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문제 정의
- 본 연구는 GABA 생성능이 우수한 젖산균을 김치에서 분리하고 선발하여 기능성 식품의 스타터로서 적합한지 알아보기 위해 L. plantarum K74의 생리적 특성에 대해 연구하였다.
- 본 연구는 김치로부터 GABA 생성능이 우수한 젖산균을 분리 및 동정하고, 이 균주의 생리적 특성을 규명하여 상업적으로의 이용가능성을 검토하고자 실시하였다. 이를 위해 MSG 2%가 첨가된 MRS broth에 37℃에서 18시간 배양한 후 GABA 함량이 50μg/mL 이상 생산하는 75개의 균주를 1차로 선별하였으며, 90μg/mL 이상 생산하는 5 균주를 2차로 선별하였고, 선발된 5 균주를 MSG 1%, 2% 및 3% 함유된 MRS 배지에 각각 배양한 결과, K74 균주가 최종 선발되었다.
제안 방법
- Gilliland와 Walker(1990)의 방법에 따라 MRS 액체배지 에서 37℃, 18시간 배양된 L. plantarum K74 균주를 0.05% cysteine이 함유된 MRS 액체배지에 0.3% oxgall을 첨가한 배지와 대조구로서 oxgall을 첨가하지 않은 배지에 각각 1% 접종하였다. 37℃의 incubator에서 7시간까지 혐기배양하면서 시간별로 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 37℃에서 48시간 혐기 배양하여 계수하였다.
- L. plantarum K74 균주의 생장은 생균수, pH를 측정하여 시험하였다. 생균수는 10% MRS broth 150 mL에 젖산균을 50μL(9.
- 가정 및 국내산 김치제품 48종이 수집되었다. Modified MRS 배지를 사용하여 노란색 집락을 형성하는 273개의 단일 균락을 분리하였고, 잠정적으로 젖산균이라 추정하였다.
- Table 1의 ①, ②, ③, ④번을 혼합하여 340 nm에서 흡광도 측정(initial A)하고, ⑤ α-KG를 가하여 1시간 동안 실온에서 방치한 후 340 nm에서 흡광도 측정(final A)한 다음 표준 곡선을 그리고(Fig. 1), 측정된 흡광도(final A-initial A)를 대입하여 GABA량을 구하였다.
- 1% peptone 용액에 적정농도로 희석하였다. 각 항생제가 각 농도별로 포함된 tryptic soy 액체배지에 105 ~106 CFU/mL 수준으로 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 육안으로 관찰하여 생장 여부를 결정하였다. 항생제 내성 측정은 2배 희석방법을 사용하였으며, 억제된 가장 낮은 농도를 MIC(Minimal inhibitory concentration) 값으로 결정하였다.
- Species를 정하기 위하여 API 50CHL kit(BioMereux, France)를 이용하여 49종의 당 발효 시험을 실시한 결과(Table 3), K74는 lactose 등 19종으로부터 산을 생성하였다. 그 결과를 ATB identification system에 입력한 결과, Lactobacillus plantarum으로 판명되었으며, 16S rRNA 유전자 부분을 universal primer를 이용한 PCR로 증폭하여 서열 분석하였다. 분석된 염기서열을 그대로 이용하여 BLAST search한결과, L.
- 분리된 젖산균을 대상으로 monosodium glutamate 2%가 첨가된 MRS broth에 37℃에서 18시간 배양한 후 GABA 함량이 50μg/mL 이상 생산하는 균주가 75 균주, 90μg/mL 이상 생산하는 균주가 5 균주 선발되었고, MSG 1%, 2% 및 3% 함유된 MRS 배지에 각각 배양한 결과는 Table 2와 같다.
- 생균수는 10% MRS broth 150 mL에 젖산균을 50μL(9.6×105 CFU/mL)를 접종한 후 34, 37, 40℃에서 3시간 간격으로 24시간까지 배양한 각 시료를 0.1% peptone 용액에 희석하여 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 37℃에서 48시간 배양하여 계수하였고, 온도 및 시간별로 pH 변화를 측정하였다.
- 증폭과정은 95℃, 15분을 한 후 95℃, 20초; 50℃, 40초; 72℃, 1분 30초를 30회 시행하였으며, 72℃, 5분으로 마무리 하였다. 서열 분석은 PCR product를 solgent PCR purification kit(SolGent, Korea)로 purify한 후 ABI 3730XL DNA sequencer(Applied Biosystems, USA)로 자동 분석하였다.
