[논문]산달래 추출물의 3T3-L1 지방전구세포 분화 억제 효능

이주연; 정예주; 김진아; 김춘영

doi:10.9721/kjfst.2020.52.5.441

산달래 추출물의 3T3-L1 지방전구세포 분화 억제 효능
Inhibitory effect of Allium macrostemon extracts on adipogenesis of 3T3-L1 preadipocytes 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.52 no.5, 2020년, pp.441 - 449

이주연 (영남대학교 식품영양학과) , 정예주 (영남대학교 식품영양학과) , 김진아 (영남대학교 식품영양학과) , 김춘영 (영남대학교 식품영양학과)

초록
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산달래 열수추출물의 생리활성을 비교하기 위하여 산달래를 전체(WAE), 비늘줄기(BAE), 잎(LAE)으로 분리하여 추출한 후 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, 지방전구세포 분화 억제 효과를 확인하였다. BAE에 비해 WAE와 LAE는 유의적으로 높은 라디칼 소거능, 환원력과 총 폴리페놀 함량을 보였다. 지방전구세포 분화 억제능 역시 BAE에 비해 WAE와 LAE가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 산달래 전체 중 가장 많은 부분을 차지하는 잎에 유효성분이 있을 것으로 판단되어, LAE의 항비만 효능을 알아보았다. LAE는 농도의존적으로 지방전구세포의 분화를 감소시켰으며 이는 독성에 의한 3T3-L1 세포 사멸에 의한 것이 아님을 세포생존율 측정을 통해 확인하였다. LAE의 지방전구세포 분화 억제능은 adipogenesis 관련 전사인자인 CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPβ), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), C/EBPα 유전자 발현의 억제와 관련이 있는 것으로 확인하였다. 또한 lipogenesis에 필수적인 효소 stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1)의 유전자 발현을 저해하였다. 이를 통해 산달래 추출물 중 LAE는 adipogenic 전사인자와 SCD1 유전자 조절을 통해 지방전구세포 분화를 억제함을 밝혔고 항비만 기능성 물질로서의 활용 가능성을 확인하였다. 따라서 산달래가 항비만 효과가 있는 식품임을 입증하고 건강기능성식품 소재로서 상품화될 가능성을 제시하고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to compare the biological activities of whole-plant (WAE), bulb (BAE), and leaf (LAE) extracts of Allium macrostemon. The antioxidant activities, total polyphenol contents, and anti-adipogenic activities of WAE and LAE were superior to those of BAE, whereas the biological effects of WAE and LAE were similar. Therefore, the effect of LAE on adipogenesis was further investigated. Treatment of preadipocytes with LAE at 100 g/mL resulted in the inhibition of intracellular lipid accumulation by 49.64%. Consistent with this result, quantitative reverse transcription-PCR showed that LAE treatment decreased the gene expressions of CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPβ), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), C/EBPα and stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1). Thus, LAE attenuates the adipogenesis of preadipocytes by suppressing the expression of adipogenic and lipogenic genes. These results suggest that LAE can be potentially useful as a functional ingredient to prevent obesity in the food industry.

주제어

표/그림 (6)

