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문제 정의
- 본 연구에서는 3T3-L1 전지방세포를 이용하여 발효 삼정환의 지방 분화 억제 효과를 확인하고자 하였다. 삼정환을 5가지 주요 유산균으로 각각 발효시킨 후, Oil Red O 염색법으로 지방세포 분화 억제 여부를 알아보고, 이의 기전을 알기 위해서 지방생성에 핵심적인 역할을 하는 transcription factor 및 지질 조절 효소의 유전자 발현량을 비교하여 보았다.
- 본 연구에서는 발효 삼정환의 지방 분화 억제 효과를 연구하기 위해서 삼정환을 5가지 주요 유산균으로 각각 발효시킨 후, 3T3-L1 전지방세포의 분화 억제 활성과 CCAAT/enhancer-binding protein α(C/EPBα), PPARγ, uncoupling protein(UCP)-2와 3-hydroxy-3 methylglutaryl coenzyme A(HMG-CoA) reductase의 유전자 발현 억제작용 등을 관찰하였다.
제안 방법
- 완전히 건조시킨 후 Oil red O 염색액을 처리하여 1시간 상온에서 염색하고, 염색액을 제거한 후 물로 여러 번 세척하였다. Microscope(Olympus BX61, Tokyo, Japan)로 관찰한 후, Olympus DP70 digital camera로 캡쳐하였다.
- PCR amplification은 C/EBPα에서는 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 50 cycle의 amplification(95℃에서 10초간 denaturation, 52oC에서 10초간 annealing, 72℃에서 15초간 extension) 하였고 GAPDH에서는 95oC에서 10분 동안 prior incubation 후, 35 cycle의 amplification(95oC에서 10초간 denaturation, 52oC에서 10초간 annealing, 72oC에서 15초간 extension) 하였다.
- RT-PCR 샘플은 LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green(Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA)을 이용하여 최종반응 용량을 20 μL로 하여LightCycler instrument(Roche Applied Science)에서 진행하였다.
- Resultant protein band의 강도는 densitometry로 측정하였고, 단백질의 정량은 β-actin을 참고로 하여 분석하였다.
- 각 약물로 처리된 세포를 PBS(pH 7.4) 용액으로 세척한 후, Trizol® reagent(Invitrogen)를 이용하여 total cellular RNA를 추출하였다.
- 데이터는 LightCycler Software(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)로 분석하였다. 각각의 분석에서 cDNA 대신 물을 음성 대조군으로 사용하여 발생 가능한 primer-dimer 형성을 체크하였다. 유전자의 전사레벨은 GAPDH를 기준으로 삼아 2-ΔCt(목표한 유전자의 threshold 값－GAPDH의 threshold 값)를 구하는 방식으로 계산되었고, 유전자의 발현량은 differentiation media만 처리한 대조군을 1.
- 각각의 실험 약물군에서 얻어진 2 μg의 RNA는 cDNA synthesis kit(SprintTM RT Complete Oligo-(dT)18, Clontech, Mountain View, CA, USA)를 이용해 역전사하여 first strand cDNA를 얻었다.
- 그 후 세포를 DMEM 배지에서 분리하여 다른 DMEM 배지로 이동시켜서 약물처치 없이 그대로 두거나(DMEM군), 또는 DM 배지(differential medium, DMEM에 0.5 mM 3-isobutyle-1-methylxanthine(IBMX), 0.25 mM dexamethasone, 10 μg/mL insulin, 10% FBS, 100 unit/mL penicillin와 100 μg/mL streptomycin이 첨가된 분화배지)로 이동시켜서, 여기에 발효된 삼정환(실험군)과 발효하지 않은 삼정환(대조군)을 각각 50, 100, 200 μL/mL 농도로 처리하여서 Western Blotting, Real-time PCR 실험에 사용하였고, 동일 약물들을 100 μL/mL 농도로 처리하여 Oil red O 실험에 사용하였다.
- PCR amplification은 C/EBPα에서는 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 50 cycle의 amplification(95℃에서 10초간 denaturation, 52℃에서 10초간 annealing, 72℃에서 15초간 extension) 하였고 GAPDH에서는 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 35 cycle의 amplification(95℃에서 10초간 denaturation, 52℃에서 10초간 annealing, 72℃에서 15초간 extension) 하였다. 반응의 특이도를 확인하기 위해서 증폭할 때마다 melting curve 분석을 수행하였다. 데이터는 LightCycler Software(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)로 분석하였다.