- 선발된 K74의 genus와 species를 결정하기 위하여 생리적, 생화학적 시험을 하였다. 선발된 K74는 Gram 양성을 나타내었고, 현미경으로 관찰 시 rod 형태의 hetero균이며, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하였고, catalase와 운동성은 음성으로 나타났다.
- 젖산균의 동정은 Hammes 등(1992)의 방법에 의하여 실시하였다. 순수 분리된 균주는 Gram 염색, 포자생성, 호기적 및 혐기적 생장, Catalase 생성, 15℃ 및 45℃에서의 생장, glucose 로부터 가스 생성, arginine으로부터 ammonia 생성, 현미경 관찰과 API 50CHL kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 당 발효 실험을 실시하였다. 젖산균의 DNA sequence는 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, solgent EF-Taq을 사용하여 PCR을 실시하였다.
- 이를 위해 MSG 2%가 첨가된 MRS broth에 37℃에서 18시간 배양한 후 GABA 함량이 50μg/mL 이상 생산하는 75개의 균주를 1차로 선별하였으며, 90μg/mL 이상 생산하는 5 균주를 2차로 선별하였고, 선발된 5 균주를 MSG 1%, 2% 및 3% 함유된 MRS 배지에 각각 배양한 결과, K74 균주가 최종 선발되었다.
- 젖산균의 DNA sequence는 universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, solgent EF-Taq을 사용하여 PCR을 실시하였다.
- 증폭과정은 95℃, 15분을 한 후 95℃, 20초; 50℃, 40초; 72℃, 1분 30초를 30회 시행하였으며, 72℃, 5분으로 마무리 하였다.
- 각 항생제가 각 농도별로 포함된 tryptic soy 액체배지에 105 ~106 CFU/mL 수준으로 접종하여 37℃에서 48시간 배양한 후 육안으로 관찰하여 생장 여부를 결정하였다. 항생제 내성 측정은 2배 희석방법을 사용하였으며, 억제된 가장 낮은 농도를 MIC(Minimal inhibitory concentration) 값으로 결정하였다. 항생제는 Sigma Chemical Co.
- 효소활성은 표준색상표를 비교하여 0~5의 수치로 표시하였으며, 대조구 이외의 alkaline phosphatase, eterase(C4), esterase lipase(C8), lipase(C14), leucine arylamidase, valine arylamidase, cystine arylamidase, trypsin, chymotrypsin, acid phosphatase, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, α-galactosidase, β-galactosidase, β-glucuronidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase, β-fucosidase 효소의 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- Gilliland와 Speck(1977)의 방법에 따라 항균력 측정에 사용한 지시균인 Escherichia coli, Salmonella typhimurium 및 Staphyloccous aureus는 한국식품연구원으로부터 분양받았 으며, 지시균의 증식배지로서 Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphyloccous aureus는 nutriunt 액체배지에서 호기적으로 37℃, 24시간 배양하였다. 혼합배양 및 대조군에 사용된 배지는 MRS 액체배지로서 젖산균과 지시균을 각각 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
- 젖산균 분리를 위해 가정 및 국내산 김치제품 48종이 수집되었다. K74 균주는 modified MRS medium(Lim et al.
- 분리 · 선정된 K74 균주는 MRS 액체배지에서 2회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 실험에 사용하였다.
- 젖산균 분리를 위해 가정 및 국내산 김치제품 48종이 수집되었다. K74 균주는 modified MRS medium(Lim et al.
- (USA)로부터 구매하여 사용하였다. 항생제는 Amikacin, Gentamicin, Kanamycin, Neomycin, Streptomycin, Penicillin-G, Methicillin, Oxacillin, Ampicillin, Bacitracin, Rifampicin, Novobiocin, Lincomycin, Polymyxin B, Chloramphenicol 및 Vancomycin을 시험에 사용하였다.
데이터처리
- 결과는 평균±표준편차(SD)로 나타내고, 통계분석은 Statistical Package for Social Sciences(SPSS, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)로 실시하였다.
