16S rRNA를 이용한 다금바리, 자바리, 능성어 판별법 개발 Development of Detection Method for Niphon spinosus, Epinephelus bruneus, and Epinephelus septemfasciatus using 16S rRNA Gene원문보기
다금바리, 자바리 및 능성어는 농어목(Perciformes Order) 바리과(Serranidae Family)에 속하며, 고급횟감으로 인기가 높은 어종이다. 자바리 및 능성어의 경우 몸통부분에 줄무늬가 선명하게 있으나 성어가 되면서 점차 불분명해지는 특징이 있어 무늬의 유무로 인하여 다금바리와 구별하기는 쉽지 않다. 또한 자바리는 제주도에서 다금바리라는 명칭으로 불리고 있으며, 일부 유통업자들이 자바리 및 능성어를 다금바리로 유통시키는 사례가 있어 종 특이 프라이머를 이용한 판별법을 마련하게 되었다. 종 특이 프라이머를 설계하기 위하여 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어있는 다금바리(Accession No. AY947575), 자바리(Accession No. JN603832), 능성어(Accession No. AY947559), 우럭(Accession No. DQ678295) 등의 16S DNA부위의 염기서열을 대상으로 하였으며 비교 및 분석에는 소프트웨어인 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다. 그 결과 다금바리, 자바리, 능성어를 판별할 수 있는 각각의 NS-003-F/NS-005-R(136 bp), EB-001-F/EB-002-R(181 bp), ES-001-F/ES-001-R(123 bp) 프라이머를 개발하였으며, PCR 조건을 확립하였다. 또한 적용성 검토를 위하여 우럭, 참돔을 대상으로 실시한 결과 비 특이적 밴드가 형성되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발된 다금바리 등에 대한 판별법은 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 식품안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
다금바리, 자바리 및 능성어는 농어목(Perciformes Order) 바리과(Serranidae Family)에 속하며, 고급횟감으로 인기가 높은 어종이다. 자바리 및 능성어의 경우 몸통부분에 줄무늬가 선명하게 있으나 성어가 되면서 점차 불분명해지는 특징이 있어 무늬의 유무로 인하여 다금바리와 구별하기는 쉽지 않다. 또한 자바리는 제주도에서 다금바리라는 명칭으로 불리고 있으며, 일부 유통업자들이 자바리 및 능성어를 다금바리로 유통시키는 사례가 있어 종 특이 프라이머를 이용한 판별법을 마련하게 되었다. 종 특이 프라이머를 설계하기 위하여 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어있는 다금바리(Accession No. AY947575), 자바리(Accession No. JN603832), 능성어(Accession No. AY947559), 우럭(Accession No. DQ678295) 등의 16S DNA부위의 염기서열을 대상으로 하였으며 비교 및 분석에는 소프트웨어인 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다. 그 결과 다금바리, 자바리, 능성어를 판별할 수 있는 각각의 NS-003-F/NS-005-R(136 bp), EB-001-F/EB-002-R(181 bp), ES-001-F/ES-001-R(123 bp) 프라이머를 개발하였으며, PCR 조건을 확립하였다. 또한 적용성 검토를 위하여 우럭, 참돔을 대상으로 실시한 결과 비 특이적 밴드가 형성되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발된 다금바리 등에 대한 판별법은 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 식품안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
Niphon spinosus, Epinephelus bruneus, and Epinephelus septemfasciatus are involved in the Perciformes Order and Serranidae Family. When E. bruneus and E. septemfasciatus are fully grown, the striped pattern on the body gradually disappears. Therefore, morphological classification of adult fishes is ...
Niphon spinosus, Epinephelus bruneus, and Epinephelus septemfasciatus are involved in the Perciformes Order and Serranidae Family. When E. bruneus and E. septemfasciatus are fully grown, the striped pattern on the body gradually disappears. Therefore, morphological classification of adult fishes is quite difficult to identify the differences to N. spinosus. In this study, we investigate the method to differentiate those using PCR. To design the primers, 16S rRNA region of N. spinosus, E. bruneus, and E. septemfasciatus registered in the GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) have been used and for the analysis, Bio Edit ver. 7.0.9.0 was used. As a result, it was design NS-003-F/NS-005-R (136 bp), EB-001-F/EB-002-R (181 bp), and ES-001-F/ES-001-R (123 bp) primers for the differentiation of each 3 different fishes. Therefore, the species-specific primer sets would be a useful tool for scientific and speedy differentiation against the illegal distribution for consumer protection.
