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문제 정의
- 紫草가 P. acnes에 의해 유발된 HaCaT 세포주의 염증 모델에서 IL-8, MCP-1, TNF-α 등의 유전자 발현에 미치는 영향과 NF-κB의 이동에 미치는 영향을 평가하고자 하였다.
- 본 연구에서는 다양한 염증 반응에 효과를 나타내는 紫草 추출물이 여드름의 병태에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 인간의 각질세포주인 HaCaT 세포주의 염증 관련 cytokine 유전자 발현을 측정하였다. 紫草가 P.
제안 방법
- P. acnes 처리 후 HaCaT 세포주에서 유리된 TNF-α 양을 측정하기 위한 ELISA kit은 Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) Human, ELISA kit, pink-one (Koma Biotech, Korea) 제품을 사용하였다.
- 혈액 한천 배지 및 Mülller-Hinton 배지에 피부상재균인 Staphylococcus epidermidis와 여드름 유발균인 P. acnes 균주를 각각 접종하고, 멸균된 8 ㎜ paper disk를 올려놓은 후, 그 위에 1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖ 농도의 紫草 추출물을 50 ㎍/disk로 처리하였다.
- 紫草 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 96-well plate에 HaCaT 세포주를 일정량(1×104/㎖)을 접종하여 24시간 동안 배양하였다.
- 세포 독성을 확인하기 위하여 XTT Reagent (Welgene Inc, Korea)를 사용하였다. 각각의 면역 반응 유발물질들이 처리된 세포 들에서 total RNA는 Trizol reagent (Invitrogen, Germany)를 사용하여 분리하였으며, cytokine 유전자들의 발현 양상을 확인하기 위한 real-time RT-PCR primers는 Table 1에 나타낸 염기서열로 합성하였으며, Master mix는 SYBR Fast qPCR kit ABI prism (KAPA biosystems, USA) 제품을 사용하였다. P.
- /㎖)을 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 초기 배양 후 紫草를 각각 (0, 1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖)의 농도로 처리하여 48 시간동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후 XTT 시약을 각 well에 첨가하고, 2시간 동안 incubator에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도 측정하여 증식된 세포의 수를 비교하여 세포 독성 결과를 확인하였다.
- 초기 배양 후 紫草를 각각 (0, 1, 10, 100, 1000 ㎍/㎖)의 농도로 처리하여 48 시간동안 추가 배양하였다. 추가 배양 후 XTT 시약을 각 well에 첨가하고, 2시간 동안 incubator에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도 측정하여 증식된 세포의 수를 비교하여 세포 독성 결과를 확인하였다.
- 사이토카인 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해 HaCaT 세포주를 6-well plate에 각각의 세포주를 일정량 (2×105/㎖) 접종한 후에 여드름 유발 균주인 P. acnes의 동결건조 분말을 증류수에 100 ㎍/㎖ 의 농도로 용해하여 처리하였다.
- 관찰된 형광이미지를 세포질과 핵질로 구분하여 NF-κB의 intensity를 Zeiss image analysing program으로 정량화하여 비교하였다.
- 각각의 시료에서 세포질 내에서 활성화된 NF-κB의 핵 내부로의 이동(translocation) 여부를 알아보기 위해 mouse monoclonal NF-κB p65(F-6) antibody (Santacruz, sc-8008)를 1차 항체로 사용하고, 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG rhodamine-conjugate antibody (Invitrogen, USA)를 사용하여 공초점 현미경(Confocal microscope; Zeiss, Germany)을 통하여 관찰하였다.
- 시료의 TNF-α 농도는 흡광도에 대한 표준농도곡선을 이용하여 계산하였다.
- 추출한 total RNA 1 ㎍ 을 72℃에서 5분간 변성시킨 후, reverse transcription mixture (5X PrimeScriptTM Buffer, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I, 50 μM Oligo dT Primer, 100 uM Random 6 mers, RNase Free dH2O)에 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA에 대한 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다.
