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문제 정의
- , 2011) 바로 하위 부위에 Zn(II)2Cys6 뿐만 아니라 GAL4와 아주 유사한 전사활성부위를 함께 지니는 유전자가 발견되었다. 본 연구에서는 이 유전자의 기능과 유성분화 조절자와의 관계를 알아보고자 하였다.
- 이는 gtfA 유전자가 이들 조절자들에 의해 전사단계에서 영향을 받지 않음을 보여준다. 한편, GtfA 전사인자가 유성분화를 억제하는 기능이 있음이 돌연변이 형질로부터 확인한 바 있으므로 이 유전자가 유성분화를 조절하는 전 사인자 유전자 nsdC와 nsdD의 전사에 영향을 주는가를 조사하였다. Fig.
제안 방법
- 원형질체를 만들기 위해 Glucanex 200G (Novozymes, USA)를 사용하였다. Agarose gel은 Seakem LE agarose (FMC, USA)를 사용하였으며, agarose gel로부터 DNA 정제는 HiYieldTM Gel/ PCR DNA Extraction Kit (RBC, Netherlands) 를 사용하였다. Plasmid DNA 추출은 PrimePrepTM Plasmid DNA Isolation Kit (GeNet Bio, Korea)를 사용하였다.
- nidulans로부터의 RNA 추출은 TRIzolⓇReagent (Invitrogen, USA)를 사용하였다. Northern hybridization을 위해 32P 방사선 동위원소는 Amersham (USA) 제품을 사용하였고, probe 제조를 위해 Random primer labelling kit (TaKaRa, Japan)를 사용하였으며 정제를 위해 PROBERTM Probe DNA Purifying System (iNtRON, Korea)를 사용하였다. Expose film은 KODAK BIOMAXTM MS film (Kodak, USA)를 사용하였다.
- 3B). gtfA 결실돌연변이 GTFAK4의 표현형을 야생형 균주인 A4와 동종인자형대조군(isogenic control)인 HSY2P1 (argB+)의 그것과 표준조건에서(Han et al., 2001) 비교하였다. gtfA 결실돌연변이인 GTFAK4의 경우 야생형 및 동종인자형 대조군과 비교하였을때 무성분화가 상당히 억제됨을 확인할 수 있었었다(Figs.
- 4A). gtfA 과다발현 균주의 표현형을 조사하기 위하여 gtfA niiA 프로모터 억제 조건인 0.2% ammonium tartrate와 유도 조건인 0.6% sodium nitrate를 첨가하여 관찰하였다. 하지만 대조군과 비교하여 분화 형질에 있어 큰 차이를 보이지 않았다(Fig.
- gtfA 유전자가 정상적으로 기능을 하는 유전자인지 확인하기 위하여 결실 돌연변이를 제조하여 그 형질을 조사하였다. gtfA 유전자가 pBluescript II SK에 subcloning 되어있는 pZIT3 plasmid로부터 StuI-SphI restriction enzyme을 이용하여 gtfA 유전자의 ORF를 제거한 자리에 SmaI-SphI restriction enzyme을 이용하여 잘라낸 pJYargB의 argB 유전자를 삽입하여 deletion plasmid인 pgtfA-K1을 제조하였다(Fig. 3A). 위에서 제조된 pgtfA-K1로 HSY2 (ΔargB::trpC) 균주를 형질전환하여 127개의 argB+ 형질전환체를 분리하였다.
- gtfA 유전자가 정상적으로 기능을 하는 유전자인지 확인하기 위하여 결실 돌연변이를 제조하여 그 형질을 조사하였다. gtfA 유전자가 pBluescript II SK에 subcloning 되어있는 pZIT3 plasmid로부터 StuI-SphI restriction enzyme을 이용하여 gtfA 유전자의 ORF를 제거한 자리에 SmaI-SphI restriction enzyme을 이용하여 잘라낸 pJYargB의 argB 유전자를 삽입하여 deletion plasmid인 pgtfA-K1을 제조하였다(Fig.
