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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 접골목 추출물의 항산화활성 및 t-BHP로 유도한 산화스트레스로부터 세포 보호능을 검토하여 접골목의 항산화 소재 개발의 기초 자료를 얻고자 수행하였고 그 결과 몇 가지 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 특히 항염증 작용에 있어서 TNF-α의 생성을 억제하고 염증효소인 COX-2 작용을 차단하는 작용이 있다는 전 연구 결과에 따라 본 연구에서는 다양한 약리학적 활성을 가진 것으로 알려진 접골목의 산화적 스트레스에 의한 간 손상 보호효과를 알아보기 위하여 접골목 추출물의 항산화 활성 및 간세포 보호 효과를 측정 하였다.
제안 방법
- 1 mL의 차가운 PBS로 세척하고 원심분리한 후, 300 μL의 PBS를 첨가하여 FACS Calibur flow cytometer (Becton & Dickinson Co., USA) 를 이용하여 MMP의 변화 정도를 분석하였다.
- 활성산소와 반응하여 형광을 발산하는 2‘,7’-di-chlorofluorescein diacetate (DCF-DA)를 이용하여 세포내에서 발생되는 활성산소의 양을 Fluorospectrometer (SpectraMax M2/M2e, CA, USA)를 이용하여 (excitation, 485 nm; emission, 538 nm) 로 측정하였다. 96 well black plate에 2 x 104개의 Chang 세포를 분주한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, 여러 가지 농도의 시료를 한 시간 전처리 하였다. 200 μM t-BHP를 30분 처리한 다음 DCF-DA를 최종농도 10 μM이 되도록 넣고 37℃에서 30분간 더 배양하고 PBS로 3회 세척한 후 측정하였다.
- ABTS 라디칼을 이용한 항산화능의 측정은 potassium persulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS 유리 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Re 등16)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.
- 3 mL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40 분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin (Sigma Co.)을 표준물질로 하여 0～1 mg/mL의 농도 범위에서 얻어진 표준 곡선으로부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
- Fluorescent 표준용액은 Ou 등18)의 방법을 약간 변형하여 fluorescein sodium salt (Sigma-Aldrich Co.)를 75 mM phosphate buffer에가하여 7.8 μM 농도로 제조하였다.
- Gallic acid를 0-200μg/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 곡선으로부터 시료 추출물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였고 gallic acid equivalents (mg GAE/g extract)로 나타내었다.
- t-BHP로 유도한 산화스트레스로부터 접골목 추출물의 간세포 보호능에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Chang 세포에 여러 가지 농도의 접골목 추출물 (0.05, 0.1, 0.2 mg/mL)을 한 시간 전 처리하고 100 uM t-BHP를 24시간 처리한 후 생존율을 비교 하였다. Fig 2와 같이 접골목을 처리하지 않고 t-BHP만 처리했을 때의 세포생존율이 60 %인 것과 비교하였을 때 접골목 추출물 처리군은 농도의존적으로 세포생존율이 증가하는 경향을 나타내었다.
- t-BHP에 의한 산화적 손상에 대한 접골목 추출물의 세포보호 효과를 관찰하기 위하여, Chang 세포를 48-well plates에 7×103 cells/mL 농도로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후, 각 시료를 최종 농도(0, 0.05, 0.1, 0.2 mg/mL)가 되도록 세포에 한 시간 전처리 한 후 t-BHP(최종농도 100 μM)를 첨가하고 24 시간 더 배양하였다.
- 우선 세포 독성 측정은 Chang 세포를 48-well plates에 7×103 cells/well 농도로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후, 각 시료를 최종 농도(0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 mg/mL)가 되도록 세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다.
- 2 mg/mL)가 되도록 세포에 한 시간 전처리 한 후 t-BHP(최종농도 100 μM)를 첨가하고 24 시간 더 배양하였다. 이 후 MTT assay로 세포의 생존율을 측정하였다. 대조군으로는 간질환 치료보조제로 사용하고 있는 실리마린을 사용하였다.
- 접골목 추출물의 항산화 활성을 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율로 측정하였다. 과산화 라디칼의 생성을 위해 2,2’- azobis (2-methylpropionamidine) dihychloride (AAPH)를 사용하였고, 항산화 활성 비교 표준액으로 20 uM Trolox를 사용하였다.
