다약제내성균에 대한 항균 활성을 가지는 Bacillus subtilis MP56 균주의 분리 및 특성분석 Isolation and Characterization of Bacillus subtilis MP56 with Antimicrobial Activity against MDR (Multi Drug Resistant) Strains원문보기
최근 국내외로 MRSA, VRE 등의 다약제 내성 균주의 분리빈도가 매년 급증하고 있고, 시판하고 있는 항생제 중 가장 효능이 강력한 제품들도 다약제 내성균 출현율이 증가함에 따라 이를 극복할 새로운 항생제의 개발이 요구되고 있다. 다약제 내성균에 유효한 항생제의 예로 vancomycin, teicoplanin, linezolid가 다약제 내성균에 유효한 의약품으로 쓰이고 있으며 방선균이나 Bacillus 등의 배양액에서 다약제 내성균에 유효한 물질의 발굴에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 넓은 항균범위를 가지고, 체내 축척이 적은 항생물질에 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구진은 국내 서해안의 갯벌에서 Bacillus 속 미생물을 수종 분리하였으며, 다약제 내성균에 항균 활성을 지니는 MP56 균주를 선발하였고, 균주 동정 결과 Bacillus subtilis 와 99.93%의 16S rRNA 상동성을 나타냄을 본 연구에서 확인하였다. 국내외 연구진에 의하여 다수의 Bacillus 속 미생물이 분리된 바가 있으며, 항균 물질에 대한 연구도 보고된 바 있다. 그러나 국내 갯벌에서 분리된 Bacillus 속 균주 배양액의 임상균주에 대한 항균 효능 평가에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 본 연구에서 Bacillus 속 균주 MP56 배양액이 국내에서 분리한 임상 균주인 MRSA, IMP 균주에 대해 우수한 항균 활성을 나타내어 최적 발효조건과 항균범위를 본 논문을 통해 보고하였으며, 추후 MP56 균주 배양액에서 항균물질의 분리, 정제 및 구조 규명을 위한 후속 연구를 수행 할 예정이다.
최근 국내외로 MRSA, VRE 등의 다약제 내성 균주의 분리빈도가 매년 급증하고 있고, 시판하고 있는 항생제 중 가장 효능이 강력한 제품들도 다약제 내성균 출현율이 증가함에 따라 이를 극복할 새로운 항생제의 개발이 요구되고 있다. 다약제 내성균에 유효한 항생제의 예로 vancomycin, teicoplanin, linezolid가 다약제 내성균에 유효한 의약품으로 쓰이고 있으며 방선균이나 Bacillus 등의 배양액에서 다약제 내성균에 유효한 물질의 발굴에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 넓은 항균범위를 가지고, 체내 축척이 적은 항생물질에 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구진은 국내 서해안의 갯벌에서 Bacillus 속 미생물을 수종 분리하였으며, 다약제 내성균에 항균 활성을 지니는 MP56 균주를 선발하였고, 균주 동정 결과 Bacillus subtilis 와 99.93%의 16S rRNA 상동성을 나타냄을 본 연구에서 확인하였다. 국내외 연구진에 의하여 다수의 Bacillus 속 미생물이 분리된 바가 있으며, 항균 물질에 대한 연구도 보고된 바 있다. 그러나 국내 갯벌에서 분리된 Bacillus 속 균주 배양액의 임상균주에 대한 항균 효능 평가에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 본 연구에서 Bacillus 속 균주 MP56 배양액이 국내에서 분리한 임상 균주인 MRSA, IMP 균주에 대해 우수한 항균 활성을 나타내어 최적 발효조건과 항균범위를 본 논문을 통해 보고하였으며, 추후 MP56 균주 배양액에서 항균물질의 분리, 정제 및 구조 규명을 위한 후속 연구를 수행 할 예정이다.
A new Bacillus strain designated as MP56 producing antimicrobial substance has been isolated from the mud flat of Korea. The strain MP56 was found to exhibit broad spectrum of antimicrobial activity against Gram-positive pathogenic microorganisms and MDR (multi drug resistant) strains. The 16S rRNA ...