- 발효 삼정환에 의한 지방축적 감소가 어떤 분자 생물학적기전에 의해 유도되는지 확인하기 위해서 지방전구세포의 분화를 유도하면서 삼정환 및 발효 삼정환을 처리한 후, C/EPBα의 mRNA 및 PPARγ, UCP-2, HMG-CoA reductase의 단백질 발현 정도를 분석해보았다.
- 발효 삼정환이 3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정에 작용하여 지방구의 생성을 억제하는지를 확인하기 위해서 Oil Red O 염색액을 이용하여 3T3-L1세포 내에 생성된 지방구를 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 분화배지(differentiation media, DM)만 처리한 군에 비해서 대조군인 발효하지 않은 삼정환의 염색된 지방구 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 발효하지 않은 삼정환은 Oil Red O 실험에서 약물 처치를 하지 않은 DM군에 비해 염색된 지방구 수가 감소하여 지방량이 축적되는 정도를 감소시켰으며, 농도가 100μL/mL 이상일 때 C/EPBα, PPARγ, UCP-2 및 HMG-CoA reductase를 억제하여 삼정환의 지방 분화 억제 효과를 확인할 수 있었다. 발효했을 때 이 효과가 더욱 증가하는지를 확인하기 위해서 발효하지 않은 삼정환과 발효 삼정환을 동일 농도에서 비교해보았다. 발효균주로 쓰인 유산균의 종류에 따라 항비만 효과의 차이를 보였는데, Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환의 효과가 가장 높은 것으로 나타났다.
- 본 연구에서는 3T3-L1 전지방세포를 이용하여 발효 삼정환의 지방 분화 억제 효과를 확인하고자 하였다. 삼정환을 5가지 주요 유산균으로 각각 발효시킨 후, Oil Red O 염색법으로 지방세포 분화 억제 여부를 알아보고, 이의 기전을 알기 위해서 지방생성에 핵심적인 역할을 하는 transcription factor 및 지질 조절 효소의 유전자 발현량을 비교하여 보았다. Oil Red O 염색 분석에서는 Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium으로 발효한 삼정환에서 지방구 수의 감소를 확인할 수 있었다.
- 5로 맞춘 후, 121℃에서 20분간 고압 멸균하였다. 실온에서 식힌 후 Cellbiotech(Kimpo, Korea)에서 구입한 Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum 5종의 유산균을 삼정환에 접종(1% v/v)하여 48시간 동안 발효시켰다(Table 1). 발효되지 않은 삼정환 대조군은 세균 접종 대신에 2%(v/v) 살균수를 사용한 것을 제외하고는 같은 방법으로 준비하였다.
- 유전자의 전사레벨은 GAPDH를 기준으로 삼아 2-ΔCt(목표한 유전자의 threshold 값－GAPDH의 threshold 값)를 구하는 방식으로 계산되었고, 유전자의 발현량은 differentiation media만 처리한 대조군을 1.0으로 간주하여 상대적인 값을 측정하였다.
- 이 상태로 4일간 배양 후 배지를 제거하고 동일한 처치를 반복하였다. 추가로 3일을 더 배양한 후 Oil red O염색 혹은 Real-time PCR, Western Blotting을 시행하였다.
대상 데이터
- 반응의 특이도를 확인하기 위해서 증폭할 때마다 melting curve 분석을 수행하였다. 데이터는 LightCycler Software(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)로 분석하였다. 각각의 분석에서 cDNA 대신 물을 음성 대조군으로 사용하여 발생 가능한 primer-dimer 형성을 체크하였다.
- 상심자, 창출, 구기자는 동국대학교 일산한방병원(Dongguk University Ilsan Oriental Hospital, Ilsan, Korea)에서 구입하였으며, 상심자 425 g을 분쇄하여 만든 즙 250 cc에 구기자 21.25 g, 창출 21.25 g을 섞은 후, 70℃에서 초음파 처리하여 입자들을 고루 분산시킨 후, 지속적인 흔들림을 주면서 항온수조에서 70℃로 3시간 동안 처리하였다. 이렇게 제조된 삼정환의 pH는 4.
- 실험에 사용한 3T3-L1 세포는 마우스 지방전구세포로 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였고, 10% fetal bovine serum(FBS, Invitrogen,Grand Island, NY, USA)과 100 unit/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin(Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA)이 함유된 DMEM(Invitrogen) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
이론/모형
- 우선 C/EPBα 유전자의 발현 정도를 Real time PCR법을 이용하여 관찰하였다.