Niphon spinosus, Epinephelus bruneus, and Epinephelus septemfasciatus are involved in the Perciformes Order and Serranidae Family. When E. bruneus and E. septemfasciatus are fully grown, the striped pattern on the body gradually disappears. Therefore, morphological classification of adult fishes is quite difficult to identify the differences to N. spinosus. In this study, we investigate the method to differentiate those using PCR. To design the primers, 16S rRNA region of N. spinosus, E. bruneus, and E. septemfasciatus registered in the GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) have been used and for the analysis, Bio Edit ver. 7.0.9.0 was used. As a result, it was design NS-003-F/NS-005-R (136 bp), EB-001-F/EB-002-R (181 bp), and ES-001-F/ES-001-R (123 bp) primers for the differentiation of each 3 different fishes. Therefore, the species-specific primer sets would be a useful tool for scientific and speedy differentiation against the illegal distribution for consumer protection.
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문제 정의
또한 자바리는 제주도에서는 다금바리라는 명칭을 사용하고 있고 자바리는 양식이 가능하지만 다금바리의 경우 양식이 어렵고 심해성 어류라 고기잡이가 어려워 실질적으로 제주도 지역에서 횟감으로 제공되는 다금바리는 대부분이 자바리라는 의견도 있다. 따라서 본 연구에서는 다금바리로 유통가능성이 높은 어종인 자바리와 능성어를 판별하는 시험법을 개발하게 되었다.
제안 방법
DNeasy Blood & Tissue kit를 사용하여 유전자를 추출하였으며 추출방법은 제조사에서 제공하는 방법에 따랐으며 최종 용출 단계에서는 AE 완충용액 대신 멸균증류수를 사용하여 용출하였다.
2. Nucleotide alignment and primer information designed from 16S gene of E. bruneus (Accession No. JN603832), N. spinosus (Accession No. AY947575), and E. septemfasciatus (Accession No. AY947559) for detection of E. bruneus. The underline and italic sequence indicate designed primer site.
3. Nucleotide alignment and primer information designed from 16S gene of E. septemfasciatus (Accession No. AY947559), N. spinosus (Accession No. AY947575), and E. bruneus (Accession No. JN603832) for detection of E. septemfasciatus. The underline and italic sequence indicate designed primer site.
1. Nucleotide alignment and primer information designed from 16S gene of N. spinosus (Accession No. AY947575), E. bruneus (Accession No. JN603832), E. septemfasciatus(Accession No. AY947559), S. hubbsi (Accession No. DQ678295) for detection of N. spinosus. The underline and italic sequence indicate designed primer site.
PCR 장비는 GeneAmpTM PCR System 9700(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였으며, 유전자 추출은 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다.
PCR을 위한 반응액의 조성은 주형 DNA 50 ng, dNTPs 200 µM, MgCl2 2.5 mM, 프라이머 각 0.5 µM이 되게 혼합하였으며 최종 용량은 20 µL로 하였다.
3), 설계된 프라이머에 대한 정보는 Table 1에 기술하였다. 그리고 가공식품에 대하여 적용이 가능하도록 하기 위하여 PCR 산물의 크기는 가급적으로 200 bp 이내가 되도록 설계하였다.
2). 능성어에 대하여는 1종류(ES-001-F/ES-001-R)의 프라이머를 설계 하였으며(Fig. 3), 설계된 프라이머에 대한 정보는 Table 1에 기술하였다. 그리고 가공식품에 대하여 적용이 가능하도록 하기 위하여 PCR 산물의 크기는 가급적으로 200 bp 이내가 되도록 설계하였다.
5 µM이 되게 혼합하였으며 최종 용량은 20 µL로 하였다. 다금바리 판별을 위한 PCR 반응조건은 95℃에서 5분 예비가열 후, 95℃ 30초 변성, 57℃ 30초 재결합, 72℃ 30초 중합반응 등의 과정을 35회 반복하고 마지막에 72℃에서 7분간 처리하였으며, 자바리 및 능성어 판별 조건은 95℃에서 5분 예비가열 후, 95℃ 30초 변성, 60℃ 30초 재결합, 72℃ 30초 중합반응 등의 과정을 35회 반복하고 마지막에 72℃에서 7분간 처리하였다.
다금바리에 대한 종 특이 프라이머를 개발하기 위하여 1차적으로 다금바리, 자바리 및 능성어의 16S 유전자를 대상으로 프라이머를 설계하였으며 설계된 프라이머를 이용하여 다금바리, 자바리, 능성어를 대상으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 모든 프라이머에서 다금바리는 명확하게 PCR 산물이 생성되었으나 자바리와 능성어에서는 미약한 비 특이적 밴드가 형성되는 경우도 있었다.
