[논문]RAW 264.7 세포에서 말오줌나무 추출물의 iNOS, COX-2 단백질 및 mRNA 발현 억제 효과

이진영; 유단희; 채정우

doi:10.4014/mbl.1704.04002

RAW 264.7 세포에서 말오줌나무 추출물의 iNOS, COX-2 단백질 및 mRNA 발현 억제 효과
Inhibitory Effect of Sambucus sieboldiana var. pendula (Nakai) Extract on the mRNA and Protein Expression of iNOS and COX-2 in Raw 264.7 Cells 원문보기

Microbiology and biotechnology letters = 한국미생물·생명공학회지, v.45 no.2, 2017년, pp.178 - 183

이진영 (호서대학교 화장품과학과) , 유단희 (호서대학교 화장품과학과) , 채정우 (경기도산림환경연구소)

초록
AI-Helper

본 연구는 새로운 기능성 화장품 소재를 개발하기 위해 천연물 재료인 말오줌나무 추출물 활용 가능성 연구하였다. 이 목적을 이루기 위하여, 말오줌나무의 세포독성효과를 MTT assay를 통해 확인한 결과, $500{\mu}g/ml$ 농도에서 100% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 항염증 활성을 효과적으로 확인하기 위하여, LPS로 유도된 대식세포 내 NO 생산을 억제하는 효과를 griess의 방법으로 조사하였다. 그 결과 NO의 생성이 말오줌나무 추출물의 농도 의존적으로 저해되었음을 확인하였다. 말오줌나무 추출물을 LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 전염증성 인자(iNOS, COX-2)들을 생성하여 측정하였다. 그 후, iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 측정하기 위해 50, 100, $500{\mu}g/ml$ 농도에서 western blot을 수행하였고, ${\beta}$-actin를 양성대조군으로 사용하였다. iNOS와 COX-2의 mRNA 발현 억제 효과를 측정하기 위해 50, 100, $500{\mu}g/ml$ 농도에서 RT-PCR을 수행하였고, 양성 대조군으로 GAPDH를 사용하였다. 결과적으로, western blot으로 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 측정한결과 $500{\mu}g/ml$ 농도에서 각각 31.2%, 54.7%의 감소 효과를 보였으며, iNOS, COX-2의 mRNA 발현 억제 효과를 RT-PCR로 측정한 결과 $500{\mu}g/ml$ 농도에서 각각 72.2%, 89% 정도로 감소하였다. 이러한 결과들을 통해 말오줌나무 추출물은 항염증 효과를 가진 천연물 소재로 활용 가능할 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study examined a new functional cosmetic material possessing application possibility of Sambucus sieboldiana var. pendula (Nakai) (SS) extract. For this, we analyzed the toxic effect of the SS extract on macrophages (RAW 264.7 cells) by performing MTT assay. Results of the MTT assay showed ${\geq}100%$ cell viability after treatment with $500{\mu}g/ml$ SS extract. To determine the anti-inflammatory activity of the SS extract, we examined its inhibitory effect on lipopolysaccharide (LPS)-induced NO production in RAW 264.7 cells by performing Griess assay. Result of the Griess assay showed that the SS extract inhibited LPS-induced NO production in a concentration-dependent manner. Next, we examined the effect of the SS extract on the production of proinflammatory factors inducible NOS (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. First, we determined the inhibitory effect of 50, 100, and $500{\mu}g/ml$ SS extract on iNOS and COX-2 protein expression by performing western blot analysis, with ${\beta}$-actin as a positive control. Results of western blotting showed that treatment with $500{\mu}g/ml$ SS extract decreased iNOS and COX-2 protein expression by 31.2% and 54.7%, respectively. Next, we determined the inhibitory effect of 50, 100, and $500{\mu}g/ml$ SS extract on iNOS and COX-2 mRNA expression by performing reverse transcription-polymerase chain reaction (PCR), with GAPDH as a positive control. Results of reverse transcription-PCR showed that treatment with $500{\mu}g/ml$ SS extract decreased the mRNA expression of iNOS and COX-2 by 72.2% and 89%, respectively. These results suggest that the SS extract is a highly valuable natural compound because of its functional components and anti-inflammatory activity.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

하지만 말오줌나무의 약용 효과에 대해서는 연구가 미비한 실정이다. 따라서 말오줌나무의 염증효과를 검증하고 염증관련 제품으로서 이용가능성을 확인하기 위하여 본 실험에서는 LPS로 처리한 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 말오줌나무 추출물의 항염증 효능을 연구하였다.

제안 방법

iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 PCR을 실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과 같다.
본 연구에서는 염증발현 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 측정하기 위해 western blot을 통해 실험하였다. 대식세포인 RAW 264.

대상 데이터

세포 배양 및 세포 독성 측정에 사용된 세포주는 대식세포인 RAW 264.7은 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)에서 구매하였으며, 세포 독성 측정에 사용된 haemacytometer(Marienfeld, Germany), 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구매하여 사용하였으며, dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Bioshop (Canada)에서 구매하였다. 항염증 측정에 사용된 시약인 lipopolysaccaride (LPS), griess regent 등은 Sigma Chemical Co.
실험에 사용된 말오줌나무 잎과 줄기는 울릉도에서 채취하였으며, 채취한 시료는 분쇄한 시료에 시료 중량의 10배 양의 70% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 침지한 후 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.