- 유의차는 one-way ANOVA로 통계처리하였고, Duncan’s multiple range tests를 사용하여 유의성 5% 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- Clark 등(1993)의 방법에 따라 37% HCl을 증류수에 섞어 pH 2, 3, 4 용액과 대조구로서 pH 6.4 용액을 제조하였고, 제조된 pH 용액 10 mL에 0.05% cysteine이 함유된 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 배양된 L. plantarum K74 균주 (약 109 CFU/mL)를 1 mL씩 섞은 후 37℃에서 혐기 배양하면서 0, 1, 2, 3시간 후의 생균수를 BCP plate count agar 평판에서 부어 굳힌 후 37℃에서 48시간 혐기 배양한 다음 계수하였다.
- GABA 정량은 Zhang과 Bown(1997)의 방법을 사용하였다. 분리된 균주를 L-glutamic acid(MSG)가 첨가된 MRS 배지에서 37℃, 18시간 배양시킨 뒤에 eppendorf tube에 시료 100 μL와 methanol 400μL를 넣고 잘 섞은 다음 60~70℃로 예열된 water bath에서 완전 견고(약 30분 소요)시켰다.
- 분리 · 선정된 K74 균주는 MRS 액체배지에서 2회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 실험에 사용하였다. 젖산균의 동정은 Hammes 등(1992)의 방법에 의하여 실시하였다. 순수 분리된 균주는 Gram 염색, 포자생성, 호기적 및 혐기적 생장, Catalase 생성, 15℃ 및 45℃에서의 생장, glucose 로부터 가스 생성, arginine으로부터 ammonia 생성, 현미경 관찰과 API 50CHL kit(API bioMerieux, France)를 이용하여 당 발효 실험을 실시하였다.
성능/효과
- 7시간 동안 배양 후 생균수가 0.3% oxgall을 첨가하지 않았을 때는 4.4×108 CFU/mL, 0.3% oxgall을 첨가하였을 때는 1.3×108 CFU/mL로 약간 억제를 받기는 하였으나, 담즙 내성이 있는 것으로 나타났다.
- Fig. 3에서 보는 바와 같이 L. plantarum K74의 최적 생장온도를 알기 위하여 MRS broth 150 mL에 젖산균 배양액을 10μL 접종한 후 34℃, 37℃, 40℃별로 3시간 간격으로 24시간까지 배양시험한 결과, Lactobacillus plantarum K74는 34℃와 37℃에서 거의 차이가 없었으나, 34℃가 약간 빠른 생장률을 보였다.
- K74 균주는 MSG 1%가 첨가된 MRS broth에서 GABA 함량이 134.52μg/mL이었고, MSG 2%와 3%가 첨가된 MRS broth에서 GABA 함량이 각각 212.27μg/mL와 234.63 μg/mL이었으며, 동정 결과 L. plantarum K74라고 명명되었다.
- K74 균주는 MSG 1%가 첨가된 MRS broth에서 GABA 함량이 134.52μg/mL이었고, MSG 2%와 3%가 첨가된 MRS broth에서 GABA 함량이 각각 212.27μg/mL와 234.63μg/mL 를 나타내어 다른 네 균주에 비해 GABA 함량이 가장 높았다.
- plantarum K74가 식중독균에 대해 어느 정도 억제하는지를 측정하기 위해 혼합배양을 실시한 결과는 Table 6과 같다. L. plantarum K74는 Escherichia coli와 Salmonella typhimurium에 대해 각각 54.9%와 46.3%로서 억제효과가 큰 반면, Staphyloccous aureus에 대해 0.7%로서 억제효과가 거의 없는 것으로 나타났다. 배양 후 pH의 변화를 보았을 때 대조구인 식중독균은 pH 6.
- L. plantarum K74는 또한 답즙산과 산성의 pH에서 모두 우수한 생존력을 나타냈으며, 발암효소인 β-glucuronidase를 생성하지 않고 유당분해효소인 β-galactosidase를 약간 생성하는 것으로 나타났다.
- plantarum K74의 효소활성 결과는 Table 5에서 보는 바와 같다. Leucine arylamidase와 Cystine arylamidase는 2를 나타내 효소활성이 다른 효소들에 비해 높게 나타났으나, 전반적으로 효소활성이 높지 않은 것으로 나타났다. 특히, 유당을 glucose와 galactose로 분해시키는 유당분해효소인 β-galactosidase가 1을 나타내었다.