표 Table 1. The primer sequences used for qRT-PCR
그림 Fig. 1. Antioxidative capacity of whole, bulb, and leaf extracts from Allium macrostemon measured by (A) total polyphenol content, (B) DPPH radical scavenging activity, and (C) ferric ion reducing antioxidant power assays. The samples were a whole plant of Allium macrostemon extract (WAE), a bulb of Allium macrostemon extract (BAE), and leaves of Allium macrostemon extract (LAE). Values are mean±standard deviation (SD) (n=3-9). Values with different letters in a column are different at 5% significance level by Duncan's multiple range test.
그림 Fig. 2. Lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes treated with Allium macrostemon extracts during adipogenesis. (A) 3T3-L1 preadipocytes were differentiated in the absence and presence of 100 μg/mL of a whole-plant of Allium macrostemon extract (WAE), a bulb of Allium macrostemon extract (BAE), and leaves of Allium macrostemon extract (LAE). Intracellular lipid accumulation was estimated by Oil Red O staining on Day 6 of adipogenesis. (B) Leaves of Allium macrostemon extract (LAE) at a concentration of 5, 50, and 100 μg/mL were added in 3T3-L1 preadipocytes for 6 days during adipogenesis. Oil Red O staining was conducted to visualized intracellular lipid accumulation. Values are expressed as the mean±SD (n=4). Statistical analysis was performed using Dunnett's t-test and p values were provided (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001). Values are compared to differentiated control respectively. NT: nontreatment, ns: not significant.
그림 Fig. 3. Cell viability of 3T3-L1 preadipocytes treated with three Allium macrostemon extracts. MTT assay was performed to test the effects of a whole-plant of Allium macrostemon extract (WAE), a bulb of Allium macrostemon extract (BAE), and leaves of Allium macrostemon extract (LAE) on cell viability of 3T3-L1 preadipoctyes. Increasing concentrations (0, 5, 50, 100 μg/mL) of WAE, BAE, and LAE were added in 3T3-L1 preadipocytes for 24 h. Data represent means±SD (n=9). Statistical analysis was performed using Dunnett's t-test and p values were provided (*p<0.05; **p<0.01). Values are compared to 0 μg/mL in same sample respectively.
그림 Fig. 4. Adipogenic gene expression in 3T3-L1 adipocytes treated with leaves of Allium macrostemon extract. Leaves of Allium macrostemon extract (LAE) at concentrations of 0, 5, 50, 100 μg/mL were added in 3T3-L1 cells during differentiation. On Day 6, total cellular RNA was extracted and reverse transcription was performed. Synthesized cDNAs were subjected to quantitative RTPCR. The levels of adipogenic genes such as (A) CCAAT/enhancerbinding protein beta (C/EBPβ), (B) peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) and (C) C/EBPα were normalized to β-actin. Values are expressed as the mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Tukey's HSD at p<0.05. pre: preadipocyte.
그림 Fig. 5. Lipogenic gene expression in 3T3-L1 adipocytes treated with leaves of Allium macrostemon extract. The 3T3-L1 adipocytes were differentiated for 6 days with leaves of Allium macrostemon extract (LAE). On Day 6, quantitative RT-PCR was conducted to estimate the expression of lipogenic genes such as (A) sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c), (B) stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD1), and (C) fatty acid synthase (FAS). Values are expressed as the mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Tukey's HSD at p<0.05. pre: preadipocyte.

AI 본문요약
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문제 정의

LAE가 adipogenesis 과정에 관여하는 전사인자들의 유전자 발 현에 미치는 영향을 알아보았다.
몇몇 연구에서 산달래의 고혈당, 고지혈증 및 내장비만 예방효과 등의 결과를 보고하였으나 산달래의 항비만에 대한 연구는 미흡한 실정이다(Xie 등, 2008; Zhang 등, 2015; Zhang 등, 2012). 따라서 본 연구는 산달래를 전체, 비늘줄기, 잎 부분으로 분리하여 항산화능을 검증한 후, 각 시료들의 3T3-L1 지방전구세포 분화 억제 효과를 연구하였다.