성능/효과
- Enterococcus faecium으로 발효한 삼정환의 경우, 발효하지 않은 삼정환에 비해서 역시 Oil Red O 실험에서 염색된 지방구 수가 감소하였고 C/EPBα, PPARγ, UCP-2의 3개 항목에서 억제 효과를 나타냈으며, 농도가 200 μL/mL일 때 동일 농도의 발효하지 않은 삼정환보다 C/EPBα를 54% 더욱 억제시켜, C/EPBα 1개 항목에서 실험군 중 가장 높은 억제율을 나타냈다.
- HMG-CoA reductase의 활성이 저하되면 LDL-receptor의 활성이 증가하여 혈청 콜레스테롤 농도가 감소하므로 고콜레스테롤혈증을 예방, 치료하는데 유용한 것으로 알려져 있다(33). HMG-CoA reductase의 Western blot 실험에서 Fig. 3과 같은 결과를 얻었으며, 이를 정량적으로 분석했을 때, FH1(200)에서만 DM 및 대조군에 비해서 낮게 측정되었고 대조군과 비교했을 때 54% 억제시키는 것으로 나타났다(Fig. 6).
- Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환은 동일 농도의 발효하지 않은 삼정환과 비교했을 때, Oil Red O 실험에서 염색된 지방구 수가 더욱 감소하였으며, PPARγ, UCP-2, HMG-CoA reductase의 경우 농도가 200 μL/mL일 때 각각 35%, 57%, 54%로 5가지 발효 삼정환 중 가장 높은 억제율을 나타내었다.
- Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환은 발효하지 않은 삼정환에 비해서 Oil Red O 실험에서 염색된 지방구 수가 감소하였으며, 농도가 200 μL/mL일 때 동일 농도의 발효하지 않은 삼정환보다 PPARγ 35%, UCP-2 57% 및 HMGCoA reductase를 54% 더욱 억제시키면서 이상의 부분에서 실험군 중 가장 높은 억제율을 나타냈다.
- 우선 C/EPBα 유전자의 발현 정도를 Real time PCR법을 이용하여 관찰하였다. 그 결과 DM군에 비해 FH4(50)군을 제외하고는 모두 억제되는 것이 관찰되었으며, 각 농도별로 발효하지 않은 삼정환 대조군에 비해서 효과를 나타낸 것은 FH1(50), FH2(200), FH2(50), FH3(50), FH5(200) 및 FH5(50)이었다. 그중 FH2(200)이 동일 농도의 대조군에 비해 C/EPBα의 발현을 57% 억제시켜 억제 효과가 가장 좋은 것으로 관찰되었다(Fig.
- 3과 같은 결과를 얻었으며, 이를 정량적으로 분석했을 때, DM군에 비해서 FH1(50), FH2(50)을 제외하고는 모두 감소되는 결과를 보였으며, 각 농도별로 대조군에 비해서 FH1(200), FH2(200), FH2(100), FH3(200), FH3(50), FH4(50), FH5(50)이 효과를 나타냈다. 그중 FH1(200)군이 UCP-2의 발현을 57% 억제시켜 효과가 가장 우수한 것으로 관찰되었다(Fig. 5).
- 그중 FH1(200)이 동일 농도의 대조군에 비해 PPARγ를 35%를 억제시켜 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 그중 FH2(200)이 동일 농도의 대조군에 비해 C/EPBα의 발현을 57% 억제시켜 억제 효과가 가장 좋은 것으로 관찰되었다(Fig. 2).
- 또한 transcription factor로 C/EPBα, PPARγ, UCP-2 및 콜레스테롤 조절과 관련된 효소인 HMG-CoA reductase의 4가지 유전자 발현 정도를 분석하였는데, 발효시키지 않은 삼정환의 경우 농도가 100 μL/mL 이상일 때 네 가지 항목에서 억제 효과를 나타냈으며, 발효시켰을 때는 유산균의 종류에 따라 효과 억제효과가 있었는데, Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환이 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 발효했을 때 이 효과가 더욱 증가하는지를 확인하기 위해서 발효하지 않은 삼정환과 발효 삼정환을 동일 농도에서 비교해보았다. 발효균주로 쓰인 유산균의 종류에 따라 항비만 효과의 차이를 보였는데, Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환의 효과가 가장 높은 것으로 나타났다. Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환은 발효하지 않은 삼정환에 비해서 Oil Red O 실험에서 염색된 지방구 수가 감소하였으며, 농도가 200 μL/mL일 때 동일 농도의 발효하지 않은 삼정환보다 PPARγ 35%, UCP-2 57% 및 HMGCoA reductase를 54% 더욱 억제시키면서 이상의 부분에서 실험군 중 가장 높은 억제율을 나타냈다.
