[논문]무측지성 국화 형질전환 계통 영양번식 제2세대의 형태적 및 분자생물학적 특성

이수영; 김정호; 천경성; 이은경; 김원희; 권오현; 이혜진

doi:10.5010/jpb.2013.40.4.192

무측지성 국화 형질전환 계통 영양번식 제2세대의 형태적 및 분자생물학적 특성
Phenotypic and molecular characteristics of second clone (T0V2) plants of the LeLs-antisense gene-transgenic chrysanthemum line exhibiting non-branching 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.40 no.4, 2013년, pp.192 - 197

이수영 (국립원예특작과학원) , 김정호 (국립원예특작과학원) , 천경성 (국립원예특작과학원) , 이은경 (국립원예특작과학원) , 김원희 (국립원예특작과학원) , 권오현 (국립원예특작과학원) , 이혜진 (국립원예특작과학원)

초록
AI-Helper

환경위해성평가 연구 대상인 형질전환 이벤트로서의 자격을 확인하고자 형질전환세대($T_0V_0$)에서와 같이 영양번식 제1세대($T_0V_1$)에서도 도입유전자 LeLs-antisense의 발현 특성인 무측지성을 유지한 국화 무측지성 형질전환계통 LeLs80의 영양번식 제2세대($T_0V_2$)의 형태적 및 분자 생물학적 특성을 조사하였다. LeLs80 계통의 $T_0V_2$에서도 LeLs-antisense 유전자의 발현 특성인 무측지성이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, Southern 및 Northern 분석에 의해 LeLs-antisense 유전자가 3 copy 도입되었으며, LeLs-antisense 유전자의 전사체가 정상적으로 발현되는 것도 확인할 수 있었다. 또한 flanking T-DNA sequencing method를 이용하여 LeLs-antisense 유전자의 주변 염기서열 분석 통해 LeLs80 계통의 genome내 LeLs-antisense 유전자 주변에 186 ~ 464 bp의 pCAMBIA2300 T-DNA right border 부근으로 추정되는 염기서열이 확인되었고, pCAMBIA2300 전 염기서열과의 비교 분석한 결과, pCAMBIA2300 T-DNA left border와 right border내 선발마커 유전자 NPT II의 발현 promoter 부분과 LeLs-antisense 유전자 발현 terminator 일부 염기서열과 일치하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study examined the phenotypic and molecular characteristics of the $2^{nd}$ clone ($T_0V_2$) plants of LeLs-antisense gene-transgenic chrysanthemum line (LeLs80) that exhibited non-branching, proving the relevance of these characteristics as a factor for use in environmental risk assessment. Results of the Southern blot analysis showed that three copies of the LeLs-antisense gene were introduced into the transgenic line, and northern analysis showed that the transcripted gene was normally expressed in the transgenic line. A flanking T-DNA sequencing method was used to determine that sequences of 184 and 464 bps flanked the LeLs-antisense gene in the transgenic line. These sequences, respectively, matched the 35S promoter for expression of the npt II gene and the NOS terminator for expression of the LeLs-antisense gene within the pCAMBIA 2300 vector.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

또한 Southern 분석 및 Northern 분석을 통하여 도입유전자의 도입 및 발현을 확인하였고, 더욱이 도입 목표 유전자의 주변 염기서열도 분석하였다. PCR전의 처리 제한효소의 종류를 늘리는 등과 같이 도입유전자 주변 염기서열 분석에 대한 보완이 필요하긴 하지만 도입 유전자 주변 염기서열 분석을 통하여 형질전환체의 genome 상에서 도입 목표유전자 이외의 T-DNA단편이 삽입되었는지를 확인한 국화 형질전환체 개발 연구 보고로서는 본 연구가 최초일 것이다. 이상의 연구결과로서 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80은 환경위해성평가 연구로 진행될 수 있는 이벤트로서의 자격조건이 증명되었다고 할 수 있다.
2013). 이에 본 연구에서는 형질전환 세대(T₀V₀)에서와 같이 영양번식 제1세대(T₀V₁)에서도 무측지성 특성을 유지한 국화 무측지성 형질전환 계통 LeLs80의 영양번식 제2세대((T₀V₂)에서의 형태적 특성을 조사하고, T₀V₀에서 확인하지 못했던 분자생물학적 특성을 분석하여 환경위해성평가 연구 대상인 형질전환 이벤트로서의 자격을 확인하고자 하였다.