- gtfA 유전자의 과다발현을 위한 vector를 제조하기 위해 pZIT3로부터 gtfA ORF를 포함하는 2.4 kb DNA를 PCR로 합성하여 pNQ-argB의 niiA promoter 아래 삽입하였다(pgtfAOE01). 이 vector로 HSY2를 형질전환하여 얻어진 형질전환체에 대해 Northern hybridization법으로 과다발현됨을 확인하였다.
- sndA 유전자(AN3911) 하위에 위치하고 있는 GAL4형 전사인자를 암호화하는 유전자(AN3912)에 대해 분석하였다. 이 전사인자는 Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain 과 전사활성부위를 모두 가지고 있는 전형적 진균 특이 전사인자로서 해당 유전자는 gtfA (gal4 type transcription factor)라 명 명되었다.
- 각 생활사에 따른 gtfA 유전자의 발현시기를 알아보고자 A4를 완전액체배지에서 16시간 배양하여 영영번식을 시키고 이 때 형성된 균사덩어리를 무성유도 조건 또는 유성유도조건에서(Han et al., 1990) 배양하면서 일정 단계의 균사체로부터 total RNA를 추출하여 Northern 블롯법으로 전사체의 변화를 조사하였다. Fig.
- 기존에 알려진 분화조절자들이 gtfA 유전자 발현에 어떠한 영향을 주는가를 알아보기 위해 영향을 받는 유전자를 확인하기 위하여 이들 유전자가 결실된 돌연변이에서 gtfA 유전자발현을 조사하였다(Fig. 6). 유성분화의 능동적 조절자 NsdD (Han et al.
- 배양접시에 밀집배양된 배양체로부터 지름 5 mm2 되도록 코르크보러로 제거한 다음 1 ml Tween 80 용액에 넣고 혼탁한 후에 Haemacytometer로 분생포자수를 현미경으로 측정하였다. 폐쇄포자낭 수는 40배 현미경 시야에 들어오는 cleitothecia 양을 직접 세어 측정한 후 일정 면적으로 환산하였다.
- 완전배지(CM)와 최소배지(MM)는 Han 등(1990)의 방법으로 준비하였고 증식을 위한 A. nidulans 균주의 배양은 37℃, 완전배지에서 3일간 배양하여 사용하였으며, 유전학적 분석을 위해서는 최소배지에 필요한 영양요구물을 첨가하여 사용하였다. 콜로니 크기를 제한하기 위해 sodium deoxycholate를 최종농도가 500 mg/L가 되도록 첨가하였다.
- 위에서 제조된 pgtfA-K1로 HSY2 (ΔargB::trpC) 균주를 형질전환하여 127개의 argB+ 형질전환체를 분리하였다.
- 위에서 제조된 pgtfA-K1로 HSY2 (ΔargB::trpC) 균주를 형질전환하여 127개의 argB+ 형질전환체를 분리하였다. 이들의 genomic DNA를 SalI 으로 자른 후 좌측 flanking DNA 조각을 probe로 하여(Fig. 3A) Southern hybridization을 수행하였다. gtfA 유전자가 argB로 정확히 교체되었을 경우 약 1.
대상 데이터
- Plasmid DNA 추출은 PrimePrepTM Plasmid DNA Isolation Kit (GeNet Bio, Korea)를 사용하였다. A. nidulans로부터의 RNA 추출은 TRIzolⓇReagent (Invitrogen, USA)를 사용하였다. Northern hybridization을 위해 32P 방사선 동위원소는 Amersham (USA) 제품을 사용하였고, probe 제조를 위해 Random primer labelling kit (TaKaRa, Japan)를 사용하였으며 정제를 위해 PROBERTM Probe DNA Purifying System (iNtRON, Korea)를 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 균주들은 Table 1에 그리고 유전자 운반체는 Table 2에, 백터 제조 및 RT-PCR과 관련된 primer는 Table 3에 명시하였다. A. nidulans의 야생형 균주로 fungal genetics stock center (FGSC)에서 구입한 A4를 사용하였다. 결실돌연변이 및 과다발현 균주 제조를 위해 HSY2를 사용하였다.