- 발효하지 않은 삼정환은 Oil Red O 실험에서 약물 처치를 하지 않은 DM군에 비해 염색된 지방구 수가 감소하여 지방량이 축적되는 정도를 감소시켰으며, 농도가 100μL/mL 이상일 때 C/EPBα, PPARγ, UCP-2 및 HMG-CoA reductase를 억제하여 삼정환의 지방 분화 억제 효과를 확인할 수 있었다.
- 본 연구 결과 3T3-L1 전지방세포에서 지방 분화 억제 효과를 보인 삼정환을 발효시켰을 때 그 효과가 더욱 증가하였고, 특히 Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환은 가장 우수한 효과를 나타냈는데, PPARγ, UCP-2, HMG-CoA reductase의 유전자 발현을 down regulation시킴으로써 지방 생성 혹은 콜레스테롤 합성을 저해하는 것으로 확인되었다.
- 발효 삼정환이 3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정에 작용하여 지방구의 생성을 억제하는지를 확인하기 위해서 Oil Red O 염색액을 이용하여 3T3-L1세포 내에 생성된 지방구를 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 분화배지(differentiation media, DM)만 처리한 군에 비해서 대조군인 발효하지 않은 삼정환의 염색된 지방구 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 발효 삼정환군 중에서는 DM군에 비해서 FH1과 FH2에서 지방구 수의 감소를 확인할 수 있었지만, FH 3, 4, 5에서는 뚜렷한 감소를 확인할 수 없었다(Fig.
- 3). 이를 정량적으로 분석했을 때 DM군에 비해서 FH1(200), FH2(200), FH5(200)에서만 감소된 것으로 관찰되었으며, 각 농도별로 대조군과 비교하면 FH1(200), FH2(200)에서 효과를 나타내었다. 그중 FH1(200)이 동일 농도의 대조군에 비해 PPARγ를 35%를 억제시켜 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(Fig.
- 이에 지방분화 억제 효과를 가진 삼정환을 발효시키면 그 효과가 더욱 증가하는 것으로 나타났는데, 특히 Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환은 PPARγ, UCP-2, HMG-CoA reductase의 유전자 발현조절을 통해 지방 분화를 억제시키는 것으로 밝혀져 발효 삼정환은 항비만 혹은 항고지혈증 약물로 개발 가능성이 있는 것으로 사료된다.
후속연구
- 본 연구 결과 3T3-L1 전지방세포에서 지방 분화 억제 효과를 보인 삼정환을 발효시켰을 때 그 효과가 더욱 증가하였고, 특히 Lactobacillus plantarum으로 발효한 삼정환은 가장 우수한 효과를 나타냈는데, PPARγ, UCP-2, HMG-CoA reductase의 유전자 발현을 down regulation시킴으로써 지방 생성 혹은 콜레스테롤 합성을 저해하는 것으로 확인되었다. 그러나 항비만 활성을 나타내는 여러 가지 반응경로가 있으므로 다른 작용 기전 관련 down-stream 단백질의 활성화 및 또 다른 신호전달체계에 관한 연구는 더욱 진행되어야 할 것이다. 또한 지질개선, 인슐린 분비 개선 및 체중 감소효과뿐만 아니라 유효성분의 변화, 2차 생성물의 유무 및 독성의 변화 등 발효로 인한 약성의 변화도 연구되어야 할 부분이다.
- 그러나 항비만 활성을 나타내는 여러 가지 반응경로가 있으므로 다른 작용 기전 관련 down-stream 단백질의 활성화 및 또 다른 신호전달체계에 관한 연구는 더욱 진행되어야 할 것이다. 또한 지질개선, 인슐린 분비 개선 및 체중 감소효과뿐만 아니라 유효성분의 변화, 2차 생성물의 유무 및 독성의 변화 등 발효로 인한 약성의 변화도 연구되어야 할 부분이다.
- 한편 C/EPBα에서 FH2(200)와 UCP-2, HMG-CoA reductase에서 FH1(200)이 분화시키지 않은 DMEM보다 발현이 억제된 것으로 나타났는데, 추가 실험을 통해 재확인이 필요한 부분이다.
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