제안 방법

LAE가 lipogenesis 관련 유전자 발현에 영향을 주는지를 확인 하기 위해 LAE를 0, 5, 50, 100 μg/mL의 농도로 분화 기간인 6일 동안 3T3-L1 세포에 처리한 후 qRT-PCR 분석을 하였다.
산달래 추출물(WAE와 LAE)의 지방전구세포 분화 억제 효능이 3T3-L1 지방전구세포에 대한 추출물의 독성 때문인지 또는 생리활성 능력 때문인지를 파악하기 위하여 세포 생존율을 측정 하였다(Fig. 3).
이를 통해 산달래 전체 중 가장 많은 부분을 차지하는 잎에 유효성분이 있을 것으로 판단되어, LAE의 항비만 효능을 알아보았다. LAE는 농도의존적으로 지방전구세포의 분화를 감소시켰으며 이는 독성에 의한 3T3-L1 세포 사멸에 의한 것이 아님을 세포생존율 측정을 통해 확인하였다. LAE의 지방전구세포 분화 억제능은 adipogenesis 관련 전사인자인CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPβ), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), C/EBPα 유전자 발현의 억제와 관련이 있는 것으로 확인하였다.
5 μL (50 pM), cDNA, distilled water로 구성되었다. StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystem)을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 각 샘플의 housekeeping gene은 β-actin을 이용했다.
각 농도별 샘플 10 μL에 10 μL의 증류수와 100 μL의 FRAP reagent를 각각 첨가하여 593 nm에서 흡광도를 측정하였다.
산달래 전체, 비늘줄기와 잎 부위를 각각 동결건조 후 마쇄하여 분말형태로 만들었다. 각 시료 무게의 10배(w/v)의 증류수를 가하여 autoclave (VS-1221, Vision, Seoul, Korea)로 121℃에서 20분간 추출하였다. 추출액은 거즈로 2회 여과 후 여과액을 12,000×g에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다.
따라서 산달래 추출물이 3T3-L1 지방세포분화(adipogenesis)에서 세포 내 지방구(lipid droplet) 생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 농도 100 μg/mL의 WAE, BAE, LAE를 분화유도 기간(Day 0-6)인 총 6일 동안 처리하고 Oil red O 염색을 통하여 중성지방의 축적 정도를 확인하였다(Fig. 2A).
이는 앞서 수행된 WAE와 LAE의 총 폴리페놀 함량 비교 결 과와 유사하다. 따라서 산달래의 잎에 항산화, 항염증, 비만예방 등의 생리활성 성분이 집중되어 있다고 판단하여, 이후 실험에서는 LAE의 3T3-L1 지방전구세포 분화에 대한 영향을 확인했다. 농도 5, 50, 100 μg/mL의 LAE를 분화 유도 기간인 6일 동안 처 리하였을 때 세포 내 지방 축적 억제 활성이 각각 5.
라디칼 소거능 측정은 Brand-Williams의 방법을 변형하여 실시하였다(Brand-Williams 등, 1995). 시료 50 μL와 0.
배양배지로는 high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Welgene, Daegu, Korea)에 10% calf serum (CS, Newborn Calf Serum Heat-inactive, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin-streptomycin antibiotics (Penicillin-Streptomycin Solution, Welgene, Daegu, Korea)를 첨가하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하였다.
본 연구에서는 LAE가 adipogenesis 중·후기에 일어나는 lipogenesis에 필요한 전사인자 SREBP-1과 효소 FAS 유전자 발현을 감소시키지 않지만, SCD1 유전자 발현은 억제시켰다.
이로부터 2일 후 10% fetal bovine serum (FBS, Fetal bovine serum, certified, US origin, Gibco, Grand Island, NY, USA)- DMEM, 1% penicillin-streptomycin antibiotics에 최종농도가 500 μM 3-isobuty-1-methylx-anthine, 1 μM dexamethasone, 167 nM insulin이 되도록 첨가하여 분화를 시작하였다(Day 0). 분화 시작 후 48시간(Day 2)일 때 insulin을 포함한 10% FBS-DMEM 배지로 교환하여 2일 동안 처리한 후(Day 4), 10% FBS-DMEM 배지로 2일간 더 배양하였다(Day 6). Phosphate buffered saline (PBS)에 녹인 시료들은 분화 유도 기간 동안(Day 0-6) 각 배지에 100배의 농도로 희석하여 처리하였다.
산달래 열수추출물의 생리활성을 비교하기 위하여 산달래를 전체(WAE), 비늘줄기(BAE), 잎(LAE)으로 분리하여 추출한 후 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, 지방전구세포 분화 억제 효과를 확인하였다. BAE에 비해 WAE와 LAE는 유의적으로 높은 라디칼소거능, 환원력과 총 폴리페놀 함량을 보였다.
산달래 전체 추출물(a whole-plant of Allium macrostemon extract, WAE), 비늘줄기 추출물(a bulb of Allium macrostemon extract, BAE), 그리고 잎 추출물(leaves of Allium macrostemon extract, LAE)의 생리활성을 확인하기 위하여 추출물 내 총 폴리 페놀 함량, 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate (DPPH) 라디칼 소거능과 환원력을 측정하였다.
산달래는 깨끗이 수세하여 이물질을 제거한 후 일부는 잎과 비늘줄기를 분리하였다. 산달래 전체, 비늘줄기와 잎 부위를 각각 동결건조 후 마쇄하여 분말형태로 만들었다. 각 시료 무게의 10배(w/v)의 증류수를 가하여 autoclave (VS-1221, Vision, Seoul, Korea)로 121℃에서 20분간 추출하였다.
세포 내 유전자 발현 정도를 알아보기 위해 quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) 실험을 수행하 였다. 관심 유전자에 대한 primer (Bioneer Inc.