제안 방법

두 번째 PCR 증폭산물은 1% agarose gel 전기영동으로 확인하였으며, 특이 밴드는 HiYeildTM Gel/PCR DNA Extraction Kit (Biocompare Co. USA)을 이용하여 정제한 후 LB2 또는 RB2 primer를 이용하여 ABI7300XL로 염기서열을 분석하였다.
UK)에 capillary transfer 방법으로 blotting 하였다. 30 ng의 LeLs-antisense 유전자로부터 증폭시킨 PCR 산물 DNA를 RedyprimeIITM Random Prime labeling System (GEhealthcare Co. UK)을 이용하여 labeling하여 탐침으로 사용하였다. Hybridization과 blot 세척 및 표지인식은 Southern 분석 방법과 동일하게 수행하였다.
, USA)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 기내에서 성장한 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80의 T₀V₂ 식물체와 대조식물체 잎에서 추출하였다. 50 ug의 genomic DNA를 EcoRI 100 unit로 처리한 후 TBE buffer (45 mM Tris-borate, 45 mM boric acid, 1 mM EDTA (pH 8.0)가 포함된 1.0% agarose gel상에서 17시간 동안 전기영동하였다. Upward capillary 방식을 이용하여 agarose gel상에 전개된 DNA단편들을 nylon membrane (Hybond^TM-N+, GEhealthcare Co.
Flanking T-DNA sequencing법(Fig. 1)을 이용하여 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80의 T₀V₂ 식물체 genome내 LeLs-antisense 유전자 주변의 염기서열을 분석하였다. Southern 분석과 같은 방법으로 추출한 genomic DNA 500 ng을 제한효소 MspⅠ 2 U, HaeⅢ 2 U, T4 DNA ligase (Takara, Japan) 5 U, adaptor 50 pmol 등과 섞어 만든 반응 용액 20 μL를 37 ℃에서 1시간 처리하였다.
Genomic DNA는 DNeasy plant mini kit (Qiagen Co., USA)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 기내에서 성장한 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80의 T₀V₂ 식물체와 대조식물체 잎에서 추출하였다. 50 ug의 genomic DNA를 EcoRI 100 unit로 처리한 후 TBE buffer (45 mM Tris-borate, 45 mM boric acid, 1 mM EDTA (pH 8.
UK)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 [α32P] dCTP로 표지하였다. Membrane을 65℃에서 2X SSC, 0.1% SDS용액으로 10분, 1X SSC, 0.1% SDS용액으로 15분간 세척한 후, 다시 상온에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 용액으로 5씩 2회, 0.2X SSC용액으로 5분간 세척한 후 표지 인식을 위해서 Bio-Imaging analyzer (BAS-1800II, FUJIFILM Co. Japan)를 이용하여 확인하였다.
USA)을 이용하여 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80 T₀V₂ 식물체와 대조 식물체 잎으로부터 추출하였다. RNA농도는 NanoVue (GE healthcare Co. UK)로 측정하였고, 30 ug의 RNA를 1X MOPS buffer와 6.3% (w/v) formaldehyde가 포함된 1% (w/v) agarose gel에서 100 V로 1시간 전개시킨 후, nylon Hybond^TM-N+ membrane(GEhealthcare Co. UK)에 capillary transfer 방법으로 blotting 하였다. 30 ng의 LeLs-antisense 유전자로부터 증폭시킨 PCR 산물 DNA를 RedyprimeIITM Random Prime labeling System (GEhealthcare Co.
Southern 분석과 같은 방법으로 추출한 genomic DNA 500 ng을 제한효소 MspⅠ 2 U, HaeⅢ 2 U, T4 DNA ligase (Takara, Japan) 5 U, adaptor 50 pmol 등과 섞어 만든 반응 용액 20 μL를 37 ℃에서 1시간 처리하였다.
