예로부터 한방이나 민간요법에서 다양한 약리효능을 가진 약제로 알려져 있는 오미자 열매로부터 항염증 활성을 갖는 유용한 물질을 동정하고자 본 연구를 수행하였다. 먼저 오미자의 hexane 추출물로부터 38개의 분획물을 분리한 다음 각 분획의 항염증 활성을 측정하였다. 그 결과 오미자 분획물 중 생리활성이 높은 SCKH1을 선택하여 활성분획 추적방법을 통해 SCKH1PAIBPB을 분리하였다. SCKH1PAIBPB는 VCAM-1, MCP-1, IL-6 및 IL-8의 발현을 감소시키며, 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능을 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 규명된 오미자 분획물 및 SCKH1PAIBPB의 항염증효과 뿐만 아니라 혈관내피세포 증식 및 생존능 촉진작용을 응용하여, 다양한 허혈성질환 뿐만 아니라 염중성질환의 예방 및 치료에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
예로부터 한방이나 민간요법에서 다양한 약리효능을 가진 약제로 알려져 있는 오미자 열매로부터 항염증 활성을 갖는 유용한 물질을 동정하고자 본 연구를 수행하였다. 먼저 오미자의 hexane 추출물로부터 38개의 분획물을 분리한 다음 각 분획의 항염증 활성을 측정하였다. 그 결과 오미자 분획물 중 생리활성이 높은 SCKH1을 선택하여 활성분획 추적방법을 통해 SCKH1PAIBPB을 분리하였다. SCKH1PAIBPB는 VCAM-1, MCP-1, IL-6 및 IL-8의 발현을 감소시키며, 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능을 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구를 통해 규명된 오미자 분획물 및 SCKH1PAIBPB의 항염증효과 뿐만 아니라 혈관내피세포 증식 및 생존능 촉진작용을 응용하여, 다양한 허혈성질환 뿐만 아니라 염중성질환의 예방 및 치료에 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
Schisandra chinensis containing a variety of pharmacologically active lignans has been traditionally used in oriental medicine. In this study, anti-inflammatory compounds were screened from the hexane extracts of S. chinensis by activity-guided fractionation. First, we investigated the regulatory ef...
Schisandra chinensis containing a variety of pharmacologically active lignans has been traditionally used in oriental medicine. In this study, anti-inflammatory compounds were screened from the hexane extracts of S. chinensis by activity-guided fractionation. First, we investigated the regulatory effects on the expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) with 38 fractions from the hexane extracts of S. chinensis in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). As a result, SCKH1 among the 38 fractions from the hexane extract of S. chinensis was selected for further analysis based on its unique regulatory effect on cell adhesion molecules, especially on VCAM-1, in LPS-stimulated HUVECs. The subsequent activity-guided fractionation of SCKH1 resulted in the purification of SCKH1PAIBPB, which was found to suppress the expression of VCAM-1, MCP-1, IL-6 and IL-8 in HUVECs stimulated with LPS, and to inhibit the adhesive capacity between HUVECs and monocytes. Taken together, our data indicate that SCKH1PAIBPB can be proposed as an effective anti-inflammatory compound that may have a potential therapeutic use for the prevention and treatment of various inflammatory diseases as well as ischemic vascular diseases.