시료 50 μL와 0.02% 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 100 μL를 혼합하여 암실에서 30분간 반응시킨 후, 510 nm에서 microplate spectrophotometer (Epoch, BioTek Instruments Inc, Winooski, VT, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
시료의 3T3-L1 분화 억제 효능을 확인하기 위하여 Oil red O 염색을 실시하였다. Oil red O는 중성지방(triglyceride)을 염색하는 방법으로 세포 내 지방을 정량화할 수 있다.
실험에 사용된 역전사효소는 iScript^TM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA)이며 제조사의 사용설명서에 따라 5X iScript Reaction Mix 4 μL, iScript Reverse transcriptase 1 μL, total RNA (1,000 ng/ μL), RNase-water를 넣어 mixture를 제조하였다. 역전사는 Simpli Amp Thermal Cycler (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)를 이용하여 25℃에서 5분간 priming, 46℃에서 20분간 reverse transcription, 95℃에서 1분간 reverse transcription inactivation의 조건으로 실시하였다. 합성된 cDNA는 4℃에 보관하였다.
표준물질로는 기존의 알려진 항산화제인 ascorbic acid를 다양한 농도로 증류수에 녹여 동일한 방식으로 흡광도를 측정한 후 검량선을 작성하였다. 이때 시료에 함유된 DPPH radical 소거능은 검량선을 이용하여 계산하였으며, 측정 단위는 DPPH radical scavenging activity (% of control)로 나타내었다.
이로부터 2일 후 10% fetal bovine serum (FBS, Fetal bovine serum, certified, US origin, Gibco, Grand Island, NY, USA)- DMEM, 1% penicillin-streptomycin antibiotics에 최종농도가 500 μM 3-isobuty-1-methylx-anthine, 1 μM dexamethasone, 167 nM insulin이 되도록 첨가하여 분화를 시작하였다(Day 0).
지방전구세포 분화 억제능 역시 BAE에 비해 WAE와 LAE가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 산달래 전체 중 가장 많은 부분을 차지하는 잎에 유효성분이 있을 것으로 판단되어, LAE의 항비만 효능을 알아보았다. LAE는 농도의존적으로 지방전구세포의 분화를 감소시켰으며 이는 독성에 의한 3T3-L1 세포 사멸에 의한 것이 아님을 세포생존율 측정을 통해 확인하였다.
5%의 농도로 녹인 Oil red O 용액을 증류수와 6:4의 비율로 희석하여 처리하고 30분간 염색을 실시하였다. 증류수로 세척 후 광학현미경을 통해 중성지방 생성 및 염색 정도를 확인하였다. 세포 내 지방 함량을 비교 하기 위해 염색된 지방을 isopropyl alcohol로 녹인 후 microplate reader를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
분화 유도가 끝난 Day 6에 3T3-L1의 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 다음 3% formaldehyde 용액으로 30분 동안 세포를 고정시켰다. 증류수로 세포를 세척 후 isopropyl alcohol에 0.5%의 농도로 녹인 Oil red O 용액을 증류수와 6:4의 비율로 희석하여 처리하고 30분간 염색을 실시하였다. 증류수로 세척 후 광학현미경을 통해 중성지방 생성 및 염색 정도를 확인하였다.
이후 침전된 RNA pellet을 상온에서 말렸다. 추출된 RNA는 DEPC-H₂O에 녹여 NanoDrop (NanoDrop Lite Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 농도를 측정하였다. 이때, purity optical density인 A260/A280 ratio는 1.
추출물의 항산화능을 판단하기 위하여 DPPH radical scavenging activity를 수행하였다(Fig. 1B). 농도 1, 5, 10, 20 mg/mL의 추출 물로 DPPH radical 소거능 평가를 실시한 결과, 농도 5 mg/mL의 WAE, BAE, LAE에서 각각 26.
추출한 total RNA로 reverse transcription을 실시하여 cDNA를 합성하였다. 실험에 사용된 역전사효소는 iScript^TM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA)이며 제조사의 사용설명서에 따라 5X iScript Reaction Mix 4 μL, iScript Reverse transcriptase 1 μL, total RNA (1,000 ng/ μL), RNase-water를 넣어 mixture를 제조하였다.
시료 10 μL와 20 μL의 10% Folin-Ciocalteau reagent를 혼합하고 여기에 80 μL의 700mM sodium carbonate를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid를 95% methanol에 다양한 농도로 녹여 동일한 방법으로 흡광도를 측정한 후 검량선을 작성하였고, 이를 이용하여 총 폴리페놀 함량을 시료 1g당 milligram gallic acid로 계산하였다. 측정 단위는 milligram gallic acid equivalent (mg GAE)/g of sample이다.
02% 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 100 μL를 혼합하여 암실에서 30분간 반응시킨 후, 510 nm에서 microplate spectrophotometer (Epoch, BioTek Instruments Inc, Winooski, VT, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 기존의 알려진 항산화제인 ascorbic acid를 다양한 농도로 증류수에 녹여 동일한 방식으로 흡광도를 측정한 후 검량선을 작성하였다. 이때 시료에 함유된 DPPH radical 소거능은 검량선을 이용하여 계산하였으며, 측정 단위는 DPPH radical scavenging activity (% of control)로 나타내었다.