- 특히 항염증 작용에 있어서 TNF-α의 생성을 억제하고 염증효소인 COX-2 작용을 차단하는 작용이 있다는 전 연구 결과에 따라 본 연구에서는 다양한 약리학적 활성을 가진 것으로 알려진 접골목의 산화적 스트레스에 의한 간 손상 보호효과를 알아보기 위하여 접골목 추출물의 항산화 활성 및 간세포 보호 효과를 측정 하였다. 접골목 추출물의 항산화 활성을 탐색하고자 접골목 추출물에 포함된 총폴리페놀 함량, 총플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, ABTS를 이용한 라디칼 소거활성, FRAP을 이용한 총항산화능및 ORAC을 측정하였다.
- 정상 간세포(human liver cells, Chang)를 불활성화한 10% fetal bovine serum (FBS)과 1.0% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- 즉, 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ 및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법13)을 약간 변형하여, 시료 1.0 mL에 1.0 N Folin-Ciocalteau 시약 및 20% Na2CO3 용액을 각 1.0 mL씩 차례로 가하여 잘 섞어주고 실온에서 30 분 반응시킨 후 microplate reader (BioTek, Winooski, USA)를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 0-200μg/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 곡선으로부터 시료 추출물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였고 gallic acid equivalents (mg GAE/g extract)로 나타내었다.
- 항산화 활성의 측정은 접골목 추출물과 표준용액 50 μL에 fluorescent 표준용액 50 μL를 가하고, 과산화 라디칼 유발물질인 AAPH를 인산완충액에 가해 221 mM로 희석한 후 25 μL를 가하여 반응시킨 후, spectrofluorometer (SpectraMax M2/M2e, CA, USA)를 사용하여 excitation 485 nm, emission 538 nm 에서 2시간 동안 5분마다 형광을 측정하였다.
- 활성산소와 반응하여 형광을 발산하는 2‘,7’-di-chlorofluorescein diacetate (DCF-DA)를 이용하여 세포내에서 발생되는 활성산소의 양을 Fluorospectrometer (SpectraMax M2/M2e, CA, USA)를 이용하여 (excitation, 485 nm; emission, 538 nm) 로 측정하였다.
대상 데이터
- Folin-Ciocalteu’s reagent, Ferrous chloride, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), tert-butyl hydroperoxide (t-BHP), 2,4,6-tripyridyl-S-triazine (TPTZ), 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), potassium persulfate, silymarin은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였으며, 그 외에 사용된 시약은 특급 및 일급을 구입하여 사용하였다.
- 과산화 라디칼의 생성을 위해 2,2’- azobis (2-methylpropionamidine) dihychloride (AAPH)를 사용하였고, 항산화 활성 비교 표준액으로 20 uM Trolox를 사용하였다.
- 이 후 MTT assay로 세포의 생존율을 측정하였다. 대조군으로는 간질환 치료보조제로 사용하고 있는 실리마린을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 접골목은 경상북도 영천이 원산지로 한약재시장에서 구입하였으며, 접골목의 줄기 및 잔가지를 세절하여 사용하였다. Folin-Ciocalteu’s reagent, Ferrous chloride, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), tert-butyl hydroperoxide (t-BHP), 2,4,6-tripyridyl-S-triazine (TPTZ), 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), potassium persulfate, silymarin은 Sigma Chemical Co.
데이터처리
- Data were represented as mean ± S.D (n=4) with One Way ANOVA followed by Tukey’s test.
- 각 군 간의 유의성의 검증은 GraphPad Prism 5.0 version을 이용하여 One-way ANOVA 중 Tukey test 로 검증하여 p값이 0.05 미만을 유의한 것으로 간주 하였다.
이론/모형
- 세포 독성 및 간세포 보호 효과는 MTT colorimatric assay로 세포의 생존율을 측정하였다. 우선 세포 독성 측정은 Chang 세포를 48-well plates에 7×103 cells/well 농도로 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후, 각 시료를 최종 농도(0, 0.