DQ678295)의 16S DNA 염기서열을 이용하였다. 다금바리에 대한 특이 프라이머를 설계하기 위하여 정방향 3종(NS-001-F, NS002-F 및 NS-003-F)과 역방향 3종(NS-003-R, NS-004-R 및 NS005-R)을 설계하여 총 8종류(NS-001-F/NS-003-R, NS-001-F/NS004-R, NS-001-F/NS-005-R, NS-002-F/NS-003-R, NS-002-F/NS004-R, NS-002-F/NS-005-R, NS-003-F/NS-004-R, NS-003-F/NS005-R)의 조합이 이루어지도록 하였다(Fig. 1). 자바리의 경우에도 다금바리와 유사한 방법을 통하여 정방향 2종(EB-001-F 및 EB-002-F)과 역방향 2종(EB-002-R 및 EB-003-R)을 설계하여 총 3종류(EB-001-F/EB-002-R, EB-001-F/EB-003-R 및 EB-002-F/EB003-R)의 조합이 이루어지도록 하였다(Fig.
따라서 다금바리, 자바리, 능성어 및 우럭의 16S 유전자를 대상으로 비교·분석하여 총 8종류의 프라이머를 재설계하였다.
자바리 판별을 위한 프라이머는 총 2종을 설계하였으며, 자바리 등 5종의 어종을 대상으로 적용성을 검토하였다. 그 결과 EB002-F/EB-003-R(149 bp) 보다는 EB-001-F/EB-002-R(181 bp) 프라이머가 비 특이적 밴드가 없이 자바리만 검출할 수 있는 프라이머로 최종 선정하였다(Fig.
1). 자바리의 경우에도 다금바리와 유사한 방법을 통하여 정방향 2종(EB-001-F 및 EB-002-F)과 역방향 2종(EB-002-R 및 EB-003-R)을 설계하여 총 3종류(EB-001-F/EB-002-R, EB-001-F/EB-003-R 및 EB-002-F/EB003-R)의 조합이 이루어지도록 하였다(Fig. 2). 능성어에 대하여는 1종류(ES-001-F/ES-001-R)의 프라이머를 설계 하였으며(Fig.
능성어의 경우 염기서열의 비교분석을 통하여 프라이머를 설계하는 위치가 매우 제한적이었다. 즉 상동성이 비교적 높고 설계를 위한 부위는 2곳으로 압축되어 1종류의 프라이머(ES-001-F/ES-001-R) 만을 설계하였다. 그러나 비교종과의 적용성을 검토한 결과 다금바리, 자바리, 우럭, 참돔에서는 비 특이적 밴드가 전혀 형성되지 않고 능성어에서만 123 bp의 PCR 산물이 생성되는 것을 확인하였다(Fig.
최종산물의 확인은 반응액 3 µL를 취하여 아가로즈 젤로 100 V, 30분간 전기영동하고 EtBr로 염색(1 µg/mL)한 후 UV투영기를 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
자바리 판별을 위한 프라이머는 총 2종을 설계하였으며, 자바리 등 5종의 어종을 대상으로 적용성을 검토하였다. 그 결과 EB002-F/EB-003-R(149 bp) 보다는 EB-001-F/EB-002-R(181 bp) 프라이머가 비 특이적 밴드가 없이 자바리만 검출할 수 있는 프라이머로 최종 선정하였다(Fig. 4). 능성어의 경우 염기서열의 비교분석을 통하여 프라이머를 설계하는 위치가 매우 제한적이었다.
다금바리 등의 종 특이 프라이머를 설계하기 위하여 유전자은행에 등록되어 있는 다금바리(N. spinosus, Accession No. AY947575), 자바리(E. bruneus, Accession No. JN603832), 능성어(E. septemfasciatus, Accession No. AY947559), 우럭(S. hubbsi, Accession No. DQ678295)의 16S DNA 염기서열을 이용하였다. 다금바리에 대한 특이 프라이머를 설계하기 위하여 정방향 3종(NS-001-F, NS002-F 및 NS-003-F)과 역방향 3종(NS-003-R, NS-004-R 및 NS005-R)을 설계하여 총 8종류(NS-001-F/NS-003-R, NS-001-F/NS004-R, NS-001-F/NS-005-R, NS-002-F/NS-003-R, NS-002-F/NS004-R, NS-002-F/NS-005-R, NS-003-F/NS-004-R, NS-003-F/NS005-R)의 조합이 이루어지도록 하였다(Fig.