- Escherichia coli 균주로 DH5α를 사용하였으며 재조합 plasmid DNA 제작과 DNA 증폭을 위한 백터는 pBluescript II SK vector (Stratagene, USA) 그리고 T-easy vector System I (Promega, USA)를 사용하였고, 유전자파괴와 과다발현 벡터를 제조하기 위해 pZLT3, pJYargB, pNQ-argB를 사용하였다.
- Northern hybridization을 위해 32P 방사선 동위원소는 Amersham (USA) 제품을 사용하였고, probe 제조를 위해 Random primer labelling kit (TaKaRa, Japan)를 사용하였으며 정제를 위해 PROBERTM Probe DNA Purifying System (iNtRON, Korea)를 사용하였다. Expose film은 KODAK BIOMAXTM MS film (Kodak, USA)를 사용하였다.
- Agarose gel은 Seakem LE agarose (FMC, USA)를 사용하였으며, agarose gel로부터 DNA 정제는 HiYieldTM Gel/ PCR DNA Extraction Kit (RBC, Netherlands) 를 사용하였다. Plasmid DNA 추출은 PrimePrepTM Plasmid DNA Isolation Kit (GeNet Bio, Korea)를 사용하였다. A.
- nidulans의 야생형 균주로 fungal genetics stock center (FGSC)에서 구입한 A4를 사용하였다. 결실돌연변이 및 과다발현 균주 제조를 위해 HSY2를 사용하였다. Escherichia coli 균주로 DH5α를 사용하였으며 재조합 plasmid DNA 제작과 DNA 증폭을 위한 백터는 pBluescript II SK vector (Stratagene, USA) 그리고 T-easy vector System I (Promega, USA)를 사용하였고, 유전자파괴와 과다발현 벡터를 제조하기 위해 pZLT3, pJYargB, pNQ-argB를 사용하였다.
- 이 vector로 HSY2를 형질전환하여 얻어진 형질전환체에 대해 Northern hybridization법으로 과다발현됨을 확인하였다. 동종 인자형 대조군 형질전환체는 pNQ-argB로 HSY2를 형질전환하여 HSY2P2를 얻어내어 사용하였다. Southern hybridization 결과 정확한 크기의 DNA와 적은 copy로 형질전환되었음이 확인된 대표적인 과다발현균주 GTFAOE7는 Northern hybridization 결과 유도조건에서 gtfA가 과다발현됨을 확인하였다(Fig.
- 본 연구에서 사용된 균주들은 Table 1에 그리고 유전자 운반체는 Table 2에, 백터 제조 및 RT-PCR과 관련된 primer는 Table 3에 명시하였다. A.
- , 1996). 본 연구진은 nsdD 결실돌연변이에 대한 억제 인자를 연구 하던 중 Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain만을 지니는 sndA 유전자를 동정하게 되었는데 흥미롭게도 sndA (Lee et al., 2011) 바로 하위 부위에 Zn(II)2Cys6 뿐만 아니라 GAL4와 아주 유사한 전사활성부위를 함께 지니는 유전자가 발견되었다. 본 연구에서는 이 유전자의 기능과 유성분화 조절자와의 관계를 알아보고자 하였다.
- 제한효소는 ROCHE (USA) 제품을 사용하였고 ligase는 T4 DNA ligase (TaKaRa, Japan & RBC, Netherlands)를 사용하였다. 원형질체를 만들기 위해 Glucanex 200G (Novozymes, USA)를 사용하였다. Agarose gel은 Seakem LE agarose (FMC, USA)를 사용하였으며, agarose gel로부터 DNA 정제는 HiYieldTM Gel/ PCR DNA Extraction Kit (RBC, Netherlands) 를 사용하였다.
- 제한효소는 ROCHE (USA) 제품을 사용하였고 ligase는 T4 DNA ligase (TaKaRa, Japan & RBC, Netherlands)를 사용하였다.
