소리쟁이 추출물 및 분획물의 3T3-L1 전지방세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, 소리쟁이의 hexane, ethyl acetate 분획물에 의해 지방세포의 lipid droplet의 형성이 유의적으로 억제되었으며, 소리쟁이 에탄올 추출물과 모든 분획물 10 ${\mu}g/mL$의 농도에서 중성지질(triglyceride)의 함량이 유의적으로 감소되었다. 또한 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$의 단백질 발현은 10 ${\mu}g/mL$의 ethyl acetate, butanol 분획물에 의해 현저하게 감소되었다. 따라서 소리쟁이 추출물과 분획물 중 가장 활성이 우수한 ethyl acetate 분획물을 이용하여 지방분화에 관여하는 전사 인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, 그리고 SREBP1c 및 지질의 합성, 수송, 저장에 관여하는 ACS, FAS, FATP1, FABP4, Perilipin의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, ethyl acetate 분획물은 유의적으로 모든 유전자의 발현을 억제시켰다. 따라서 소리쟁이의 ethyl acetate 분획물은 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자 및 유전자들의 발현을 감소시킴으로써 항비만 효과가 있는 천연물 소재로 이용 가능할 것으로 생각된다.
소리쟁이 추출물 및 분획물의 3T3-L1 전지방세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, 소리쟁이의 hexane, ethyl acetate 분획물에 의해 지방세포의 lipid droplet의 형성이 유의적으로 억제되었으며, 소리쟁이 에탄올 추출물과 모든 분획물 10 ${\mu}g/mL$의 농도에서 중성지질(triglyceride)의 함량이 유의적으로 감소되었다. 또한 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$의 단백질 발현은 10 ${\mu}g/mL$의 ethyl acetate, butanol 분획물에 의해 현저하게 감소되었다. 따라서 소리쟁이 추출물과 분획물 중 가장 활성이 우수한 ethyl acetate 분획물을 이용하여 지방분화에 관여하는 전사 인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, 그리고 SREBP1c 및 지질의 합성, 수송, 저장에 관여하는 ACS, FAS, FATP1, FABP4, Perilipin의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, ethyl acetate 분획물은 유의적으로 모든 유전자의 발현을 억제시켰다. 따라서 소리쟁이의 ethyl acetate 분획물은 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자 및 유전자들의 발현을 감소시킴으로써 항비만 효과가 있는 천연물 소재로 이용 가능할 것으로 생각된다.
The anti-obesity effect of ethanol xtract and their fractions from Rumex Crispus L. on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes to adipocytes was investigated by suppressing adipocyte differentiation and lipid accumulation with Oil red O assay, western blot and real-time PCR analysis. Ethyl acet...
The anti-obesity effect of ethanol xtract and their fractions from Rumex Crispus L. on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes to adipocytes was investigated by suppressing adipocyte differentiation and lipid accumulation with Oil red O assay, western blot and real-time PCR analysis. Ethyl acetate fraction of Rumex crispus L. significantly inhibited adipocyte differentiation when treated during the adipocyte differentiation process, as assessed by measuring fat accumulation using Oil red O staining. In inducing differentiation of 3T3-L1 preadipocytes in the presence of an adipogenic cocktail, isobutylmethylxanthine (IBMX), dexamethasone- and insulin-along with ethyl acetate fraction residue processing treatment significantly decreased protein expression of obesity-related proteins, such as peroxisome-proliferators-activated-receptor-${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$) and CCAAT enhancer-binding-proteins ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$). These results indicate that ethyl acetate fraction of Rumex crispus L. is the most effective candidate for preventing obesity. However further studies will be needed to identify the active compounds that confer the anti-obesity activity of ethyl acetate fraction from Rumex crispus L.
The anti-obesity effect of ethanol xtract and their fractions from Rumex Crispus L. on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes to adipocytes was investigated by suppressing adipocyte differentiation and lipid accumulation with Oil red O assay, western blot and real-time PCR analysis. Ethyl acetate fraction of Rumex crispus L. significantly inhibited adipocyte differentiation when treated during the adipocyte differentiation process, as assessed by measuring fat accumulation using Oil red O staining. In inducing differentiation of 3T3-L1 preadipocytes in the presence of an adipogenic cocktail, isobutylmethylxanthine (IBMX), dexamethasone- and insulin-along with ethyl acetate fraction residue processing treatment significantly decreased protein expression of obesity-related proteins, such as peroxisome-proliferators-activated-receptor-${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$) and CCAAT enhancer-binding-proteins ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$). These results indicate that ethyl acetate fraction of Rumex crispus L. is the most effective candidate for preventing obesity. However further studies will be needed to identify the active compounds that confer the anti-obesity activity of ethyl acetate fraction from Rumex crispus L.