A new Bacillus strain designated as MP56 producing antimicrobial substance has been isolated from the mud flat of Korea. The strain MP56 was found to exhibit broad spectrum of antimicrobial activity against Gram-positive pathogenic microorganisms and MDR (multi drug resistant) strains. The 16S rRNA sequence revealed that the MP56 was closely related to Bacillus subtilis with 99.93% homology. The optimal medium composition for production of antimicrobial substance in the B. subtilis MP56 were 1% mannitol, 1% oat meal, 0.01% $CaCl_2$. Antimicrobial activity of the culture broth against different pathogenic strains was assessed using the antimicrobial spectrum. The result suggests that Bacillus strain MP56 produces high quality antimicrobial substance that might be very useful to control varieties of pathogenic microbial growth.
A new Bacillus strain designated as MP56 producing antimicrobial substance has been isolated from the mud flat of Korea. The strain MP56 was found to exhibit broad spectrum of antimicrobial activity against Gram-positive pathogenic microorganisms and MDR (multi drug resistant) strains. The 16S rRNA sequence revealed that the MP56 was closely related to Bacillus subtilis with 99.93% homology. The optimal medium composition for production of antimicrobial substance in the B. subtilis MP56 were 1% mannitol, 1% oat meal, 0.01% $CaCl_2$. Antimicrobial activity of the culture broth against different pathogenic strains was assessed using the antimicrobial spectrum. The result suggests that Bacillus strain MP56 produces high quality antimicrobial substance that might be very useful to control varieties of pathogenic microbial growth.
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문제 정의
이들은 peptide 계열에 속하며, 항생제 내성을 보이지 않거나 생체내에 축적되지 않는 장점을 가지고 있어 의약, 동물의약 산업 등에 천연 항생 소재로써 개발 가치가 크다. 따라서 본 연구자들은 항생제 내성 세균에 유효한 항균성 물질을 생산하는 Bacillus 속 균주를 전남 서해안의 갯벌에서 순수 분리하여, 균주 동정 및 최적 발효조건, 항균 효능을 조사하였다.
제안 방법
MP56 균주의 16S rRNA 염기서열분석을 위하여 27F (forward primer, 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R (reverse primer, 5′-GGT TACCTTGTTACGACTT-3′) 2개의 primer를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.
MP56 균주의 항균활성 검증은 그람 양성, 음성 세균 및 다약제내성 세균에 대하여 조사하였다. 시험균주는 muller hinton broth에서 37℃ 조건으로 배양하여 탁도를 McFarland 탁도가 0.
질소원은 yeast extract, peptone, tryptone, malt extract, beef extract, oat meal, soy bean meal, NH4Cl, ammonium sulfate 등을 각각 1% (w/v) 농도로 첨가한 후 탄소원의 검토 방법과 동일하게 수행하였다. 금속원소는 CaCl2, NaCl, KCl, MgCl2, Na2HPO4, MgSO4 및 MnSO4 등을 각각 0.01% (w/v)씩 첨가하여 탄소원의 검토방법과 동일하게 수행하였다.
4). 무기물질 및 금속염류가 항생물질에 생산에 미치는 영향을 검토하기 위해 mannitol 1%, oat meal 1%에 0.01%의 무기물질 및 금속염을 첨가하여 항생물질 생성에 관한 실험을 하였으며, 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 표에서 나타낸 바와 같이 CaCl2를 사용하였을 때 가장 우수한 항생물질 생산능을 나타내었다.
5%씩 접종한 후 37℃에서 24시간, 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양액은 원심 분리하여 Staphylococcus aureus KCTC 1928 균주에 대한 항균활성을 측정하여 탄소원에 따른 상대적인 항균효능을 비교하였다. 질소원은 yeast extract, peptone, tryptone, malt extract, beef extract, oat meal, soy bean meal, NH4Cl, ammonium sulfate 등을 각각 1% (w/v) 농도로 첨가한 후 탄소원의 검토 방법과 동일하게 수행하였다.
분리 균주의 최적배지 성분은 질소원 고정하에 탄소원은 mannitol, fructose, glucose, D-sorbitol, maltose, lactose 및 sucrose를 각각 1% (w/v) 농도로 첨가하고 MP56 균주의 전 배양액을 1.5%씩 접종한 후 37℃에서 24시간, 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양액은 원심 분리하여 Staphylococcus aureus KCTC 1928 균주에 대한 항균활성을 측정하여 탄소원에 따른 상대적인 항균효능을 비교하였다.