0% agarose gel상에서 17시간 동안 전기영동하였다. Upward capillary 방식을 이용하여 agarose gel상에 전개된 DNA단편들을 nylon membrane (Hybond^TM-N+, GEhealthcare Co. UK)으로 전이시키기 위해 전기영동 된 agarose gel을 0.2N HCl 10분, 변성화 용액 45분, 중성화 용액 30분 처리하였다. 전이가 완료된 후, UV-cross linker (CL-1000, UVP Co.
두 번째는 첫 번째 PCR반응 용액 5 μL에 Ada2과 LB2 또는 RB2 primers 0.5 pmol을 섞어 20 μL로 만들어 94℃ 5분 1회, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분 40회, 72℃ 10분 실시하였다.
본 연구에서는 형질전환세대(T₀V₀)에 이어 T₀V₁에서도 토마토 유래측지발생관련 유전자의 역방향 도입을 통해 무측지성을 보인 국화 LeLs80 계통이 T₀V₂에서도 도입유전자의 특성발현이 안정적임을 확인하였다. 또한 Southern 분석 및 Northern 분석을 통하여 도입유전자의 도입 및 발현을 확인하였고, 더욱이 도입 목표 유전자의 주변 염기서열도 분석하였다. PCR전의 처리 제한효소의 종류를 늘리는 등과 같이 도입유전자 주변 염기서열 분석에 대한 보완이 필요하긴 하지만 도입 유전자 주변 염기서열 분석을 통하여 형질전환체의 genome 상에서 도입 목표유전자 이외의 T-DNA단편이 삽입되었는지를 확인한 국화 형질전환체 개발 연구 보고로서는 본 연구가 최초일 것이다.
무가온 유리 온실에서 월동된 무측지성 형질전환 계통 LeLs80의 T₀V₁ 식물체로부터 삽수를 채취하여 2011년 7월 13일에 삽목한 후 8월 10일 토양에 정식하였고, 자연 조건으로 재배한 후 2011년 8월 10일에 초장 및 측지수 등 형태적 특성을 10개체씩 2반복 조사하였다.
Southern 분석과 같은 방법으로 추출한 genomic DNA 500 ng을 제한효소 MspⅠ 2 U, HaeⅢ 2 U, T4 DNA ligase (Takara, Japan) 5 U, adaptor 50 pmol 등과 섞어 만든 반응 용액 20 μL를 37 ℃에서 1시간 처리하였다. 반응 용액에 T-DNA와 adapter 특이 primer를 섞어 PTC-200 thermal cycler (MJ research, USA)을 이용하여 PCR 반응을 두 번에 걸쳐 실시하였다. 첫 번째는 위의 반응 용액 1 μL에 Ada1 과 LB1 또는 RB1 primers 0.
Ada1은 5’-GCGTAATACGACTCACTATAGCAATTAACC-3’, Ada2는 5’-GACTCACTATAGCAATTAAC-3’, LB1은 5’-GCCCGTCACCGAGATTTGACTCGA-3’, RB1은 5’-GCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCG-3’, LB2는 5’-AAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGT-3’, RB2는 5’-GTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’이다. 이후 pCAMBIA2300 전 염기서열과의 비교 분석은 Main workbench (CLCbio Co. Denmark) 프로그램을 이용하였다.
2N HCl 10분, 변성화 용액 45분, 중성화 용액 30분 처리하였다. 전이가 완료된 후, UV-cross linker (CL-1000, UVP Co. USA)를 이용한 1,200 mJ/cm2의 UV 조사를 통해 DNA 단편들이 membrane에 고정되도록 하였다. 65℃에서 12시간 pre-hybridization 후 탐침 DNA와 65℃에서 18 ~ 20시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다.
첫 번째는 위의 반응 용액 1 μL에 Ada1 과 LB1 또는 RB1 primers 0.5 pmol을 섞어 20 μL로 만들어 95℃ 5분 1회, 94℃ 30초와 72℃ 1분 20회, 72℃ 10분 1회 실시하였다.
환경위해성평가 연구 대상인 형질전환 이벤트로서의 자격을 확인하고자 형질전환세대(T₀V₀)에서와 같이 영양번식 제1세대(T₀V₁)에서도 도입유전자 LeLs-antisense의 발현 특성인 무측지성을 유지한 국화 무측지성 형질전환 계통 LeLs80의 영양번식 제2세대(T₀V₂)의 형태적 및 분자생물학적 특성을 조사하였다. LeLs80 계통의 T₀V₂에서도 LeLs-antisense 유전자의 발현 특성인 무측지성이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.