성능/효과
- 018 mM FeSO4 eq./mg extract로 높은 항산화 활성을 보였으며, 양성 대조군으로 사용한 BHT 보다는 낮은 활성을 나타내었다 (Table 2). 기존 연구에 의하면 식물로부터 추출된 페놀류의 화합물은 페놀함량이 높을수록 항산화력이 증가한다고 보고하였는데, 접골목 추출물은 높은 항산화 활성은 보였으나 절대적 페놀 함량에 있어서는 우수한 항산화력을 나타낸 다른 식물 추출물보다 적게 함유하고 있기 때문인 것으로 사료된다.
- ABTS 라디칼 소거능의 측정방법은 녹색을 띠는 양이온 ABTS+ 가 항산화 물질에 의해 제거되면 특유의 색깔인 청록색으로 변화되는 원리를 이용한 것이고, FRAP 방법은 직접적으로 자유라디칼을 소거하지 않고 산성 pH에서 환원제에 의하여 전환되는 과정을 이용하여 간접적으로 항산화능을 측정하는 것으로, 본 실험에서 ABTS를 이용한 라디칼 소거활성, FRAP을 이용한 총항산화능 측정을 통한 항산화 활성을 평가한 결과에서도 접골목 추출물이 항산화 효과를 가지고 있음이 확인되었다.
- Chang 세포에 200 μM t-BHP 처리하였을 때의 활성산소종은 t-BHP를 처리하지 않은 control군에 비해 270%를 증가를 나타내었지만, 접골목 추출물을 전 처리한 경우 농도 의존적으로 세포내 활성산소종 수준이 감소하는 것을 확인하였다.
- 2 mg/mL)을 한 시간 전 처리하고 100 uM t-BHP를 24시간 처리한 후 생존율을 비교 하였다. Fig 2와 같이 접골목을 처리하지 않고 t-BHP만 처리했을 때의 세포생존율이 60 %인 것과 비교하였을 때 접골목 추출물 처리군은 농도의존적으로 세포생존율이 증가하는 경향을 나타내었다.
- Gallic acid를 표준물질로 하여 총폴리페놀 함량을 분석한 결과 1.0 g의 접골목 추출물은 33.23 ± 0.23 mg GAE의 함량을 나타내었다.
- MTT assay법을 이용하여 접골목 추출물만을 농도별로 처리한 후 24시간 후의 세포 생존율을 측정한 결과 0.2 mg/mL의 농도 이하에서는 세포의 생존율이 95% 이상으로 세포독성을 나타내지 않았다 (Fig. 2).
- Trolox를 표준물질로 사용하여 AAPH에 의해 생성된 peroxyl radical에 대한 소거활성을 형광도로 측정하였으며, 접골목 추출물 1.0 mg/mL의 농도의 ORAC은 114.57 ± 0.64 μM TE 이었으며, 양성 대조군으로 사용한 BHT 1.0 g/mL의 농도의 ORAC은 20.48 ±4.51 μM TE로 나타나, 접골목 추출물의 peroxyl radical 소거활성이 BHT에 비해 월등히 높았다 (Table 2).
- 산화 스트레스를 처리하지 않은 정상군은 정상적인 MMP를 가진 세포는 약 93 %, 손상된 MMP 를 가진 세포는 약 7 %로 나타났지만, t-BHP로 산화스트레스를 주었을 때는 손상된 MMP를 가진 세포가 32 %까지 증가하였다. 그러나 접골목 추출물 (0.05, 0.1, 0.2 mg/mL)을 한 시간 전처리 했을 때는 손상된 MMP를 가진 세포가 각각 28, 22와 20 %로나타났으며, 농도 의존적으로 MMP 손상이 억제되는 경향을 확인하였다. 접골목 추출물 0.
- 3). 따라서 t-BHP 처리로 인해 증가하는 세포내 활성산소종을 접골목 추출물이 효과적으로 감소시킴으로써 간세포 보호 효과를 나타내는 것으로 판단된다. Kim 등22)은 t-BHP로 발생한 세포내 산화스트레스 증가를 돼지감자잎 추출물이 억제하여 세포보호를 나타낸다고 보고 하였으며, 본 연구의 결과에서도 세포내 활성산소종을 접골목 추출물이 효과적으로 감소시킴으로써 간세포 보호 효과를 나타내는 것과 비슷한 경향을 나타내었다.