미국 국립보건원에서 운영하는 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어있는 다금바리(Accession No. AY947575), 자바리(Accession No. JN603832), 능성어(Accession No. AY947559), 우럭(Accession No. DQ678295) 등의 16S ribosomal RNA부위에 대한 염기서열을 대상으로 하였으며 비교 및 분석에는 소프트웨어인 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다.
따라서 다금바리, 자바리, 능성어 및 우럭의 16S 유전자를 대상으로 비교·분석하여 총 8종류의 프라이머를 재설계하였다. 설계된 프라이머를 이용하여 다금바리 등 5종을 대상으로 PCR을 수행한 결과 비특이적 밴드가 형성되지 않고 우럭에서도 동일위치에서 밴드가 형성되지 않는 프라이머인 NS-003-F/NS-005-R(136 bp)을 최종 선정하였으며 PCR 조건을 확립하였다(Fig. 4).
유전자증폭(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 위한 프라이머 및 Taq DNA polymerase는 바이오니아(Bioneer, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성 또는 구매하였다. PCR 장비는 GeneAmpTM PCR System 9700(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였으며, 유전자 추출은 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다.
또한 자바리는 제주도에서 다금바리라는 명칭으로 불리고 있으며, 일부 유통업자들이 자바리 및 능성어를 다금바리로 유통시키는 사례가 있어 종 특이 프라이머를 이용한 판별법을 마련하게 되었다. 종 특이 프라이머를 설계하기 위하여 유전자은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어있는 다금바리(Accession No. AY947575), 자바리(Accession No. JN603832), 능성어(Accession No. AY947559), 우럭 (Accession No. DQ678295) 등의 16S DNA부위의 염기서열을 대상으로 하였으며 비교 및 분석에는 소프트웨어인 BioEdit ver. 7.0.9.0 프로그램을 사용하였다. 그 결과 다금바리, 자바리, 능성어를 판별할 수 있는 각각의 NS-003-F/NS-005-R(136 bp), EB001-F/EB-002-R(181 bp), ES-001-F/ES-001-R(123 bp) 프라이머를 개발하였으며, PCR 조건을 확립하였다.
PCR 장비는 GeneAmpTM PCR System 9700(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였으며, 유전자 추출은 DNeasy Blood & Tissue kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 사용하였다. 표준시료인 다금바리(N. spinosus) 및 자바리(E. bruneus)는 제주대학교(해양의생명과학부)로부터 분양받았으며, 능성어(E. septemfasciatus), 참돔(Pagrus major) 및 우럭(Sebastes hubbsi)은 수산시장에서 직접 구입하였다.
성능/효과
0 프로그램을 사용하였다. 그 결과 다금바리, 자바리, 능성어를 판별할 수 있는 각각의 NS-003-F/NS-005-R(136 bp), EB001-F/EB-002-R(181 bp), ES-001-F/ES-001-R(123 bp) 프라이머를 개발하였으며, PCR 조건을 확립하였다. 또한 적용성 검토를 위하여 우럭, 참돔을 대상으로 실시한 결과 비 특이적 밴드가 형성되지 않는 것을 확인하였다.
다금바리에 대한 종 특이 프라이머를 개발하기 위하여 1차적으로 다금바리, 자바리 및 능성어의 16S 유전자를 대상으로 프라이머를 설계하였으며 설계된 프라이머를 이용하여 다금바리, 자바리, 능성어를 대상으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 모든 프라이머에서 다금바리는 명확하게 PCR 산물이 생성되었으나 자바리와 능성어에서는 미약한 비 특이적 밴드가 형성되는 경우도 있었다. 그리고 일반적으로 횟감으로 많이 섭취하는 우럭과 참돔을 대상으로 동일한 실험을 실시한 결과 우럭에서 비슷한 위치에서 지속적으로 밴드가 형성되었다.
그리고 일반적으로 횟감으로 많이 섭취하는 우럭과 참돔을 대상으로 동일한 실험을 실시한 결과 우럭에서 비슷한 위치에서 지속적으로 밴드가 형성되었다. 그래서 우럭의 16S 유전자를 분석한 결과 다금바리는 자바리와 능성어에 비하여 오히려 우럭과의 상동성이 비교적 높은 것을 확인하였다(Fig. 1). 따라서 다금바리, 자바리, 능성어 및 우럭의 16S 유전자를 대상으로 비교·분석하여 총 8종류의 프라이머를 재설계하였다.