Schisandra chinensis containing a variety of pharmacologically active lignans has been traditionally used in oriental medicine. In this study, anti-inflammatory compounds were screened from the hexane extracts of S. chinensis by activity-guided fractionation. First, we investigated the regulatory effects on the expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) with 38 fractions from the hexane extracts of S. chinensis in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). As a result, SCKH1 among the 38 fractions from the hexane extract of S. chinensis was selected for further analysis based on its unique regulatory effect on cell adhesion molecules, especially on VCAM-1, in LPS-stimulated HUVECs. The subsequent activity-guided fractionation of SCKH1 resulted in the purification of SCKH1PAIBPB, which was found to suppress the expression of VCAM-1, MCP-1, IL-6 and IL-8 in HUVECs stimulated with LPS, and to inhibit the adhesive capacity between HUVECs and monocytes. Taken together, our data indicate that SCKH1PAIBPB can be proposed as an effective anti-inflammatory compound that may have a potential therapeutic use for the prevention and treatment of various inflammatory diseases as well as ischemic vascular diseases.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 약용 및 식용으로 사용되는 오미자의 분획물에서 활성분획추적법에 의해 활성 성분을 분리하고, 혈관내피세포 증식, 생존 조절 및 항염증 효과를 검증함으로써, 허혈성질환의 예방 혹은 치료에 이용될 수 있는 활성분획과 효능성분을 발굴하고자 하였다.
제안 방법
각각의 분획물 중 항염증 활성이 관찰된 분획물 SCKH1 (3,689 mg)을 대상으로 2차 silica gel column chromatography를 실시 하였다. 100% CHCl3 , dichlormethane (CH2Cl2)/acetone (17:3, v/v)을 전개용매로 순차적으로 용출하여 SCKH1PAIA~ SCKH1PAIM의 총 13개의 분획을 얻어 항염증 활성을 관찰하 였다. 활성이 검정된 SCKH1PAIB (999.
면역학적 활성을 고려하여 [15] 이 중 활성이 높은 hexane 추출물을 대상으로 1차 silica gel (4 µm, Baker, NJ, USA) column chromatography를 하였다. 100% hexane, ethylacetate (EtOAc)/hexane (1:4, v/v), MeOH/CHCl3 (1:19, v/v)을 전개용매로 사용하여 순차적으로 용출하여 SCKH1 ~ SCKH38의 총 38개의 분획을 얻었다. 각각의 분획물 중 항염증 활성이 관찰된 분획물 SCKH1 (3,689 mg)을 대상으로 2차 silica gel column chromatography를 실시 하였다.
오미자 hexane 추출물이 HUVEC의 생존률에 미치는 효과를 분석하기 위해, HUVEC을 혈청이 포함되지 않은 배지로 교환하여 1 μg/ml의 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와오미자 분획물을 50 μg/ml의 농도로 처리하고 24시간 배양하 였다. 24시간 후 WST-1 assay로 세포의 생존률을 측정하였다.
LPS로 자극한 HUVEC에서 세포부착분자(cell adhesion molecule)의 발현을 감소시키는 오미자 hexane 추출물을 찾기 위하여, HUVEC에 LPS (200 ng/ml) 처리 2시간 전에 오미자 분획물을 6시간 처리한 다음, RT-PCR을 이용하여 염증반 응의 매우 중요한 매개인자이며 대표적인 세포부착분자인 intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) 및 vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)의 발현수준을 조사하였다. 그리고 SCKH1 분획으로부터 분리한 SCKH1PAIBPB를 25 μg /ml의 농도로 처리한 다음 염증성 사이토카인인 interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)의 유전자를 증폭하기 위해 각각의 primer를 제작하여 사용하였다(Table 1).
PCR 반응 조건은 cycle 시작 전 94℃에서 5분간 가열 한 뒤 매 cycle 마다 94℃에서 30초 간 denaturation 시키고, 57℃에서 30초 동안 annealing 한 뒤 72℃에서 30초 동안 extension하는 과정을 28회 반복 하였고 cycle 종료 후 72℃에서 10분 동안 생성된 가닥을 extension하는 과정을 거쳤다. PCR 반응이 끝난 후에는 중폭된유전자를 1.5% agarose gel을 이용하여 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 유전자를 확인하였다.
SCKH1이 혈관내피세포에서 LPS에 의해 유도된 세포부착 분자의 발현을 특이적으로 감소시킨다는 사실을 확인하였기 때문에 SCKH1으로부터 SCKH1PAIBIA, SCKH1PAIBPB, SCKH1PAIBIC 및 SCKH1PAIBID를 순수분리한 후, 그 중 가장 주된 성분인 SCKH1PAIBPB가 HUVEC에서 VCAM-1, MCP-1, IL-6 및 IL-8 유전자의 발현에 미치는 효과를 분석하였다. 그 결과 SCKH1PAIBPB (25 μg/ml)에 의해 이들 유전자의 발현이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig.