- 또한 세포 독성을 살펴보기 위하여 정상 간세포 (human liver, Chang cells)를 이용하여 MTT assay를 수행한 결과, 세포의 생존율은 1.0 mg/mL의 농도까지는 전혀 독성을 나타내지 않았고, 간세포 보호 효능 실험에서는, t-BHP로 유도한 산화적 스트레스로 인해 생존율이 60%로 낮은 대조군과 비교할 때 접 골목 추출물을 한 시간 동안 전처리 한 샘플군은 농도의존적으로 생존율이 증가하였다. 세포내 활성산소종을 측정한 결과와 미토콘드리아 막 전위차를 측정한 결과에서도 접골목 추출물은 효과적으로 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다.
- 4와 같다. 산화 스트레스를 처리하지 않은 정상군은 정상적인 MMP를 가진 세포는 약 93 %, 손상된 MMP 를 가진 세포는 약 7 %로 나타났지만, t-BHP로 산화스트레스를 주었을 때는 손상된 MMP를 가진 세포가 32 %까지 증가하였다. 그러나 접골목 추출물 (0.
- 0 mg/mL의 농도까지는 전혀 독성을 나타내지 않았고, 간세포 보호 효능 실험에서는, t-BHP로 유도한 산화적 스트레스로 인해 생존율이 60%로 낮은 대조군과 비교할 때 접 골목 추출물을 한 시간 동안 전처리 한 샘플군은 농도의존적으로 생존율이 증가하였다. 세포내 활성산소종을 측정한 결과와 미토콘드리아 막 전위차를 측정한 결과에서도 접골목 추출물은 효과적으로 산화적 스트레스에 대한 간세포 보호 효과를 가지고 있는 것으로 나타났다.
- 2 mg/mL)을 한 시간 전처리 했을 때는 손상된 MMP를 가진 세포가 각각 28, 22와 20 %로나타났으며, 농도 의존적으로 MMP 손상이 억제되는 경향을 확인하였다. 접골목 추출물 0.2 mg/mL 의 농도를 처리하였을 때 대조군인 실리마린 (0.05 mg/mL)의 MMP 측정 결과를 비교하였을 때 비슷한 미토콘드리아 보호효과를 나타내었다. 이것은 접골목 추출물이 산화적 스트레스로 인한 미토콘드리아의 기능 손상을 효과적으로 보호하는 것으로 판단된다.
- 1과 같다. 접골목 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보였으며, 특히 0.125 mg/mL 농도까지 85%의 높은 라디칼 소거활성을 나타내었다.
- 특히 접골목 추출물 0.2 mg/mL 농도로 전처리 했을 때, t-BHP로 유도한 세포 손상으로부터 약 20% 정도 유의적으로 세포생존률이 증가함을 나타내었으며, 양성 대조군인 실리마린과 비슷한 생존율을 나타내었다. 이는 접골목 추출물이 인간 정상 간세포주인 Chang 세포에서 t-BHP로 유도한 산화 스트레스로부터 세포를 보호하고 있음을 보여주고 있다.
- 페놀성 물질은 항산화 작용 및 항염증 작용을 나타내므로 접골목 추출물의 총폴레페놀 함량과 총플라보노이드 함량을 측정하였는데, 접골목 추출물의 총폴리페놀 함량은 33.23 ± 0.23 mg GAE/g, 총플라보노이드 함량은 9.97 ± 1.38 mg CE/g으로 나타났다.
후속연구
- 이와 같은 실험 결과는 임상에서 만성적 근골격계 질환을 가지고 있는 환자에 대하여 장기 투여를 고려할 때 접골목을 선용할 수 있는 근거가 될수 있을 것으로 판단된다. 이상의 결과로 접골목을 기능성 소재로 활용할 때 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 판단되며 추후 분자생물학적 기전에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 이는 접골목 추출물이 가진 항산화 활성이 산화 스트레스로부터 증가된 세포내 활성산소종을 효과적으로 소거하고 있으며, 미토콘드리아의 손상을 억제하여 세포를 보호하는 것으로 사료된다. 이와 같은 실험 결과는 임상에서 만성적 근골격계 질환을 가지고 있는 환자에 대하여 장기 투여를 고려할 때 접골목을 선용할 수 있는 근거가 될수 있을 것으로 판단된다. 이상의 결과로 접골목을 기능성 소재로 활용할 때 기초자료로 활용할 수 있을 것으로 판단되며 추후 분자생물학적 기전에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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