이론/모형
- E. coli의 형질전환은 CaCl2 방법을 이용한 형질 전환은(Sambrook et al., 1989)에 의한 방법을 사용하였으며 A. nidulans의 형질전환은 A. nidulans의 형질전환체를 얻기 위한 형질전환 방법은 Han 등(2001)의 방법을 사용하였다.
- Plasmid DNA, genomic DNA 및 total RNA 추출은 기존의 방법(Sambrook et al., 1989)을 사용하였다. Southern hybridization과 Northern hybridization은 이전의 방법에 따라 수행하였다(Han et al.
- , 1989)을 사용하였다. Southern hybridization과 Northern hybridization은 이전의 방법에 따라 수행하였다(Han et al., 2001).
성능/효과
- 동종 인자형 대조군 형질전환체는 pNQ-argB로 HSY2를 형질전환하여 HSY2P2를 얻어내어 사용하였다. Southern hybridization 결과 정확한 크기의 DNA와 적은 copy로 형질전환되었음이 확인된 대표적인 과다발현균주 GTFAOE7는 Northern hybridization 결과 유도조건에서 gtfA가 과다발현됨을 확인하였다(Fig. 4A). gtfA 과다발현 균주의 표현형을 조사하기 위하여 gtfA niiA 프로모터 억제 조건인 0.
- , 2001) 비교하였다. gtfA 결실돌연변이인 GTFAK4의 경우 야생형 및 동종인자형 대조군과 비교하였을때 무성분화가 상당히 억제됨을 확인할 수 있었었다(Figs. 3C and 3D). 하지만 포도당 이외의 탄소원(glycerol, lactose, acetate, maltose) 및 stress 조건인 light, 0.
- 종결코돈 TGA downstream 149bp 부위에 transcription 종결 염기서열로 예상되는 TACAT가 확인되었다. gtfA 아미노산 서열을 NCBI database를 이용하여 분석한 결과, GAL4-like Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain이 존재하며, 많은 종 안에서 높은 상동성이 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 과다발현균주는 높은 포도당 농도가 주어지면 유성생식이 늦어지는 형질을 나타내었다. gtfA 유전자는 영양생장 후반부와 유성분화 초기단계에서 높은 발현량을 보이고 전생활사를 통해 비교적 일정하게 발현되었다. gtfA의 전사는 일부 유성(NsdD, VeA) 및 무성(FluG, FadA, SfaD) 분화 조절자들에 의해 크게 영향을 받지 않았다.
- 이 유전자의 ORF는 762개의 아미노산으로 구성되어 있고 3개의 intron이 그 안에 존재하였다. gtfA 유전자의 결실돌연변이는 무성포자생성이 감소하고 대신 유성생식기관이 증가 하는 형질을 보여주었다. 과다발현균주는 높은 포도당 농도가 주어지면 유성생식이 늦어지는 형질을 나타내었다.
- sndA 유전자는 AN3911로 확인되었으며 Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain만을 지니고 있음에도 유성분화를 억제하는 뚜렷한 형질을 보여준다(논문 준비중). sndA ORF의 termination codon 약 50 base 정도 아래에 새로운 ORF가 나타나는데 이를 sequencing 한 결과 여기에는 Zn(II)2Cys6 뿐만 아니라 GAL4와 아주 유사한 전사활성부위가 모두 존재하였다.
- 이 결과는 gtfA 유전자가 강제적으로 과다발현 되었을 때 높은 glucose 농도에서 유성분화로의 결정을 억제하고 대신 영양생장을 지속하게 하는 것으로 보인다. 결실돌연변이와 과다발현균주의 형질을 종합하여 볼 때 gtfA 유전자는 분화결정 단계에서 특정 환경에서 유성분화로의 결정을 저해하는 기능을 할 것으로 사료된다.
- 1에 제시하였다. 본 연구실에서 제작한 cDNA library와 순수 분리한 mRNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 51 bp의 intron I, 51 bp의 intron II, 45 bp의 intron III, 총 3개의 intron이 존재함을 확인할 수 있었다. 이를 토대로 gtfA 유전자를 분석한 결과 gtfA ORF 염기서열은 2288개의 nucleotide로 구성되어 있으며, 762개의 아미노산을 암호하고 있었다.