- 처리 농도는 기존의 연구 결과들과 세포 독성 실험 결과를 참고하였다. 紫草 추출물의 처리 농도는 세포 독성 실험 결과에서 대조군에 비해 90% 이상의 증식율을 나타낸 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.
- 각각의 시료에서 추출된 total RNA의 양은 spectrophotometer로 정량하였으며, 그 상태는 2% agarose gel 전기영동 후 18s와 28s rRNA band를 전기영동을 통해 관찰하였다. 추출한 total RNA 1 ㎍ 을 72℃에서 5분간 변성시킨 후, reverse transcription mixture (5X PrimeScriptTM Buffer, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I, 50 μM Oligo dT Primer, 100 uM Random 6 mers, RNase Free dH2O)에 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA에 대한 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다.
- 추출한 total RNA 1 ㎍ 을 72℃에서 5분간 변성시킨 후, reverse transcription mixture (5X PrimeScriptTM Buffer, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I, 50 μM Oligo dT Primer, 100 uM Random 6 mers, RNase Free dH2O)에 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA에 대한 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA 2 ㎕와 각각의 유전자에 대한 primers (Table 1)를 SYBR Fast qPCR kit (KAPA biosystems, USA)와 혼합한 후, Taq polymerase 활성의 최적화를 위해서 50℃에서 2분간, 초기 변성 (denaturation)은 95℃에서 10분간 수행한 후에, 증폭을 위해 95℃에서 15초, 60℃에서 1분의 주기를 40회 반복 시행하였다. 사용된 primer들은 Genebank database를 기준으로 Primer3 프로그램을 이용하여 제작하였다.
- 사용된 primer들은 Genebank database를 기준으로 Primer3 프로그램을 이용하여 제작하였다. cytokine mRNA 발현양은 GAPDH 유전자를 내부대조군(internal control)으로 사용하여 보정을 실시하여 각각의 유전자 발현 양상을 정량적으로 비교하였다. PCR 최종산물을 2% agarose gel 상에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 후관찰하였으며, SYBR green을 이용한 real time PCR 의 신뢰성을 확인하기 위해 melting curve 분석과 단계적 희석(serial dilution) 시료를 이용하여 PCR efficiency를 확인하였다(Fig.
- cytokine mRNA 발현양은 GAPDH 유전자를 내부대조군(internal control)으로 사용하여 보정을 실시하여 각각의 유전자 발현 양상을 정량적으로 비교하였다. PCR 최종산물을 2% agarose gel 상에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 후관찰하였으며, SYBR green을 이용한 real time PCR 의 신뢰성을 확인하기 위해 melting curve 분석과 단계적 희석(serial dilution) 시료를 이용하여 PCR efficiency를 확인하였다(Fig. 1).
- 05% Tween-20이 포함된 PBS를 사용하여 2번 수세하였다. 제조사의 사용방법에 따라 negative control과 positive control 그리고 시료를 96-well plate에 1시간 동안 처리하였으며, 발색 반응 결과를 Genios ELISA reader (Tecan, Switzerland)를 사용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 TNF-α 농도는 흡광도에 대한 표준농도곡선을 이용하여 계산하였다.
- acnes에 대하여 항균 효능을 나타내는지를 알아보기 위해 디스크 확산법을 이용하였다. 보관 중인 P. acnes를 접종하고, 72시간 동안 배양한 후에 디스크 주위에 형성된 억제대를 관찰하였다. 항생제인 erythromycin에서는 억재대의 직경이 10 ㎜ 이상으로 관찰되었으나, 열수 紫草 추출물과 에탄올 紫草 추출물을 처리한 두 가지 처리군의 모든 농도에서 억제대가 관찰되지 않았다(Fig.
- 인간 각질 세포주인 HaCaT를 각 well당 1x104개의 세포를 넣은 후 세포의 부착 및 안정을 위해 24시간 동안 5% CO2 incubator에서 배양한 후 다양한 농도의 紫草 추출물(0, 1, 10, 100, 500, 1,000 ㎍/㎖)을 각각 48시간 동안 처리하였다. 처리한 모든 농도에서 紫草 추출물의 세포독성은 관찰되지 않았다(Fig.