100% hexane, ethylacetate (EtOAc)/hexane (1:4, v/v), MeOH/CHCl3 (1:19, v/v)을 전개용매로 사용하여 순차적으로 용출하여 SCKH1 ~ SCKH38의 총 38개의 분획을 얻었다. 각각의 분획물 중 항염증 활성이 관찰된 분획물 SCKH1 (3,689 mg)을 대상으로 2차 silica gel column chromatography를 실시 하였다. 100% CHCl3 , dichlormethane (CH2Cl2)/acetone (17:3, v/v)을 전개용매로 순차적으로 용출하여 SCKH1PAIA~ SCKH1PAIM의 총 13개의 분획을 얻어 항염증 활성을 관찰하 였다.
HUVEC에 SCKH1PAIBPB를 25 μg/ml의 농도로 처리한후 6시간이 경과되었을 때 LPS (200 ng/ml)를 처리하고 단핵구와 반응시켰다. 그로부터 4시간 후 혈관내피세포에 부착된 단핵구의 수를 산정하였다.
그리고 SCKH1 분획으로부터 분리한 SCKH1PAIBPB를 25 μg /ml의 농도로 처리한 다음 염증성 사이토카인인 interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)의 유전자를 증폭하기 위해 각각의 primer를 제작하여 사용하였다(Table 1).
또한 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능을 측정하기 위해 SCKH1PAIBPB (25 μg/ml)를 처리한 후 6시간이 경과되었을 때 LPS (200 ng/ml)를 처리하고 단핵구와 반응시켰다.
면역학적 활성을 고려하여 [15] 이 중 활성이 높은 hexane 추출물을 대상으로 1차 silica gel (4 µm, Baker, NJ, USA) column chromatography를 하였다.
물질의 순수분리는 open column chromatography를 사용하였으며, 분획을 확인하기 위한 thin layer chromatography (TLC)는 TLC silica gel 60 F 254 (20×20 cm, Merk)를 사용하였다.
오미자 hexane 추출물이 HUVEC의 생존률에 미치는 효과를 분석하기 위해, HUVEC을 혈청이 포함되지 않은 배지로 교환하여 1 μg/ml의 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)와오미자 분획물을 50 μg/ml의 농도로 처리하고 24시간 배양하 였다.
오미자 hexane 추출물이 사람배꼽정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs, Lonza, Walkersville, MD, USA)의 증식률에 미치는 효과를 분석하기 위해서, HUVEC에 오미자 분획물을 50 μg/ml의 농도로 처리 후 24시간 또는 48시간 배양하여 WST-1 assay[6]를 실시하였다.
이와 같은 세포부착 분자의 발현을 감소시키는 오미자 hexane 추출물로부터 활성 분획을 추적하기 위해 HUVEC에 LPS (200 ng/ml)를 자극하기 2시간 전에 오미자 분획물(50 μg/ml)을 처리하여 RT-PCR 로 확인하였다.
100% CHCl3 , dichlormethane (CH2Cl2)/acetone (17:3, v/v)을 전개용매로 순차적으로 용출하여 SCKH1PAIA~ SCKH1PAIM의 총 13개의 분획을 얻어 항염증 활성을 관찰하 였다. 활성이 검정된 SCKH1PAIB (999.1 mg)을 대상으로 동일한 전개용매를 사용하여 3차 silica gel column chromatography를 실시하고 총 8개의 SCKH1PAIBIA~SCKH1PAIBII의분획물을 얻었다(Fig. 1). 항염증 활성이 검정된 순수물질 SCKH1PAIBPB (316.