- 2 M Sorbitol를 첨가한 배지에서는 야생형과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다(자료 미제시). 상대적으로 표준조건에서 유성생식 기관인 폐쇄포자낭의 형성률은 야생형과 비교하여 2배 정도 증가하는 양상을 보였으나(Fig. 3D) 이 역시 다른 탄소원 및 스트레스 조건에서는 야생형과 큰 차이를 보이지 않았다(자료 미제시). 이러한 결과로 미루어 gtfA 유전자는 포도당과 같은 좋은 탄소원과 스트레스가 없는 생장조건에서 유성보다는 무성분화를 유도하는 결정 기작에 관여할 것으로 사료된다.
- 4 kb DNA를 PCR로 합성하여 pNQ-argB의 niiA promoter 아래 삽입하였다(pgtfAOE01). 이 vector로 HSY2를 형질전환하여 얻어진 형질전환체에 대해 Northern hybridization법으로 과다발현됨을 확인하였다. 동종 인자형 대조군 형질전환체는 pNQ-argB로 HSY2를 형질전환하여 HSY2P2를 얻어내어 사용하였다.
- , 1994; Treisman, 1995). 이 중 Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain은 진균류 특이 전사인자로서 Saccharomyces cerevisiae의 GAL4 단백질이 대표적이며, 모든 균류에서 적게는 50여개에서 많게는 200여 종이 넘는 유전자에 분포하는 것으로 알려졌다. 일반적으로 GAL4-like Zn-(II)2Cys6 domain이 N-terminal 에 존재 시 middle region에 fungal transcription factor domain을 가지고 있다.
- 3D) 이 역시 다른 탄소원 및 스트레스 조건에서는 야생형과 큰 차이를 보이지 않았다(자료 미제시). 이러한 결과로 미루어 gtfA 유전자는 포도당과 같은 좋은 탄소원과 스트레스가 없는 생장조건에서 유성보다는 무성분화를 유도하는 결정 기작에 관여할 것으로 사료된다.
- 본 연구실에서 제작한 cDNA library와 순수 분리한 mRNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 51 bp의 intron I, 51 bp의 intron II, 45 bp의 intron III, 총 3개의 intron이 존재함을 확인할 수 있었다. 이를 토대로 gtfA 유전자를 분석한 결과 gtfA ORF 염기서열은 2288개의 nucleotide로 구성되어 있으며, 762개의 아미노산을 암호하고 있었다. 종결코돈 TGA downstream 149bp 부위에 transcription 종결 염기서열로 예상되는 TACAT가 확인되었다.
- 이를 토대로 gtfA 유전자를 분석한 결과 gtfA ORF 염기서열은 2288개의 nucleotide로 구성되어 있으며, 762개의 아미노산을 암호하고 있었다. 종결코돈 TGA downstream 149bp 부위에 transcription 종결 염기서열로 예상되는 TACAT가 확인되었다. gtfA 아미노산 서열을 NCBI database를 이용하여 분석한 결과, GAL4-like Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain이 존재하며, 많은 종 안에서 높은 상동성이 있음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 반면 GtfA는 nsdC 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 종합하여 볼 때, GtfA는 분화 결정시기에 nsdC의 발현을 억제함으로써 유성분화보다는 무성분화로 유도되도록 조절 할 것으로 추정된다.
- 4B). 하지만 glucose 농도에 따라 억제조건과 유도조건에서 분화양상을 관찰한 결과 억제조건에서는 대조군과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았지만, 유도조건에서는 glucose의 농도에 따라 유성생식 기관인 폐쇄포자낭의 생성시기가 야생형에 비해 늦어짐을 확인 할수 있었다. 일반적으로 nitrate가 질소원인 경우 glucose 농도가 증가할수록 전체 균체량이 증가하고 무성보다는 유성분화의 비율이 증가하였다(Fig.
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