- 이러한 NF-κB의 핵내이동 양상을 정량적으로 분석하였다(Fig. 8).
- 여드름 유발균인 P. acnes와 紫草 추출물을 인간 각질세포인 HaCaT 세포주에 처리하여 염증 관련 cytokine 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 인간 각질세포주인 HaCaT (Human Keratinocyte cell line) 세포주는 아산병원 생명과학 연구소에서, 혐기성 균주인 여드름 유발균주 P. acnes (KCTC 3314)와 피부상재균인 Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917)는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받아 사용하였다.
- 紫草 추출물은 국가지정연구소재은행인 동물생리활성물질자원은행(진주, 경상대학교)에서 70% 에탄올로 추출한 후 동결건조한 상태로 공급받아 100% DMSO로 용해하여 사용하였다. P.
- 紫草 추출물은 국가지정연구소재은행인 동물생리활성물질자원은행(진주, 경상대학교)에서 70% 에탄올로 추출한 후 동결건조한 상태로 공급받아 100% DMSO로 용해하여 사용하였다. P. acnes는 생물자원센터 (KCTC, Korea)에서 분양받아 일정 기간 동안 혐기성 조건에서 배양한 후, 95℃에서 5분간 가열하여 살균하고 동결 건조하여 사용하였다. 동결 건조한 100 ㎎ 의 분말을 칭량하여 10 ㎖의 증류수로 용해하여 세포에 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다.
- 동결 건조한 100 ㎎ 의 분말을 칭량하여 10 ㎖의 증류수로 용해하여 세포에 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 세포 독성을 확인하기 위하여 XTT Reagent (Welgene Inc, Korea)를 사용하였다. 각각의 면역 반응 유발물질들이 처리된 세포 들에서 total RNA는 Trizol reagent (Invitrogen, Germany)를 사용하여 분리하였으며, cytokine 유전자들의 발현 양상을 확인하기 위한 real-time RT-PCR primers는 Table 1에 나타낸 염기서열로 합성하였으며, Master mix는 SYBR Fast qPCR kit ABI prism (KAPA biosystems, USA) 제품을 사용하였다.
- HaCaT 세포주는 DMEM에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/㎖ penicillin과 100 ㎍/㎖ streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2일 마다 교환해 주었으며, 계대배양은 배양 중인 세포들이 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 각 세포주의 기본 배지로 수세한 후 새로운 플라스크에 분주하였다.
데이터처리
- 통계적 분석은 SPSS 17.0 program을 이용하였고, 각각의 유전자 발현 양상과 TNF-α의 분비량에 대한 비교는 One-way ANOVA test를 시행하였다.
- 사후 검증으로 Turkey test를 사용하여 비교하였으며 통계학적인 유의 수준은 p < 0.05로 하였다.
이론/모형
- 紫草의 항균 능력을 평가하기 위해 paper disk diffusion test를 시행하였다. 혈액 한천 배지 및 Mülller-Hinton 배지에 피부상재균인 Staphylococcus epidermidis와 여드름 유발균인 P.
- 紫草 추출물이 여드름 유발균주인 P. acnes에 대하여 항균 효능을 나타내는지를 알아보기 위해 디스크 확산법을 이용하였다. 보관 중인 P.
- 인간 각질세포인 HaCaT 세포주에 여드름을 유발한다고 알려져 있는 균주인 P. acnes와 紫草 추출물을 처리한 후 TNF-α의 배양액으로의 유리 양상을 ELISA 방법으로 분석하였다.
- 염증 관련 사이토카인 mRNA의 발현을 조절하는 전사 인자인 NF-κB의 활성화 양상을 confocal microscopy 방법으로 분석하였다.