배양 후 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 수종의 Bacillus를 선별하여 동일 배지에 3회 반복 도말하여 균체를 순수 분리하였다. 분리된 Bacillus 중 항균 활성이 뛰어난 균주를 선발하기 위해 그람 양성, 음성세균 및 다약제 내성균(MRSA, VRSA, VRE 등)을 시험 균으로 사용하여 가장 넓은 항균 스펙트럼을 나타내는 Bacillus 를 선택하였다.
시험 균주를 Muller Hinton agar 배지에 0.1 ml 도말하고 MP56 균주의 배양액 40 μl를 paper disk (Toyo, 0.8 mm)에 적하한 후 37℃에서 배양하여 나타나는 생육 저지환의 크기로 항균활성을 평가하였다.
MP56 균주의 항균활성 검증은 그람 양성, 음성 세균 및 다약제내성 세균에 대하여 조사하였다. 시험균주는 muller hinton broth에서 37℃ 조건으로 배양하여 탁도를 McFarland 탁도가 0.5가 되도록 조절하여 항균시험에 사용하였다. 항균활성 검증은 paper disk diffusion method (Toama et al.
배양액은 원심 분리하여 Staphylococcus aureus KCTC 1928 균주에 대한 항균활성을 측정하여 탄소원에 따른 상대적인 항균효능을 비교하였다. 질소원은 yeast extract, peptone, tryptone, malt extract, beef extract, oat meal, soy bean meal, NH4Cl, ammonium sulfate 등을 각각 1% (w/v) 농도로 첨가한 후 탄소원의 검토 방법과 동일하게 수행하였다. 금속원소는 CaCl2, NaCl, KCl, MgCl2, Na2HPO4, MgSO4 및 MnSO4 등을 각각 0.
대상 데이터
aureus ATCC 10537, Staphylococcus aureus KCTC 1928 (R209), Staphylococcus aureus ATCC 6538p를 한국생명공학 연구원생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, KCTC)에서 분양 받아 사용하였으며, 다약제 내성균인 MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus), VRE (vancomycin resistant Enterococci), IMP (carbapenemase 생성 imipenem 내성균), ESBL (extended-spectrum β-lactamase 생성균)는 순천대학교 생물학과 미생물학 실험실에서 분양 받아 사용하였다.
전남 서해안의 갯벌에서 수집한 시료를 멸균 증류수에 현탁시켜 단계 희석법을 이용하여 균주를 MRS 배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 약 20종의 Bacillus 균주를 선별하였다. 순수 분리된 Bacillus 균주 중 그람 양성, 음성 세균 및 다약제 내성균(MRSA, VRSA, VRE 등)에 우수한 저해 활성을 보이는 균주를 선발하여 MP56이라고 명명하였다(Fig.
전남 서해안의 갯벌에서 수집한 시료 1 g을 멸균 증류수 10 ml에 현탁시키고, 10–106의 희석배수로 단계 희석하였다.
전남 서해안의 갯벌에서 수집한 시료를 멸균 증류수에 현탁시켜 단계 희석법을 이용하여 균주를 MRS 배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 약 20종의 Bacillus 균주를 선별하였다.
데이터처리
결정된 16S rRNA 유전자는 GenBank 데이터베이스와 비교 검색하였으며 계통수 작성은 neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987) 방법을 이용하였으며 진화거리는 Jukes와 Cantor (1969)의 식을 이용하였다. 계통수의 신뢰도는 1,000회 반복을 통한 bootstrap 분석(Felsenstein, 1985)을 실시하여 확인하였다.
이론/모형
MP56 균주의 16S rRNA 염기서열분석을 위하여 27F (forward primer, 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)와 1492R (reverse primer, 5′-GGT TACCTTGTTACGACTT-3′) 2개의 primer를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 결정된 16S rRNA 유전자는 GenBank 데이터베이스와 비교 검색하였으며 계통수 작성은 neighbor-joining (Saitou and Nei, 1987) 방법을 이용하였으며 진화거리는 Jukes와 Cantor (1969)의 식을 이용하였다. 계통수의 신뢰도는 1,000회 반복을 통한 bootstrap 분석(Felsenstein, 1985)을 실시하여 확인하였다.