- OPK2-59를 스타터로 사용하고, MSG를 첨가한 김치의 GABA 함량이 180 mg/kg인 것과 Tung 등(2011)이 김치에서 분리한 L. plantarum NTU 102를 0.6% MSG를 첨가한 8%의 skim milk 배지에서 24시간 발효시킨 결과, GABA 함량이 33μg/mL인 것과 비교하였을 때 K74 균주는 우수한 GABA 생성능을 보였다.
- 45℃에서 생장하는 반면, 15℃에서는 생장하지 않았으며, glucose와 arginine으로부터 각각 gas와 암모니아를 생성하지 않아 genus Lactobacillus에 속하였다. Species를 정하기 위하여 API 50CHL kit(BioMereux, France)를 이용하여 49종의 당 발효 시험을 실시한 결과(Table 3), K74는 lactose 등 19종으로부터 산을 생성하였다. 그 결과를 ATB identification system에 입력한 결과, Lactobacillus plantarum으로 판명되었으며, 16S rRNA 유전자 부분을 universal primer를 이용한 PCR로 증폭하여 서열 분석하였다.
- 6에서 보는 바와 같다. 대조구인 pH 6.4에서의 균수와 비교한 결과, L. plantarum K74 균주는 pH 2에서 0시간에는 생존율이 77%이던 것이 3시간 이후에는 38.5% 로 감소하였고, pH 3에서는 0시간에 100%이던 생존율이 3 시간 이후에 72.8%로 감소하였으며, pH 4에서는 생존율 감소를 보이지 않았다. You 등(2005)에 따르면 Kefir에서 분리한 Lactobacillus rhamnosus는 pH 2에서 35%로 감소한 결과와 비교해 보았을 때 L.
- 또한 Benzopyrene을 발암성 물질로 전환시키는 발암효소인 β-glucuronidase의 경우에는 효소활성이 0으로 나타나, 안정된 젖산균임을 알 수가 있었다.
- 반면 Novobiocin에 대한 항생제 내성의 MIC 농도는 7.5μg/mL로서 가장 감수성이 높았고, Bacitracin, Penicillin-G, Methicillin 등도 감수성이 높은 것으로 나타났다.
- Daeschel(1989)과 Havinaar 등(1992)은 pH 강하, 산화 환원 전위의 감소, 유해균과의 경쟁적 영양성분 소비, 과산화수소의 생성, 젖산균이 생산하는 유기산과 박테리오신의 살균 작용과 강한 항균활성물질 분비에 의해 젖산균의 항균효과가 나타낸다고 보고하였다. 본 실험에서 L. plantarum K74에 의한 Escherichia coli와 Salmonella typhimurium의 생육 억제는 이러한 억제 요소들의 작용에 기안 하는 것으로 사료된다.
- 그 결과를 ATB identification system에 입력한 결과, Lactobacillus plantarum으로 판명되었으며, 16S rRNA 유전자 부분을 universal primer를 이용한 PCR로 증폭하여 서열 분석하였다. 분석된 염기서열을 그대로 이용하여 BLAST search한결과, L. plantarum(I.D. 99%)으로 동정되었고, 계통수를 Fig. 2에 나타내었으며, Lactobacillus plantarum K74로 명명하였다.
- 선발된 K74의 genus와 species를 결정하기 위하여 생리적, 생화학적 시험을 하였다. 선발된 K74는 Gram 양성을 나타내었고, 현미경으로 관찰 시 rod 형태의 hetero균이며, 산소 유무와 상관없이 잘 생장하였고, catalase와 운동성은 음성으로 나타났다. 45℃에서 생장하는 반면, 15℃에서는 생장하지 않았으며, glucose와 arginine으로부터 각각 gas와 암모니아를 생성하지 않아 genus Lactobacillus에 속하였다.
- plantarum K74는 또한 답즙산과 산성의 pH에서 모두 우수한 생존력을 나타냈으며, 발암효소인 β-glucuronidase를 생성하지 않고 유당분해효소인 β-galactosidase를 약간 생성하는 것으로 나타났다. 항생제 내성 실험 결과 Kanamycin, Polymyxin B, Streptomycin에 내성을 Novobiocin, Bacitracin, Penicillin-G, Methicillin에 감수성을 나타냈으며, Escherichia coli와 Salmonella typhimurium에 각각 54.9%와 46.3%의 억제 효과를 지니고 있고, Staphyloccous aureus에 대해서는 거의 억제 효과가 없는 것으로 나타났다.
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