대상 데이터

토마토유래 측아발생 유전자(Genebank accession No. 001247250)가 pCAMBIA2300벡터에 역방향으로 삽입되어 있는 Agrobacterium tumefaciens C58C1균주 감염을 통해 국화 ‘신마’로 도입되어 무측지성을 보이는 형질전환 계통 LeLs80의 T0V2 식물체를 사용하였다.

이론/모형

탐침 DNA는 RediprimeTMII labeling system(GEhealthcare Co. UK)을 이용하여 제조회사의 지침에 따라 [α32P] dCTP로 표지하였다.

성능/효과

Flanking T-DNA sequencing법에 의해 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80에서 도입 목표 유전자 주변의 염기서열을 분석하기 위해 추출한 genomic DNA에 제한효소 처리와 두 번의 PCR 수행 후 전기영동에 의해 증폭산물을 확인한 결과, T-DNA의 left border쪽의 경우 비형질전환체와 차이가 없었던 반면 T-DNA의 right border쪽에서는 비형질전환체와 차이를 보였다. 이는 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLS80 genome상에서 T-DNA LB border 전후의 염기서열이 확인되지 않음을 증명하는 결과라고 할 수 있다.
)의 형태적 및 분자생물학적 특성을 조사하였다. LeLs80 계통의 T₀V₂에서도 LeLs-antisense 유전자의 발현 특성인 무측지성이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, Southern 및 Northern 분석에 의해 LeLs-antisense 유전자가 3 copy 도입되었으며, LeLs-antisense 유전자의 전사체가 정상적으로 발현되는 것도 확인할 수 있었다.
또한, Southern 및 Northern 분석에 의해 LeLs-antisense 유전자가 3 copy 도입되었으며, LeLs-antisense 유전자의 전사체가 정상적으로 발현되는 것도 확인할 수 있었다. 또한 flanking T-DNA sequencing method를 이용하여 LeLs-antisense 유전자의 주변 염기서열 분석 통해 LeLs80 계통의 genome내 LeLs-antisense 유전자 주변에 186 ~ 464 bp의 pCAMBIA2300 T-DNA right border 부근으로 추정되는 염기서열이 확인되었고, pCAMBIA2300전 염기서열과의 비교 분석한 결과, pCAMBIA2300 T-DNA left border와 right border내 선발마커 유전자 NPTⅡ의 발현 promoter 부분과 LeLs-antisense 유전자 발현 terminator 일부 염기서열과 일치하였다.
LeLs80 계통의 T₀V₂에서도 LeLs-antisense 유전자의 발현 특성인 무측지성이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, Southern 및 Northern 분석에 의해 LeLs-antisense 유전자가 3 copy 도입되었으며, LeLs-antisense 유전자의 전사체가 정상적으로 발현되는 것도 확인할 수 있었다. 또한 flanking T-DNA sequencing method를 이용하여 LeLs-antisense 유전자의 주변 염기서열 분석 통해 LeLs80 계통의 genome내 LeLs-antisense 유전자 주변에 186 ~ 464 bp의 pCAMBIA2300 T-DNA right border 부근으로 추정되는 염기서열이 확인되었고, pCAMBIA2300전 염기서열과의 비교 분석한 결과, pCAMBIA2300 T-DNA left border와 right border내 선발마커 유전자 NPTⅡ의 발현 promoter 부분과 LeLs-antisense 유전자 발현 terminator 일부 염기서열과 일치하였다.
화훼류 형질전환체가 상업화되기 위해 반드시 수행되어야 하는 독성, 잡초화 가능성, 교잡화합성 등의 환경위해성평가 연구는 적지 않은 연구비가 지원돼야 하므로 도입유전자의 분자생물학적 분석이 완료되어야 하고 유전자 발현 특성이 안정적이어야만 한다. 본 연구에서는 형질전환세대(T₀V₀)에 이어 T₀V₁에서도 토마토 유래측지발생관련 유전자의 역방향 도입을 통해 무측지성을 보인 국화 LeLs80 계통이 T₀V₂에서도 도입유전자의 특성발현이 안정적임을 확인하였다. 또한 Southern 분석 및 Northern 분석을 통하여 도입유전자의 도입 및 발현을 확인하였고, 더욱이 도입 목표 유전자의 주변 염기서열도 분석하였다.
2013) LeLs80계통이 T₀V₂ 식물체에서도 도입유전자의 발현 특성의 안정성을 조사하였다. 비형질전환체의 무측지율은 4.9%이었던 것에 비해 LeLs80계통의 무측지율은 42.9%이었다(Table 1). 이것은 비형질전환체에 비하여 무측지성이 38% 증진된 것이고, T₀V₁ 식물체에서의 무측지율 45.
1%와 같은 특성을 보인 것이다. 이것으로 볼 때 LeLs-antisense유전자가 LeLs80 계통의 genome상에서 안정적으로 삽입되어 있고, 그 특성도 안정적으로 발현하고 있음을 확인할 수 있었다. 더욱이 LeLs80계통의 T₀V₂식물체의 무측지율 42.
4). 이들 증폭밴드들을 분리하여 염기서열을 분석한 결과, 도입 목표유전자 주변에서 186 bp 및 464 bp의 pCAMBIA2300 T-DNA right border 부근으로 추정된 염기서열이 확인되었고, pCAMBIA2300 전 염기서열과의 비교 분석한 결과, pCAMBIA2300 T-DNA 영역내 left border와 right border 사이의 선발마커 유전자 NPTⅡ의 발현 promoter와 LeLs-antisense 유전자 발현 terminator 염기서열의 일부와 일치하였다(Table 2, Fig. 5).
PCR전의 처리 제한효소의 종류를 늘리는 등과 같이 도입유전자 주변 염기서열 분석에 대한 보완이 필요하긴 하지만 도입 유전자 주변 염기서열 분석을 통하여 형질전환체의 genome 상에서 도입 목표유전자 이외의 T-DNA단편이 삽입되었는지를 확인한 국화 형질전환체 개발 연구 보고로서는 본 연구가 최초일 것이다. 이상의 연구결과로서 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80은 환경위해성평가 연구로 진행될 수 있는 이벤트로서의 자격조건이 증명되었다고 할 수 있다. 향후 연구비 지원에 의해 환경위해성평가 연구가 진행되고, 또 환경위해성 심사를 통과할 수 있을 정도의 결과가 얻어진다면 본 연구를 통해 얻어진 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80은 형질전환 계통 자체의 품종화뿐 아니라 앞으로 국화를 포함하여 국내 고부가가치성 화훼류 형질전환체 품종개발의 근간이 될 수 있을 것으로 판단된다.
7% 보다도 훨씬 증진된 것이다. 형질전환 세대에서 확인하지 못했던 LeLs80계통내 목표유전자 도입 copy수를 T₀V₂식물체에서 확인하기 위해 Southern 분석을 수행한 결과, LeLs-antisense 유전자가 3 copy 도입되었음을 확인할 수 있었고(Fig. 2), Northern 분석을 실시한 결과, LeLs-antisense 유전자의 전사체 또한 정상적으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

