ml에서는 세포 생존율이 유의하게 상승하였고 1 µg/ml에서는 세포 생존율이 다소 감소하였다.
- 양성 대조군으로 사용한 daidzein은 0.001~10 µg/ml 사이에서 농도 의존적으로 MG-63 세포의 ALP 활성을 증가시켰고 10 µg/ml의 농도에서 184.6% 의 ALP 활성 증가효과를 나타내었다(Fig. 3A).
- 22) 소리쟁이의 ethanol 추출물은 조골세포의 생존을 높이고 분화 과정 전반에 걸쳐 anabolic effect를 갖는 것으로 사료되며, ethly acetate 분획을 통해 얻은 성분은 세포 생존에는 영향을 미치지 않으나 초기 분화 단계를 촉진하는 것으로 판단된다. 이러한 결과를 고려하여 볼 때 소리쟁이 뿌리성분은 조골세포의 증식과 분화에 관여하는 우수한 소재로 골다공증 예방 및 치료제로서의 개발 가능성을 가진 천연물 소재로 평가되며, 현재는 소리쟁이 추출물을 column으로 분리 후 얻어진 개별 물질의 조골세포 분화에 대한 활성을 확인하고 있다.
- 1B). 이를 검량선에 대입 후 환산한 결과, 소리쟁이 추출물의 주요 구성당은 sucrose 148.9 mg, Glc 45 mg, fructose 43.7 mg, mannitol 2.2 mg이 각각 존재하는 것을 확인하였다.
- 특히, 0.1 µg/ml의 농도에서는 181.7%의 ALP 활성 증가효과를 나타내어 양성 대조군인 daidzein과 유사한 활성을 가짐을 확인하였다(Fig. 3B).
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