5가 되도록 조절하여 항균시험에 사용하였다. 항균활성 검증은 paper disk diffusion method (Toama et al., 1978)에 따라 시험하였다. 시험 균주를 Muller Hinton agar 배지에 0.
성능/효과
3과 같다. MP56 균주는 mannitol과 sucrose순으로 높은 항생물질 생산능을 보여주었다. Fructose, glucose, lactose는 균주 생장을 증가시켰으나 항생물질 생산능이 비교적 낮았다.
그러나 그람 양성균인 Staphylococcus aureus KCTC 1928, Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 10537, Staphylococcus aureus KCTC 1928 (R209) 및 Staphylococcus aureus ATCC 6538p에서 감수성을 보였다. 특히 최근 국내 임상 환자에서 분리된 MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) 균주 9종과 imipenem 내성균주 5종에 대해 감수성을 보였다(Table 1).
그람 양성세균 그람 음성세균 및 다제내성균을 대상으로 MP56 균주 배양액의 항균 활성을 조사한 결과, 그람 음성균에는 감수성을 보이지 않았다. 그러나 그람 양성균인 Staphylococcus aureus KCTC 1928, Staphylococcus aureus subsp.
특히 넓은 항균범위를 가지고, 체내 축척이 적은 항생물질에 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구진은 국내 서해안의 갯벌에서 Bacillus 속 미생물을 수종 분리하였으며, 다약제 내성균에 항균 활성을 지니는 MP56 균주를 선발하였고, 균주 동정 결과 Bacillus subtilis와 99.93%의 16S rRNA 상동성을 나타냄을 본 연구에서 확인하였다. 국내외 연구진에 의하여 다수의 Bacillus 속 미생물이 분리된 바가 있으며, 항균 물질에 대한 연구도 보고된 바 있다.
배양 후 육안으로 집락의 형태, 색 등의 형태적 특징에 따라 약 20종의 Bacillus 균주를 선별하였다. 순수 분리된 Bacillus 균주 중 그람 양성, 음성 세균 및 다약제 내성균(MRSA, VRSA, VRE 등)에 우수한 저해 활성을 보이는 균주를 선발하여 MP56이라고 명명하였다(Fig. 2). 항균 물질을 생산하는 Bacillus 속 균주는 메주, 김치, 토양 등 다양한 소재에서 분리가 보고되었으나 갯벌에서 분리한 항균물질 생산 Bacillus 균주에 대한 보고는 없었다(Chang and Yang, 2007; Moshafi et al.
NaCl, KCl, MgCl2, Na2HPO4, MgSO4 및 MnSO4를 첨가한 경우는 항생물질 생산능의 저하를 보이지는 않았다. 이상과 같이 MP56 균주의 항균 물질 생산을 위한 최적 배지조성은 mannitol 1%, oat meal 1%, CaCl2 0.01%였다. Bacillus subtilis MP56을 최적 배양조건으로 배양할 때 배양시간이 항균 물질의 생산에 미치는 영향을 검토하여 세포량, 활성의 변화, pH 변화는 Fig.
Fructose, glucose, lactose는 균주 생장을 증가시켰으나 항생물질 생산능이 비교적 낮았다. 질소원에 따른 항생물질 생산을 검토한 결과 유기질소원은 항생물질의 생산에 전체적으로 좋은 효과를 보이는 반면, 무기질소원은 항생물질의 생산이 아주 낮거나 없는 것으로 보아 항생물질의 생산에 유기질소원이 효과적으로 쓰이는 것을 알 수 있었으며 유기 질소원 중 oat meal이 가장 높은 항생물질 생산효과를 나타내었다(Fig. 4). 무기물질 및 금속염류가 항생물질에 생산에 미치는 영향을 검토하기 위해 mannitol 1%, oat meal 1%에 0.