이론/모형

RAW 264.7 cell로부터 생성된 NO의 양은 Green 등의 방법[14]에 따라 griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂의 형태로 측정하였다. 6 well plate에 RAW 264.
세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[13]에 따라 측정하였다. RAW 264.

성능/효과

2와 같이 LPS 처리군은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 나타내었으며 말오줌나무 추출물을 처리한 군은 NO 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 1,000 μg/ml의 농도에서 29.0%의 저해율을 나타낸 것을 확인하였으며, RAW 264.7 세포에서 염증발현을 억제시키는 것에 말오줌나무 추출물이 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이 때, 세포의 종류나 환경에서도 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 β-actin을 positive control로 사용하였다. 그 결과 Fig. 3과 같이 말오줌나무 추출물을 50, 100, 500 μg/ml의 농도로 처리한 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2 단백질 발현양이 농도가 높아짐에 따라 억제됨을 확인하였으며, 500 μg/ml에서 각각 31%, 54%의 효과를 나타내었다. 또한 대조군인 비타민 C와 비교하였을 때 대조군보다 감소하는 것으로 보아 단백질 발현 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

후속연구

75% 억제시켰다. 본 연구결과에서 말오줌나무 추출물을 저농도로 처리하였을 때 iNOS 단백질의 발현이 소폭 억제된 것과 유사하다고 판단되며, 말오줌나무의 항염증 활성에 대하여 더 많은 연구가 진행된다면 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성이 높아질 것이라고 판단된다.

참고문헌 (18)

Heinzemann A, Daser A. 2002. Mouse models for the genetic dissection of atopy. Int. Arch. Allergy Immunol. 127: 170-180.

상세보기
Sung YY, Kim DS, Yang WK, Nho KJ, Seo HS, Kim YS, at al. 2012 Inhibitory effects of Drynaria fortunei extracts on house dust mite antigen-induced atopic dermatitis in NC/Nga mice. J. Ethnopharmacol. 144: 94-100.

상세보기
Shin JS, Park YM, Choi JH, Park HJ, Shin MC, Lee YS, at al. 2010. Sulfuretin isolated from heartwood of Rhus verniciflua inhibits LPS-induced inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, and pro-inflammatory cytokines expression via the down-regulation of NF- ${\kappa}B$ in RAW 264.7 murine macrophage cells. Int. Immunopharmacol. 10: 943-950.

상세보기
Funk CD. 2001. Prostaglandins and leukotrienes; Advances in eicosanoid biology. Science 294: 1871-1875.

상세보기
Miyake K. 2004. Innate recognition of lipopolysaccharide by Tolllike receptor 4-MD-2. Trends Microbiol. 12: 186-192.

상세보기
Shon DH, Choi DW, Kim MH. 2012. Improvement of anti-inflammation activity of Gardeniae fructus extract by the tratment of ${\beta}$ -Glucisudase. Korean J. Food Sci. Echnol. 44: 331-336.

원문보기 상세보기
Hippeli S, Elstner EF. 1999. Inhibition of biochemical model reactions for inflammatory processes by plant extracts: a review on recent developments. Free Radic. Res. 31: 81-87.

상세보기
McCartney-Francis N, Allen JB, Mizel DE, Albina JE, Xie QW, Nathan CF, at al. 1993. Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase. J. Exp. Med. 178: 749-754.

상세보기
Denizot F, Lang R. 1986. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J. Immunol. Methods. 89: 271-277.

상세보기
KNA (Korea National Arboretum). 2010. Folk plants in Korean peninsula VI, p. 275. Gyeongnam & Gyeongbuk province, Korean.
KNA (Korea National Arboretum). 2011. Folk plants in Korean peninsula VII, p. 321. Gyeonggi province, Korean.
Lee CB. 2006. Korea illustrated plant book II, pp. 227-228. Hyangmoonsa, Seoul, Korea.
Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell HB. 1987. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 47: 936-942.

상세보기
Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. 1982. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126: 131-138.

상세보기
Ukeda H, Maeda S, Ishii T, Sawamura M. 1997. Spectrophotometric assay for superoxide dismutase based on tetrazolium salt 3'-1-(phenylamino)-carbonyl-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzenesulfonic acid hydrate reduction by xanthine-xanthine oxidase. Anal. Biochem. 251: 206-209.

상세보기
Nathan C. 1992. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J. 6: 3051-3064.

상세보기
Masferrer JL, Zweifel BS, Manning PT, Hauser SD, Leahy KM, Smith WG, at al. 1994. Selective inhibition of inducible cyclooxygenase 2 in vivo is antiinflammatory and nonulcerogenic. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 3228-3232.

상세보기
Kim HJ, Lee DJ, Ku JJ, Choi K, Park KW, Kang SH, at al. 2013. Antiinflammatory effect of extracts from folk plants in Ulleung island. Korean J. Plant Res. 26: 169-177.

원문보기 상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증