대상 데이터

, Daejeon, Korea)의 염기서열은 Table 1에 제시하였다. DNA binding dye로는 SYBR Green (2x SYBR Green Master Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하였다. 실험에 사용된 총 반응 용액은 20 μL로 SYBR Green 10 μL, primer forward 0.
본 실험에 사용된 산달래는 2019년 4월 경상북도 군위군에서 수확한 것을 경산 식자재마트에서 구입하여 사용하였다. Insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), Oil Red O (ORO) 및 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 SigmaAldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용된 산달래는 2019년 4월 경상북도 군위군에서 수확한 것을 경산 식자재마트에서 구입하여 사용하였다. Insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), Oil Red O (ORO) 및 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 SigmaAldrich Co.
실험에 사용된 3T3-L1은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 배양배지로는 high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Welgene, Daegu, Korea)에 10% calf serum (CS, Newborn Calf Serum Heat-inactive, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1% penicillin-streptomycin antibiotics (Penicillin-Streptomycin Solution, Welgene, Daegu, Korea)를 첨가하여 5% CO₂, 37℃ incubator에서 배양하였다.
실험에 사용된 역전사효소는 iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA)이며 제조사의 사용설명서에 따라 5X iScript Reaction Mix 4 μL, iScript Reverse transcriptase 1 μL, total RNA (1,000 ng/ μL), RNase-water를 넣어 mixture를 제조하였다.
실험에 사용된 총 반응 용액은 20 μL로 SYBR Green 10 μL, primer forward 0.5 μL (50 pM), primer reverse 0.5 μL (50 pM), cDNA, distilled water로 구성되었다.

데이터처리

모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, IBM SPSS (Ver. 23, IBM Corp., Armonk, NY, USA) 통계 프로그램을 이용하였다.
Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Tukey’s HSD at p<0.05.
Statistical analysis was performed using Dunnett’s t-test and p values were provided (*p<0.05; **p<0.01).
Statistical analysis was performed using Dunnett’s t-test and p values were provided (*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001).
Values with different letters in a column are different at 5% significance level by Duncan’s multiple range test.
각 실험결과의 평균치들은 일원배치 분산분석 중 Duncan’s multiple range test, Dunnett's t-test, Tukey’s HSD를 시행하여 비교하였다.

이론/모형

Fe3+이온을 Fe2+이온으로 환원시키는 환원력을 측정하는 ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay는 Benzie의 방법으로 실시하였다(Benzie과 Strain, 1996). Sodium acetate buffer (300 mM, pH 3.
PCR을 수행한 후 유전자 발현은 각 gene들의 Ct값을 이용하여 delta-delta-Ct (ΔΔCt)법으로 계산하여 분석하였다.
시료가 세포 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay 를 실시하였다. 세포를 24-well plate에 80% confluence까지 배양한 후, 시료를 농도별로 배양 배지에 희석하여 24시간 동안 처리하였다.
총 폴리페놀 함량을 측정하기 위해서 Folin-Ciocalteau법을 이용하여 실험하였다(Singleton 등, 1999). 시료 10 μL와 20 μL의 10% Folin-Ciocalteau reagent를 혼합하고 여기에 80 μL의 700mM sodium carbonate를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다.