aureus ATCC 10537, Staphylococcus aureus KCTC 1928 (R209) 및 Staphylococcus aureus ATCC 6538p에서 감수성을 보였다. 특히 최근 국내 임상 환자에서 분리된 MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) 균주 9종과 imipenem 내성균주 5종에 대해 감수성을 보였다(Table 1). Kim 등(2010)은 Bacillus polyfermenticus KJS-2에서 macrolactin 계열의 물질을 정제하여 macrolactin A, 7-O-malonyl macrolactin A, 7-O-succinyl macrolactin A, macrolactin E 및 macrolactin F의 구조를 규명하였으며 특히 3종의 항생물질인 macrolactin A, 7-O-malonyl macrolactin A, 7-O-succinyl macrolactin A는 4종의 MRSA, VRE에 효과적으로 성장억제를 나타내었다.
5에 나타내었다. 표에서 나타낸 바와 같이 CaCl2를 사용하였을 때 가장 우수한 항생물질 생산능을 나타내었다. NaCl, KCl, MgCl2, Na2HPO4, MgSO4 및 MnSO4를 첨가한 경우는 항생물질 생산능의 저하를 보이지는 않았다.
6에 나타내었다. 항균 물질은 10시간째에 최대로 생산되었으며 이후 48시간까지 안정적으로 활성이 유지되었다. Yoo 등(2007)이 동정한 Bacillus 속 균주는 48시간 배양후 활성이 급격히 떨어져 12–36시간을 최적 배양시간으로 보고하였다.
후속연구
그러나 국내 갯벌에서 분리된 Bacillus 속 균주 배양액의 임상균주에 대한 항균 효능 평가에 관한 연구는 보고된 바가 없다. 본 연구에서 Bacillus 속 균주 MP56 배양액이 국내에서 분리한 임상 균주인 MRSA, IMP 균주에 대해 우수한 항균 활성을 나타내어 최적 발효조건과 항균범위를 본 논문을 통해 보고하였으며, 추후 MP56 균주 배양액에서 항균물질의 분리, 정제 및 구조 규명을 위한 후속 연구를 수행 할 예정이다.
식품, 토양 유래 Bacillus 속 미생물이 생산하는 항균 물질 중 MRSA, VRE 같은 임상 균주에 효과적인 소재는 많이 연구되고 있으나, imipenem 내성균에 유효한 성분에 대한 연구는 많지 않다. 본 연구진이 분리한 B. subtilis MP56균주는 최근 분리된 methicillin 및 imipenem 내성균주에 대하여 고른 항균 활성을 보여 다제내성균을 극복하기 위한 의약소재로써 응용 가능함을 시사하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Bacillus subtilis의 생장 특성은?
Bacillus 속 미생물 중 Bacillus subtilis는 포자 형성균으로 토양이나 물 등에서 자라며 대부분이 유기물을 분해하는 특성을 가진다. 또한 메주, 청국장의 발효에 이용되는 미생물로써 그 유용성과 안전성이 널리 인정되어 있다.
Bacillus 속 미생물이 생산하는 대표적인 항생물질들의 장점은?
, 1993). 이들은 peptide 계열에 속하며, 항생제 내성을 보이지 않거나 생체내에 축적되지 않는 장점을 가지고 있어 의약, 동물의약 산업 등에 천연 항생 소재로써 개발 가치가 크다. 따라서 본 연구자들은 항생제 내성 세균에 유효한 항균성 물질을 생산하는 Bacillus 속 균주를 전남 서해안의 갯벌에서 순수 분리하여, 균주 동정 및 최적 발효조건, 항균 효능을 조사하였다.
다약제 내성 세균에는 무엇이 있는가?
오늘날까지 사람과 동물에게 사용된 광범위한 항생제의 사용으로 인해 다양한 항생제에 내성을 가진 세균이 출현하였고 신종 항생제 내성 세균의 보고 건수도 해마다 증가하고 있다(Alanis, 2005). 다약제 내성 세균에는 MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus), VRSA (vancomycin resistant Staphylococcus aureus), VRE (vancomycin resistant enterococci) 등이 있다. MRSA의 경우 1961년 영국에서 보고되었고, 국내에서는 80년대부터 보고되기 시작하여 현재는 원내감염의 대표적 원인균으로 간주되고 있다(Turos et al.
참고문헌 (21)
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