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문제 정의
본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정에서 소리쟁이 추출물 및 분획물의 분화억제에 미치는 영향을 알아보기 위해서 소리쟁이의 극성, 비극성 성분을 70% ethanol (Et), hexane(H), chloroform(Ch), ethyl acetate(Ea), butanol (Bu), water(W) 순으로 순차 분획하였다. 각 추출물 및 분획물을 이용하여 3T3-L1 세포에서 Oil red O 염색 및 triglyceride 함량을 측정하였고, 분화 관련 전사인자 및 각종 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하여 현재까지 이용가치가 떨어지는 소리쟁이를 비만억제 천연소재로 개발하기 위한 기초자료 마련에 도움이 되고자 연구를 수행하였다.
따라서 소리쟁이 추출물 및 분획물이 adipogenic transcription factor의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 단백질 수준에서 확인하였다. Preadipocyte에서 분화 유도와 동시에 소리쟁이 분획물을 10 µg/mL의 농도로 처리하고 FBS와 Insulin 배지로 갈아 줄 때마다 시료를 같이 처리하여 분화 종료 후 단백질 발현을 조사한 결과는 Fig.
본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정에서 소리쟁이 추출물 및 분획물의 분화억제에 미치는 영향을 알아보기 위해서 소리쟁이의 극성, 비극성 성분을 70% ethanol (Et), hexane(H), chloroform(Ch), ethyl acetate(Ea), butanol (Bu), water(W) 순으로 순차 분획하였다. 각 추출물 및 분획물을 이용하여 3T3-L1 세포에서 Oil red O 염색 및 triglyceride 함량을 측정하였고, 분화 관련 전사인자 및 각종 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하여 현재까지 이용가치가 떨어지는 소리쟁이를 비만억제 천연소재로 개발하기 위한 기초자료 마련에 도움이 되고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
3T3-L1 전구지방세포의 분화억제 효과가 가장 우수한 소리쟁이 ethyl acetate 분획물을 이용하여 adipogenic transcription factor 및 관련 유전자들에 미치는 영향을 확인하기 위해 real-time PCR 을 이용하여 나타낸 결과는 Fig. 5, 6과 같다. 분화를 유도한 control에서는 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP1c의 mRNA 발현이 증가되었으나, RC-Ea 10, 20 µg/mL의 농도에서 그 발현이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
4°C에서 13,000×g으로 10분간 원심 분리한 상등액은 단백질을 정량한 후 10% running gel과 4.5% stacking gel을 이용하여 125 V에서 SDS-polyacrylamide gel 전기영동을 실시하였다.
Cell을 lysis하여 4°C에서 14,000×g으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 취하고 0.02 mL 중성지방 표준용액에 조제한 반응시약은 (주)아산제약 중성지방 kit(AM 157S-K, Seoul, Korea)를 3mL씩 첨가하여 혼합하고 37°C에서 5분간 반응시켜 550nm에서 흡광도를 측정한 후, 시료의 흡광도 값을 식에 대입하여 중성지방 농도를 계산하였다.
3T3-L1 전구지방세포를 9일 동안 분화시킨 후 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하고 10% formaldehyde 용액으로 세포를 고정시켰다. 다시 PBS로 세척 후, Oil red O 용액을 첨가하여 30분간 실온에서 염색하고, Oil red O 용액을 제거한 후 증류수로 세척하여 건조시킨 다음 위상차 현미경을 이용하여 관찰하고 100% isopropyl alcohol로 염색된 지방구를 용해하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
3, Clifton, NY, USA)를 사용하여 여과하고 상등액은 rotary vacuum evaporator(UNI TRAP UT-1000, Eyela, Tokyo, Japan)로 55oC에서 농축하여 동결 후 사용하였다. 동결된 에탄올 추출물을 20배(w/v)의 증류수에 녹인 후 n-haxane (H), chloroform (Ch), ethyl acetate (Ea) 및 butanol (Bu)을 순차적으로 3회 반복 추출하여 각 용매별로 계통 분획 하였고 남은 수용성 층은 농축하여 water 분획으로 감압 농축하여 speed vacuum으로 남은 유기용매를 휘발시켜 동결건조하여 사용하였다.