즉 상동성이 비교적 높고 설계를 위한 부위는 2곳으로 압축되어 1종류의 프라이머(ES-001-F/ES-001-R) 만을 설계하였다. 그러나 비교종과의 적용성을 검토한 결과 다금바리, 자바리, 우럭, 참돔에서는 비 특이적 밴드가 전혀 형성되지 않고 능성어에서만 123 bp의 PCR 산물이 생성되는 것을 확인하였다(Fig. 4).
그 결과 다금바리, 자바리, 능성어를 판별할 수 있는 각각의 NS-003-F/NS-005-R(136 bp), EB001-F/EB-002-R(181 bp), ES-001-F/ES-001-R(123 bp) 프라이머를 개발하였으며, PCR 조건을 확립하였다. 또한 적용성 검토를 위하여 우럭, 참돔을 대상으로 실시한 결과 비 특이적 밴드가 형성되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발된 다금바리 등에 대한 판별법은 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 식품안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
후속연구
가짜식품의 경우 식품위생법 제 42조 품질관리 및 보고(7)에 의한 “품목제조보고관리대장”을 확인하는 서류검토, 관능 및 육안 분석 등에 의하여 사용원료의 진위여부를 확인할 수 있으나 과학적이고 객관적인 시험법의 개발이 요구된다.
또한 적용성 검토를 위하여 우럭, 참돔을 대상으로 실시한 결과 비 특이적 밴드가 형성되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발된 다금바리 등에 대한 판별법은 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 식품안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
따라서 본 연구에서는 종 특이 프라이머를 이용한 다금바리, 자바리, 능성어를 판별하기 위한 최적의 프라이머와 PCR 조건을 확립하였으며, 확립된 시험법은 자바리, 능성어로부터 다금바리를 판별하여 건전한 식품유통 질서를 확립하고 소비자를 보호하는 식품안전관리에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
가짜식품은 무엇인가?
값싼 식품원료를 사용하거나 표시사항을 허위로 기재하여 소비자를 기만하는 경우가 많아 소비자는 식품에 대한 막연한 불안감이 높아지고 있다. 가짜식품(EMA, economically motivated adulteration)이란 경제적 이득을 취하기 위하여 제조된 식품을 일반적으로 말한다. 가짜식품은 경우에 따라 우리의 건강을 위협할 뿐 아니라 건전한 식품유통 질서를 어지럽히는 주범으로 우리나라에서도 외국처럼 이들 식품에 대한 관리, 감독을 강화해 나가야 할 시점이다.
다금바리의 경우 주로 어디서 서식하는가?
국내·외의 주요 사례로는 돼지고기에 소고기 향을 첨가한 소고기 장조림, 메기내장을 사용한 창난젓, 무게를 늘리기 위하여 양파 또는 무를 혼합한 다진마늘, 틸라피아를 이용한 도미초밥, 옥수수기름을 혼합한 참기름 등이 대표적이다. 다금바리(Niphon spinosus), 자바리(Epinephelus bruneus) 및 능성어(Epinephelus septemfasciatus)는 농어목(Perciformes order) 바리과(Serranidae family)에 속하며 다금바리의 경우 제주도 남방해역에서 주로 서식하며 제주도에서는 매우 인기가 높고 고가로 판매되고 있는 어종이다(4). 다금바리와 자바리의 경우 미성숙어일 경우 주둥아리, 꼬리지느러미, 몸통의 무늬 등에서 차이점이 있지만 성어로 되면서 이러한 특징들이 서서히 희미해져서 육안으로 관찰이 어려울 수도 있다.
가짜식품에 관한 국내외 주요 사례는 무엇이 있는가?
미국 식품의약품청(FDA, Food and Drug Administration), 영국 식품기준청(FSA, Food Standards Agency), 캐나다 국경관리청(CBSA, Canada Border Services Agency)에서도 최근에 늘어나는 가짜식품, 가짜 의약품, 가짜 화장품 등에 대한 관리를 강화하고 있다(1-3). 국내·외의 주요 사례로는 돼지고기에 소고기 향을 첨가한 소고기 장조림, 메기내장을 사용한 창난젓, 무게를 늘리기 위하여 양파 또는 무를 혼합한 다진마늘, 틸라피아를 이용한 도미초밥, 옥수수기름을 혼합한 참기름 등이 대표적이다. 다금바리(Niphon spinosus), 자바리(Epinephelus bruneus) 및 능성어(Epinephelus septemfasciatus)는 농어목(Perciformes order) 바리과(Serranidae family)에 속하며 다금바리의 경우 제주도 남방해역에서 주로 서식하며 제주도에서는 매우 인기가 높고 고가로 판매되고 있는 어종이다(4).
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