대상 데이터
건조된 오미자(Schisandra chinensis) 열매 2.5 kg을 hexane, chloroform (CHCl3 ), methanol (MeOH)을 이용하여 상온에서 연속적으로 추출하여 hexane 추출물 309 g, CHCl3 추출물 14 g, MeOH 추출물 1,368 g을 얻었다. 면역학적 활성을 고려하여 [15] 이 중 활성이 높은 hexane 추출물을 대상으로 1차 silica gel (4 µm, Baker, NJ, USA) column chromatography를 하였다.
문경에서 재배한 오미자 열매를 동로농협으로부터 구입하여 사용하였으며, 시료의 추출 및 분리 용매로는 특급 또는 일급의 hexane, chloroform, methyl chloride, methanol 및 acetone 등을 사용하였다. 물질의 순수분리는 open column chromatography를 사용하였으며, 분획을 확인하기 위한 thin layer chromatography (TLC)는 TLC silica gel 60 F 254 (20×20 cm, Merk)를 사용하였다.
데이터처리
실험결과의 통계학적 처리는 Student’s t-tests를 사용하였으며, p<0.05 수준 이하에서 유의성을 결정하였다.
이론/모형
chinensis hexane extracts (50 μg/ml). The rate of cell proliferation was assayed by WST-1 assay. Data are expressed as the mean±SD.
성능/효과
그 결과 SCKH1PAIBPB (25 μg/ml)에 의해 이들 유전자의 발현이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
이와 같은 세포부착 분자의 발현을 감소시키는 오미자 hexane 추출물로부터 활성 분획을 추적하기 위해 HUVEC에 LPS (200 ng/ml)를 자극하기 2시간 전에 오미자 분획물(50 μg/ml)을 처리하여 RT-PCR 로 확인하였다. 그 결과 오미자 분획물 중에서 SCKH1, SCKH10 및 SCKH19에 의해 E-selectin의 발현이 감소되었고, SCKH1, SCKH7, SCKH9, SCKH13, SCKH17 및 SCKH19에의해 ICAM-1의 발현이 감소되었으며 VCAM-1의 발현은 SCKH1 첨가에 의해서만 특이적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
또한 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능을 측정하기 위해 SCKH1PAIBPB (25 μg/ml)를 처리한 후 6시간이 경과되었을 때 LPS (200 ng/ml)를 처리하고 단핵구와 반응시켰다. 그로부터 4시간 후 혈관내피세포에 부착된 단핵구의 수를 산정한 결과 LPS에 의해 증가한 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능이 SCKH1PAIBPB 처리군에서 현저하게 감소하였다 (Fig. 7).
무혈청배지에 배양 중인 HUVEC에 1 μg/ml의 LPS와 오미자 분획물(50 μg/ml)을 24시간 처리하여 세포의 생존율을 WST-1 assay로 측정한 결과 LPS에 의해 감소했던 생존률이 SCKH7과 SCKH9를 처리한 군에서 증가하였다(Fig. 5).
본 연구자들에 의한 추가적인 연구를 통해 SCKH1PAIBPB 는 TNF-α로 자극한 HUVEC에서 항산화효과, VCAM-1과 E-selectin의 발현 억제효과, 혈관내피세포와 단핵구 사이의 부착능 감소효과 및 NF-κB 전사인자의 활성 억제효과를 나타내었다[3].
혈관내피세포의 증식유도효과를 분석하기 위해서 오미자 분획물(50 μg/ml)을 HUVEC에 각각 24시간 또는 48시간 처리한 후 WST-1 assay를 이용하여 HUVEC의 증식률을 측정한 결과, 24시간 배양군에서는 SCKH9에서 증식률의 증가를 보였고, 48시간 배양군에서는 SCKH7 및 SCKH9에서 증식률의 증가를 보였다(Fig. 4).