성능/효과

본 연구에서 WAE는 53.9%의 세포 내 지질 축적 억제능을 나타내어 지방세포 내 지방구 생성 억제효과가 있는 것을 확인했다.
(A) 3T3-L1 preadipocytes were differentiated in the absence and presence of 100 μg/mL of a whole-plant of Allium macrostemon extract (WAE), a bulb of Allium macrostemon extract (BAE), and leaves of Allium macrostemon extract (LAE).
산달래 열수추출물의 생리활성을 비교하기 위하여 산달래를 전체(WAE), 비늘줄기(BAE), 잎(LAE)으로 분리하여 추출한 후 항산화 활성, 총 폴리페놀 함량, 지방전구세포 분화 억제 효과를 확인하였다. BAE에 비해 WAE와 LAE는 유의적으로 높은 라디칼소거능, 환원력과 총 폴리페놀 함량을 보였다. 지방전구세포 분화 억제능 역시 BAE에 비해 WAE와 LAE가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다.
5). LAE를 농도별로 처리한 군에서는 SREBP-1 유전자의 발현은 억제되지 않았으며, FAS 유전자의 발현은 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 반면, 농도 100 μg/mL의 LAE 처리군은 SCD1 유전자 발현이 대조군에 비해 약 88% 감소하였다.
LAE의 지방전구세포 분화 억제능은 adipogenesis 관련 전사인자인CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPβ), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), C/EBPα 유전자 발현의 억제와 관련이 있는 것으로 확인하였다.
Pre에 비해 Day 6까지 분화를 유도한 대조군(0 μg/mL)에서 sterol regulatory-element binding protein 1 (SREBP-1), stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1), fatty acid synthase (FAS)가 각각 3.82, 11.49, 4.53배 증가되어 실험에 사용된 세포에서 lipogenesis가 유도되는 것을 확인하였다(Fig. 5).
83%의 라디칼 소거능을 보였다. WAE, BAE, LAE 농도 10 mg/mL에서의 라디칼 소거 능은 각각 54.34, 13.48, 48.43%로 나타났다. 농도 20 mg/mL의 WAE, BAE, LAE에서 각각 59.
WAE, BAE, 그리고 LAE의 총 폴리페놀 함량은 각각 13.93 mg GAE/g of sample, 1.49 mg GAE/g of sample, 13.73 mg GAE/g of sample으로 나타났다.
60%의 라디칼 소거능을 보였다. WAE와 LAE 농도 5 mg/mL에서는 DPPH radical 소거능이 유의적인 차이가 없었고 농도 10 mg/mL에서는 WAE가 LAE보다 높은 라디칼 소거능을 보였으나 20 mg/mL에서 LAE가 WAE보다 높은 라디칼 소거능을 나타냈다. Jung 등(2011)은 산달래 메탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 0.
73 mg GAE/g of sample으로 나타났다. WAE와 LAE의 총 폴리페놀 함량은 유의적 차이가 없었으나 BAE의 경우 현저하게 낮은 것으로 측정 되었다. 본 연구에서 총 폴리페놀 함량은 LAE, WAE, BAE 순서로 높게 나타났는데 국내에서 소비되는 다양한 채소류와 비교하면 Kim (2020)은 품종별 고추들의 총 폴리페놀 함량이 2.
가장 높은 농도인 100 μg/mL에서 WAE, BAE, LAE의 생존율은 각각 107.48, 108.86, 113.05%로 확인되었다.
가장 높은 농도인 100 μg/mL의 경우 대조군과 비교하였을 때 C/ EBPβ의 유전자 발현은 약 72%, PPARγ의 유전자 발현은 100%, C/EBPα의 유전자 발현은 약 87% 감소되었다.
1C와 같다. 각 시료의 환원력은 농도의존적으로 증가했으며 모든 농도에서 환원력은 WAE, LAE, BAE 순으로 나타났다. 농도 20 mg/mL에서 WAE은 1 mM로 유의적으로 높은 값을 보였으며, 이어서 LAE는 0.
1B). 농도 1, 5, 10, 20 mg/mL의 추출 물로 DPPH radical 소거능 평가를 실시한 결과, 농도 5 mg/mL의 WAE, BAE, LAE에서 각각 26.44, 3.57, 23.83%의 라디칼 소거능을 보였다. WAE, BAE, LAE 농도 10 mg/mL에서의 라디칼 소거 능은 각각 54.
농도 100 μg/mL의 WAE, LAE를 분화유도기간인 6일 동안 처리한 경우에 NT와 비교하여 각각 53.9, 49.69%의 세포 내 중성지방이 감소한 데 반해 BAE는 분화를 억제하지 않았다.
43%로 나타났다. 농도 20 mg/mL의 WAE, BAE, LAE에서 각각 59.14, 28.80, 68.60%의 라디칼 소거능을 보였다. WAE와 LAE 농도 5 mg/mL에서는 DPPH radical 소거능이 유의적인 차이가 없었고 농도 10 mg/mL에서는 WAE가 LAE보다 높은 라디칼 소거능을 보였으나 20 mg/mL에서 LAE가 WAE보다 높은 라디칼 소거능을 나타냈다.