배양 및 분화 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose(DMEM: Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 10% calf serum, antibiotics를 첨가하여 5% CO2, 37°C인큐베이터에서 배양하여 세포가 confluent 상태가 되면 trypsin/ EDTA를 처리하여 세포를 원심분리(L-70, Bekman Coulter, Fullerton, CA, USA)하여 세포를 모아서 3×105 cells/well의 밀도로 6 well에 분주한 후 100% confluency 상태에서 48시간 방치 후 DMEM에 10% BCS와 23 mg/mL IBMX(Sigma-Aldrich, Chem. Co., St. Louis, MO, USA), 5 mg/mL insulin(Sigma-Aldrich), 1 mM dexamethasone(Sigma-Aldrich)이 첨가된 배지(MDI)를 처리하여 분화를 48시간 동안 유도하고 그 후 2일 마다 10% FBS DMEM 배지에 5 mg/mL의 insulin이 첨가된 배지를 교체해주었다.
배양 종료 후 상층액을 제거하고 각 well에 100 µL의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 ELISA reader(Spectra MAX M2, Molecular Devices Inc, Sunnyvale, CA, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
샘플처리 결과 모든 분획층에서 50 µg/mL에서 80% 이상의 생존율을 나타내어 세포독성이 없는 농도에서 실험을 진행하였다.
소리쟁이 추출물 및 분획물의 3T3-L1 adipocytes의 세포 생존율을 측정하기 위해 50 µg/mL의 농도로 각 시료를 처리한 후, MTT assay를 실시하였다(Fig. 1).
소리쟁이 추출물이 3T3-L1 전구지방세포의 지방구 형성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 전지방세포를 6 well에 3×105 cells/well로 분주하여 confluent 상태에서 48시간 경과 후 분화유도 배지(MDI)와 소리쟁이 분획층 각각을 10 µg/mL의 농도로 처리하면서 adipocyte로의 분화를 유도 하였다.
실험에 사용된 소리쟁이는 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료 무게의 10배량의 70% ethanol (Et) (w/v)로 24시간 동안 정치 배양하여 총 3회 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No.
용해 곡선은 55°C에서 시작하여 95°C를 종말점으로 0.5°C씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광 값을 검출하였다.
이 후 48시간 주기로 3번 10% FBS DMEM배지에 5 mg/mL의 insulin이 첨가된 배지로 교체하면서 시료 10 µg/mL을 처리하여 oil red O로 지방 구를 염색하고 200 배율의 현미경으로 지방구를 관찰하였다(Fig. 2).
단백질이 이동된 membrane은 fast green solution으로 transfer의 유무를 확인한 후, 5% non-fat skim milk solution으로 blocking하였다. 일차항체의 발현 정도를 검토하기 위하여 TBST(Tris-Buffered Saline and Tween 20) 용액에 1:1000으로 희석하여 24시간 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하였다. 계속하여 이차항체를 2시간 반응시키고 다시 TBST로 3회 세척하였다.
계속하여 이차항체를 2시간 반응시키고 다시 TBST로 3회 세척하였다. 증류수로 세척하고 membrane에 ECL detection kit의 발색시약과 를 1:1로 섞은 후에 혼합액을 도포하고, X-ray film에 노출하여 현상한 후 film상의 band 농도를 관찰하였다.
지방구 염색, TG 함량, 지방세포 전사인자 발현의 결과에서 ethyl acetate층에서 가장 좋은 효과를 나타내어 mRNA level에서 ethyl acetate층의 lipid synthesis, lipid transport, lipid storage에 관여하는 유전자들의 발현 억제능을 조사하였다.
추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성 후 SYBER Green (Takara, Ohtsu, Japan)과 분화 발현 인자인 PPAR-gamma, C/EBPalpha, SREBP-1를 확인하고, 지방 축적, 합성, 저장에 관련된 ACS, FAS, FATP1, FABP4 그리고 perilipin의 유전자 발현을 알아보기 위해 real-time PCR(Takara)을 실시하였다. Primer(Bioneer Co.