후속연구

이상의 연구결과로서 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80은 환경위해성평가 연구로 진행될 수 있는 이벤트로서의 자격조건이 증명되었다고 할 수 있다. 향후 연구비 지원에 의해 환경위해성평가 연구가 진행되고, 또 환경위해성 심사를 통과할 수 있을 정도의 결과가 얻어진다면 본 연구를 통해 얻어진 무측지성 국화 형질전환 계통 LeLs80은 형질전환 계통 자체의 품종화뿐 아니라 앞으로 국화를 포함하여 국내 고부가가치성 화훼류 형질전환체 품종개발의 근간이 될 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	국화를 포함한 화훼작물의 신품종 육종의 주요 기술은?	스탠다드형 절화 국화에 있어서 무측지성은 농가 경영비를 절감시킬 수 있는 특성으로 절화용 신품종 개발의 중요한 육종 목표이다. 국화를 포함한 화훼작물의 신품종 육종의 주요 기술인 교잡육종 기술을 이용하여 국립원예특작과학원에서도 1999년과 2000년에 무측지성 특성을 가진 ‘금오’ 및 ‘용마’ 품종을 개발한 바 있으나 대중적인 인기를 얻지 못하였고, 이후에는 현재까지 무측지성 품종이 개발된 바 없다. 이는 국화 같은 영양번식성 작물에 있어서 신품종을 육성하기 위하여 교잡육종기술을 적용 할 경우 교잡후대로 전이되기를 원하는 교배모본의 특성만을 전이시키는 것이 거의 불가능하기 때문이다.
	교잡육종 기술의 단점은 무엇인가?	국화를 포함한 화훼작물의 신품종 육종의 주요 기술인 교잡육종 기술을 이용하여 국립원예특작과학원에서도 1999년과 2000년에 무측지성 특성을 가진 ‘금오’ 및 ‘용마’ 품종을 개발한 바 있으나 대중적인 인기를 얻지 못하였고, 이후에는 현재까지 무측지성 품종이 개발된 바 없다. 이는 국화 같은 영양번식성 작물에 있어서 신품종을 육성하기 위하여 교잡육종기술을 적용 할 경우 교잡후대로 전이되기를 원하는 교배모본의 특성만을 전이시키는 것이 거의 불가능하기 때문이다. 이러한 교잡육종 기술의 단점을 보완할 수 있는 기술인 형질전환 기술을 이용하여 기존 품종의 특성이 보완된 새로운 품종을 개발하고자 하는 노력들이 이루어지고 있다.
	스탠다드형 절화 국화에 있어서 무측지성이란 무엇인가?	스탠다드형 절화 국화에 있어서 무측지성은 농가 경영비를 절감시킬 수 있는 특성으로 절화용 신품종 개발의 중요한 육종 목표이다. 국화를 포함한 화훼작물의 신품종 육종의 주요 기술인 교잡육종 기술을 이용하여 국립원예특작과학원에서도 1999년과 2000년에 무측지성 특성을 가진 ‘금오’ 및 ‘용마’ 품종을 개발한 바 있으나 대중적인 인기를 얻지 못하였고, 이후에는 현재까지 무측지성 품종이 개발된 바 없다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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