농도 5, 50, 100 μg/mL의 LAE를 분화 유도 기간인 6일 동안 처 리하였을 때 세포 내 지방 축적 억제 활성이 각각 5.36, 25.95, 49.64%로 나타나, LAE의 지방전구세포 분화 억제 효과가 농도 의존적임을 확인하였다(Fig. 2B).
농도 5, 50, 100 μg/mL의 LAE에서 C/EBPβ, PPARγ 그리고 C/ EBPα의 발현이 각각 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
따라서 산달래 추출물은 농도 100 μg/mL까지 3T3-L1 지방전구세포 생존율에 영향을 미치지 않으며, Fig. 2에서 확인한 지방전구세포 분화 억제는 산달래 추출물의 생리활성 때문인 것으로 판단할 수 있었다.
본 실험을 통해 LAE는 adipogenesis 초기에 발현되는 전사인자들과 adipogenesis 중·후기에 발현되는 lipogenic enzyme인 SCD1을 억제하여 중성지방 생성을 저해하는 항비만 효능이 있는 것으로 판단된다.
본 연구에서는 농도 100 μg/mL의 LAE가 adipogenic genes (C/ EBPβ, PPARγ, C/EBPα)의 유전자 발현을 억제하는 것으로 확인하였다.
분화를 유도하지 않은 지방전구세포인 preadipocyte (pre)와 비교하였을 때, NT에서 adipogenesis를 일으키는 대표적 전사인자인 CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/ EBPβ), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), C/EBPα 유전자 발현이 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.
, Tokyo, Japan)로 45℃에서 농축 후 동결건조하여 실험에 사용하였다. 산달래 전체 추출물(a whole-plant of Allium macrostemon extract, WAE), 비늘줄기 추출물(a bulb of Allium macrostemon extract, BAE), 그리고 잎 추출물(leaves of Allium macrostemon extract, LAE)의 수율은 각각 27.52, 66.19, 43.36%로 나타났다.
산달래 추출물의 지방전구세포 분화 억제 효능은 BAE에서는 관찰되지 않았고 WAE와 LAE는 유의적으로 분화를 억제를 하였으나 WAE와 LAE의 지방전구세포 분화 억제 효능은 유사하였다. 이는 앞서 수행된 WAE와 LAE의 총 폴리페놀 함량 비교 결 과와 유사하다.
연구결과에서 산달래 추출물 중 비늘줄기 추출물(BAE)은 DPPH radical 소거능과 총 폴리페놀 함량은 현저하게 낮고, 전체(WAE) 와 잎 추출물(LAE)은 유의적으로 차이가 없거나 잎에서 높게 측정되었음을 알 수 있다. 이는 산달래의 대부분을 차지하는 잎 부위가 WAE에서도 높은 비중을 차지하며, autoclave를 이용하여 추출했기 때문이라 판단된다.
9%의 억제능을 나타냈다(Kim 등, 2019). 이는 본 연구의 결과와 유사하여 Allium 속 식물들이 지방전구세포 분화 억제능이 있음을 확인할 수 있었다.
69%의 세포 내 중성지방이 감소한 데 반해 BAE는 분화를 억제하지 않았다. 이를 통해 BAE는 지방전구세포 분화에 영향을 미치지 않으며, WAE 와 LAE는 NT와 비교하여 유의적으로 지방전구세포 분화를 억제한 것을 알 수 있었다.
또한 lipogenesis에 필수적인 효소 stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1)의 유전자 발현을 저해하였다. 이를 통해 산달래 추출물 중 LAE는 adipogenic 전사인자와 SCD1 유전자 조절을 통해 지방전구세포 분화를 억제함을 밝혔고 항비만 기능성 물질로서의 활용 가능성을 확인하였다. 따라서 산달래가 항비만 효과가 있는 식품임을 입증하고 건강기능성식품 소재로서 상품화될 가능성을 제시하고자 한다
추출물이 C/EBPβ, PPARγ, C/EBPα의 유전자 발현을 감소시켜 지방세포 내 지질 축적 억제능이 있음을 확인하였다 (Balogun 등, 2020). 이상의 결과에서 나타난 Allium 속 식물들은 분화 관련 유전자의 발현을 억제하여 지방세포 분화 억제능을 가진 것으로 여겨지며 본 실험을 통해 전사인자 발현이 감소된 산달래도 항비만 효능을 가진 식물로서의 가치를 확인할 수 있었다.
2B). 이와 같은 실험 결과를 통해 산달래의 잎(LAE)이 adipogenesis 억제 효능을 가지고 있다는 사실 을 알 수 있었다.
BAE에 비해 WAE와 LAE는 유의적으로 높은 라디칼소거능, 환원력과 총 폴리페놀 함량을 보였다. 지방전구세포 분화 억제능 역시 BAE에 비해 WAE와 LAE가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 산달래 전체 중 가장 많은 부분을 차지하는 잎에 유효성분이 있을 것으로 판단되어, LAE의 항비만 효능을 알아보았다.