실험에 사용된 3T3-L1 세포는 ATCC(Manassas, VA, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 배양 및 분화 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose(DMEM: Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 10% calf serum, antibiotics를 첨가하여 5% CO2, 37°C인큐베이터에서 배양하여 세포가 confluent 상태가 되면 trypsin/ EDTA를 처리하여 세포를 원심분리(L-70, Bekman Coulter, Fullerton, CA, USA)하여 세포를 모아서 3×105 cells/well의 밀도로 6 well에 분주한 후 100% confluency 상태에서 48시간 방치 후 DMEM에 10% BCS와 23 mg/mL IBMX(Sigma-Aldrich, Chem.
실험에 사용된 소리쟁이는 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료 무게의 10배량의 70% ethanol (Et) (w/v)로 24시간 동안 정치 배양하여 총 3회 추출하였다.
데이터처리
모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검사는 SPSSTM version 17.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 대조구인 분화 Control에 대한 시료 처리구의 통계적 유의성은 Tukey’s multiple comparison test(23) 로 검증하였다.
이론/모형
시료의 세포증식과 독성을 측정하기 위해 Green 등의 방법(22)에 따라 3-(3,4-dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay를 실시하였다. MTT assay는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 방법으로, 생성된 formazan의 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.
지방세포 분화과정에서 발현하는 인자 PPAR-γ, C/EBP-α 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 western blot을 실시하였다.
성능/효과
3T3-L1 지방전구세포에 소리쟁이 추출물 및 분획물을 처리한결과 triglyceride 함량은 Fig. 3과 같이 분화된 지방세포와 비교했을 때, 모든 분획물에서 triglyceride 형성 억제 효과가 나타났다. 특히 ethyl acetate 분획물 10 µg/mL의 농도에서 triglyceride 생성 억제 효과가 큰 것으로 나타나 소리쟁이의 ethyl acetate 분획물이 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제함으로써 비만 예방에 효과적일 것으로 생각된다.
그 결과, 소리쟁이 추출물 및 분획물을 처리하지 않고 분화를유도하였을 경우, 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었으나, 소리쟁이 분획물 처리에 의해 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰하였다. 특히 지방구 형성 억제효과는 ethyl acetate (Ea)와 hexane (H) 분획물에서 가장 우수한 결과를 보였다.
따라서 소리쟁이 추출물과 분획물 중 가장 활성이 우수한 ethyl acetate 분획물을 이용하여 지방분화에 관여 하는 전사 인자인 PPARγ, C/EBPα, 그리고 SREBP1c 및 지질의 합성, 수송, 저장에 관여하는 ACS, FAS, FATP1, FABP4, Perilipin의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, ethyl acetate 분획물은 유의적으로 모든 유전자의 발현을 억제시켰다.
또한 α-αdiphenyl-β-picrylhydrazyl(DPPH) radical 소거활성에서도 RC50값이 2.7±0.2 µg/mL로 나타나 소리쟁이 ethyl acetate층에서 가장 높은 항산화 활성을 보였다고 알려졌다.
분화를 유도한 control에서는 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP1c의 mRNA 발현이 증가되었으나, RC-Ea 10, 20 µg/mL의 농도에서 그 발현이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 또한 이들 전사인자들의 하위 인자인 acyl-CoA synthetase-1(ASC1), fatty acid synthesis(FAS), fatty acid transport-1(FATP1), fatty acid binding protein-4(FABP4) 및 perilipin의 결과에서도 분화유도에 따라 각 유전자의 mRNA의 발현이 현저하게 증가하였으나, RC-Ea 처리에 의해 유의적으로 감소함을 관찰하였다.
또한 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자인 PPARγ, C/EBPα의단백질 발현은 10 µg/mL의 ethyl acetate, butanol 분획물에 의해 현저하게 감소되었다.
분화를 유도한 control에서는 PPARγ, C/EBPα 및 SREBP1c의 mRNA 발현이 증가되었으나, RC-Ea 10, 20 µg/mL의 농도에서 그 발현이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
소리쟁이 추출물 및 분획물의 3T3-L1 전지방세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, 소리쟁이의 hexane, ethyl acetate 분획물에 의해 지방세포의 lipid droplet의 형성이 유의적으로 억제되었으며, 소리쟁이 에탄올 추출물과 모든 분획물 10 µg/mL의 농도에서 중성지질(triglyceride)의 함량이 유의적으로 감소되었다.