- acnes 집락수 감소와 염증반응 억제를 기본 원칙으로 하는데 이 가운데 모낭과다각질화의 교정이 가장 중요하다1). 경구 투약을 통한 전신 치료법으로 isotretinoin, 경구 항생제, 경구 retinoid (vitamin A 유도체), 경구 피임약, spironolactone 등을 사용하고, 국소 도포 치료법으로 면포 용해제, 각질 용해제, 항균제재, 또는 sulfur, resorcinol, salicylic acid 등의 복합제재를 사용하고, 외과적 요법으로 압출 (extraction), 화학적 필링(chemical peeling), 미세박 피술(micro- dermabrasion) 그리고 광치료법 등을 사용한다. 이처럼 여드름에 대한 치료법은 아직 단일 치료법이 없으며 이러한 치료법에는 피부장벽의 약화로 인한 만성적인 피부염, 점막 및 피부 건조, 여드름 관련 균들에 대한 내성 등과 같은 부작용이 동반될 수 있다30-34).
- 염증 관련 cytokine mRNA의 발현을 조절하는 NF-κB의 활성화 양상을 confocal microscopy방법으로 분석하였다.
성능/효과
- 처리한 시료가 배지에 모두 흡수되도록 실온에서 10분간 정치시킨 다음 호기성 또는 혐기성 조건의 37℃ incubator에서 배양하였다. 양성대조군으로 100 ㎍/㎖ 농도의 erythromycin을 이용하여 억제환의 직경이 10 ㎜ 이상인 경우에 항균 효능이 있는 것으로 판정하였다.
- acnes를 접종하고, 72시간 동안 배양한 후에 디스크 주위에 형성된 억제대를 관찰하였다. 항생제인 erythromycin에서는 억재대의 직경이 10 ㎜ 이상으로 관찰되었으나, 열수 紫草 추출물과 에탄올 紫草 추출물을 처리한 두 가지 처리군의 모든 농도에서 억제대가 관찰되지 않았다(Fig. 2).
- 여드름 유발균을 처리하였을 때 증가되는 TNF-α와 IL-8 mRNA가 紫草 추출물을 동시에 처리한 경우에 24시간과 48시간 처리군에서 감소됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).
- 전체 시료들에서 TNF-α 유리 양상은 55.14 pg/㎖에서 86.17 pg/㎖로 다소 차이가 있었으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Fig. 6).
- 대조군에서 NF-κ B의 핵내로의 이동은 45.46%로 관찰되었는데, P. acnes 처리에 의해 NF-κB의 핵내로의 이동이 75.34%로 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig 7).
- 紫草의 P. acnes에 대한 항균 효능을 측정한 결과, 열수 紫草 추출물과 에탄올 紫草 추출물을 처리한 두 가지 처리군의 모든 농도에서 억제대가 관찰되지 않았다(Fig. 2). 본 실험에서는 기존의 연구들에서 보고한 紫草의 항균 작용을 확인할 수 없었는데, 이는 항균 효과가 있는 것으로 알려진 시코닌 성분의 함량이 다소 낮았기 때문으로 생각된다.
- 3). 紫草 추출물 처리에 따른 HaCaT의 형태학적 변화를 관찰한 실험에서는 HaCaT 세포주에 紫草 추출물과 P. acnes를 각각 0, 12, 24, 48시간 동안 처리하였을 때 세포의 형태학적인 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 4).
- 염증성 cytokine인 TNF-α, IL-8, MCP-1의 mRNA 발현 양상을 real-time RT-PCR 방법으로 분석한 결과, 여드름 유발균을 처리하였을 때 증가되는 TNF-α와 IL-8 mRNA가 紫草 추출물을 동시에 처리한 경우에 24시간과 48시간 처리군에서 감소됨을 관찰할 수 있었다.
- 紫草 추출물은 P. acnes에 의해 유발된 염증 관련 cytokine인 IL-8, MCP-1, TNF-α의 mRNA 발현을 억제하는 것으로 나타났으며, TNF-α 단백질의 발현에서도 유사한 영향을 미칠 것으로 예상하였다.
- 그러나 HaCaT 세포의 배양과정에서 배양액으로 유리된 TNF-α 단백질의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과, 각각의 시료들에서 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다(Fig. 6).