후속연구

따라서 향후 LAE가 PPARγ의 영향을 받는 adipocyte specific gene인 adiponectin, fatty acid binding protein 4 (FABP4), adipocyte fatty acid-binding protein (aP2) 등의 발현에 미치는 영향을 확인하는 추가 연구가 필요한 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	지방세포의 비대는 어떻게 비만을 일으키는가?	Hypertrophy는 지방세포의 부피(volume)가 커지는 것을 의미하고, hyperplasia는 지방세포의 수(number)가 증가하는 것으로 지방전구세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화 (differentiation)되는 과정을 의미한다. Hypertrophy는 인슐린 감수성(insulin sensitivity) 저하, 염증성 사이토카인 발현 증가, 면역세포 반응성 증가, 다량의 유리 지방산 방출로 인한 독성 유발 등과 같은 현상을 일으켜 비만으로 인한 질환의 원인이 된다(Choe 등, 2016).
	Hypertrophy란?	비만은 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태이며, 지방조직의 확장은 지방세포의 비대(hypertrophy)와 과형성(hyperplasia)으로 인하여 일어난다. Hypertrophy는 지방세포의 부피(volume)가 커지는 것을 의미하고, hyperplasia는 지방세포의 수(number)가 증가하는 것으로 지방전구세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화 (differentiation)되는 과정을 의미한다. Hypertrophy는 인슐린 감수성(insulin sensitivity) 저하, 염증성 사이토카인 발현 증가, 면역세포 반응성 증가, 다량의 유리 지방산 방출로 인한 독성 유발 등과 같은 현상을 일으켜 비만으로 인한 질환의 원인이 된다(Choe 등, 2016).
	hyperplasia란?	비만은 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태이며, 지방조직의 확장은 지방세포의 비대(hypertrophy)와 과형성(hyperplasia)으로 인하여 일어난다. Hypertrophy는 지방세포의 부피(volume)가 커지는 것을 의미하고, hyperplasia는 지방세포의 수(number)가 증가하는 것으로 지방전구세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 분화 (differentiation)되는 과정을 의미한다. Hypertrophy는 인슐린 감수성(insulin sensitivity) 저하, 염증성 사이토카인 발현 증가, 면역세포 반응성 증가, 다량의 유리 지방산 방출로 인한 독성 유발 등과 같은 현상을 일으켜 비만으로 인한 질환의 원인이 된다(Choe 등, 2016).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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