후속연구
그러므로 TNF-α와 같은 전염증성인자에 의해 산화적 스트레스가 유발된 혈관내피세포에서 항산화효과를 가질뿐만 아니라 VCAM-1의 발현을 억제하는 효과를 가지는 SCKH1PAIBPB 는 향후 동맥경화증과 같은 허혈성 혈관질환 및 다양한 염증성질환의 효과적인 예방 및 치료제 개발에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
5). 이러한 결과는 향후 SCKH7과 SCKH9 그리고 그 성분들을 이용하여 혈관내피세포의 생존율을 증가시킴으로써 다양한 허혈성 혈관질환의 예방 및 치료에 유용한 기능성 천연식품소재 및 신약으로 활용이 가능할 것임을 시사해주는 소견이라 할 수 있다.
4). 이러한 결과는 향후 SCKH7과 SCKH9 그리고 그 성분들을 이용하여 혈관내피세포의 증식을 촉진시킴으로써 다양한 허혈성 혈관질환의 예방 및 치료에 유용한 기능성 천연식품소재 및 신약으로 활용이 가능할 것임을 시사한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
오미자는 어떤 생리 활성이 있는가?
오미자(Schizandra chinensis Baillon)는 우리나라를 비롯한 중국, 일본 등의 여러 나라에서 약용식물로 사용되고 있으며, 예로부터 한방에서 진정, 진해, 해열제 등으로 이용되었으며, 면역조절, 항암, 항종양, 중추신경 기능강화, 혈액순환 개선, 혈압강하 작용, 간기능 복구효과, 항당뇨 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되어 있다[2, 9, 14, 18, 19]. 오미자는 주성분이 리그난(lignan) 화합물이며 palmitic acid와 stearic acid 등의 지방산과 유기산 등을 함유하고 있으며[10], schizandrin, schizadran, γ-schizadrin, ethamigrenal, gomisin류등의 성분이 보고된 바 있다[12].
오미자는 어떤 균에 우수한 항균활성을 가지는가?
오미자는 주성분이 리그난(lignan) 화합물이며 palmitic acid와 stearic acid 등의 지방산과 유기산 등을 함유하고 있으며[10], schizandrin, schizadran, γ-schizadrin, ethamigrenal, gomisin류등의 성분이 보고된 바 있다[12]. 오미자의 다양한 기능성에 관한 연구로서, 오미자에서 높은 함량을 보인 페놀 화합물은 항산화 활성, 항암, 항바이러스, 항염증 및 혈관보호 기능이 우수하여 다양한 생리활성을 나타내며, 그람 양성균과 그람음 성균에 대하여 우수한 항균활성을 가진다는 사실이 밝혀졌다 [2, 4, 7, 11, 14]. 이러한 다양한 생리활성을 가지는 오미자에 대한 본 연구자들의 최근 연구[15]에서 오미자의 hexane, chloroform과 methanol 추출물에 대한 호중구의 세포 내 칼슘 농도 변화를 관찰한 결과, chloroform과 methanol 추출물에서는 특별한 변화가 관찰되지 않았으나, hexane 추출물은 칼슘 농도의 증가를 유도한다는 의미 있는 결과를 얻을 수 있었다.
허혈성 조직손상의 치료로 동맥 성형술이나 동맥 우회로 수술 같은 혈류 재개통술을 사용할 경우 문제점은?
현재 허혈성 조직손상의 치료는 주로 막힌 혈관의 재소통이나 혈관재생에 초점이 맞추어지고 있다. 최근 동맥성형술이나 동맥우회로수술 같은 혈류 재개통술의 눈부신 발전에 힘입어 혈관질환의 치료 범위가 확대된 것이 사실이나, 이러한 시도는 혈관 내피세포층의 손상을 야기시키고, 손상된 내피세포 부위에서 염증반응과 혈액응고가 유발될 수 있다. 또한 이러한 염증반응과 혈액응고에 의하여 발생하는 혈관내 신생혈관 내막(neointima)과 혈전의 형성은 환자의 예후를 더욱 더 악화 시킬 수 있다. 따라서 새로운 치료법 개발이 절실히 요구되고 있다.
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