시료를 처리하지 않은 분화 유도군에서는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며, ethyl acetate, butanol 분획물의 처리시에 PPARγ 및 C/EBPα의 단백질 발현이 현저하게 감소함을 확인하였다.
이상의 결과에서 소리쟁이의 ethyl acetate 분획물은 3T3-L1 지방전구세포에서 adipogenic transcription factor인 PPARγ, C/EBPα그리고 SREBP1c 및 lipid synthesis, lipid transport, lipid storage에 관여하는 유전자들의 발현을 억제함으로써 lipid droplet 및 triglyceride 생성을 감소시켜 지방세포로의 분화를 억제시킬 수 있는 것으로 생각된다.
그 결과, 소리쟁이 추출물 및 분획물을 처리하지 않고 분화를유도하였을 경우, 세포질 내 lipid droplet의 형성이 활발하게 유발되는 것으로 관찰되었으나, 소리쟁이 분획물 처리에 의해 지방구 형성이 억제되는 것을 관찰하였다. 특히 지방구 형성 억제효과는 ethyl acetate (Ea)와 hexane (H) 분획물에서 가장 우수한 결과를 보였다. Lipid droplet은 phospholipid monolayer에 의해 둘러싸인 중성지방으로 precursor fibroblast에서부터 지방세포로의 분화과정에서 나타나며, PPARγ와 같은 중요한 adipogenic transcription factor들에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(24).
후속연구
따라서 소리쟁이 추출물과 분획물 중 가장 활성이 우수한 ethyl acetate 분획물을 이용하여 지방분화에 관여 하는 전사 인자인 PPARγ, C/EBPα, 그리고 SREBP1c 및 지질의 합성, 수송, 저장에 관여하는 ACS, FAS, FATP1, FABP4, Perilipin의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, ethyl acetate 분획물은 유의적으로 모든 유전자의 발현을 억제시켰다. 따라서 소리쟁이의 ethyl acetate 분획물은 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자 및 유전자들의 발현을 감소시킴으로써 항비만 효과가 있는 천연물 소재로 이용 가능할 것으로 생각된다.
항비만 활성에 대한 tannin 등 수많은 phenolic compounds의 연구들이 보고(29,30)되어 있으므로 이러한 폴리페놀 화합물을 중심으로 소리쟁이의 ethyl acetate 분획물 내의 활성성분에 대한 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
민간에서 소리쟁이는 어떤 질환에 효과가 있다고 보고되었는가?
소리쟁이는 부위별로 다양한 생리활성 성분을 함유하고 있으며, 본초강목에서는 곪은 부위나 부스럼에 붙이면 효능이 좋으며, 맛이 달고 성질은 미끄러우며 차고 독이 없다고 기록되어 있다. 민간에서는 변비, 소화불량, 장출혈 등에 효과가 있다고 보고되었다. 소리쟁이의 유용성 분으로는 emodin, nepodin 등과 플라보노이드, 폴리페놀 등 다양한 항산화 물질이 함유되어 있다(18-21).
소리쟁이는 무엇인가?
소리쟁이(Rumex crispus L.)는 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 다년초 식물로서 우리나라 전국 각지에서 자생하고 있으며, 들이나 개울가 등의 습한 곳에서 잘 자란다. 소리쟁이는 부위별로 다양한 생리활성 성분을 함유하고 있으며, 본초강목에서는 곪은 부위나 부스럼에 붙이면 효능이 좋으며, 맛이 달고 성질은 미끄러우며 차고 독이 없다고 기록되어 있다.
인슐린은 무엇인가?
지방세포의 분화는 지방 조직세포에 특징적으로 발현되는 유전자들의 조절부위에 작용하는 transcription factor들이 지방세포로 분화되는 과정에서 발현된다. 인슐린은 지방 세포의 분화를 유도하는 호르몬으로 지방세포 대사 조절에 관여하는 주요 외부인자이다(11,12). 지방세포는 분화 동안 C/EBP family, PPAR-γ, ADD1/SREBP1 등의 전사인자들의 전사 발현이 증가하고 이들 전사인자들은 상호 전사를 유도하여 지방세포를 분화하여 지방축적, 지방합성, 지방수송에 관여하는 인자들을 작용시켜 에너지 생산 및 비만에 이르게 한다(13,14).
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