- 비활성화 상태의 NF-κB는 세포질에 존재하다가 활성화되면 핵내로 이동하게 되는데, P. acnes에 의해 핵내로 이동되어 활성화된 NF-κB가 紫草 추출물 처리 시 통계적으로 유의하게 핵내로의 이동이 억제되는 것을 관찰하였다(Fig. 7).
- 이러한 NF-κB의 핵내이동 양상을 정량적으로 분석한 결과 P. acnes로 처리한 군에서는 NF-κB의 활성도가 75.34%였으나 여드름 유발균과 紫草 추출물을 동시에 처리한 군에서는 NF-κB의 활성도가 41.02%로 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 8).
- 본 실험에서는 紫草 추출물을 처리하였을 때 P. acnes에 의해 유발되는 전사 인자인 NF-κ B가 핵으로 이동하는 것이 억제되어 염증 관련 cytokine들의 mRNA 발현을 감소시키는 결과를 나타냈다.
- acnes로 자극한 HaCaT 세포주에서 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동을 유의성 있게 억제하는 효능을 나타냈다. 紫草에 의한 염증성 cytokine들의 mRNA 발현 감소 효과는 전사 인자인 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동이 억제되는 것과 관련성이 있음을 확인하였다.
후속연구
- 최근 연구 결과, 紫草는 항염작용 및 TNFα, iNOS 생성 억제효과를 타나냈으며11), 아토피성 피부염을 억제하고12) 비만세포의 알러지 염증반응을 억제하였다13). 따라서 淸熱凉血藥으로서 血熱型 面疱에 사용되는 紫草의 항호르몬활성과 항염, 항균작용9,14)은 호르몬 분비와 P. acnes로 인해 유발되는 여드름 치료에 응용될 수 있을 것으로 판단되었다.
- 본 실험에서는 기존의 연구들에서 보고한 紫草의 항균 작용을 확인할 수 없었는데, 이는 항균 효과가 있는 것으로 알려진 시코닌 성분의 함량이 다소 낮았기 때문으로 생각된다. 그리고 紫草 전초를 이용하여 추출하는 것보다는 紫草의 뿌리만을 사용하여 추출하는 것이 시코닌 성분의 함량을 높일 수 있을 것이다. 또한 항균성물질을 추출할 때 추출온도와 에탄올 농도 그리고 pH변화에 따라서 紫草의 항균력이 차이가 생기므로40) 이에 대한 분석이 필요하리라 생각된다.
- 그리고 紫草 전초를 이용하여 추출하는 것보다는 紫草의 뿌리만을 사용하여 추출하는 것이 시코닌 성분의 함량을 높일 수 있을 것이다. 또한 항균성물질을 추출할 때 추출온도와 에탄올 농도 그리고 pH변화에 따라서 紫草의 항균력이 차이가 생기므로40) 이에 대한 분석이 필요하리라 생각된다.
- 이러한 결과는 피부 각질세포에서 TNF-α의 분비를 조절하는 기작이 관련이 있을 것으로 생각되며 TNF-α의 HaCaT 세포 내에서의 생성과 분비에 대한 분석이 필요할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 통해 紫草는 인간의 각질세포에서 여드름 유발균에 의해 증가되는 염증성 cytokine들의 mRNA 발현 양을 감소시키는 효과와 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동을 억제하는 효과가 있어서 염증성 여드름 치료에 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 실험 결과 紫草는 염증성 여드름 치료에 응용될 수있을 것으로 인정되었는데 紫草는 항염작용 외에 항호르몬활성을 갖고 있어서9,14) 향후 紫草가 갖는 항호르몬활성이 호르몬의 과잉분비로 유발되는 여드름에 미치는 영향에 대한 지속적인 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 통해 紫草는 인간의 각질세포에서 여드름 유발균에 의해 증가된 염증성 cytokine들의 mRNA발현 양을 감소시키는 효과와 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동을 억제하는 효과가 있어서 염증성 여드름 치료에 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
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