LPS로 유도한 RAW 264.7 세포의 염증반응에서 자초(紫草)의 항염증 효과 The anti-inflammatory effect of Lithospermum Erythrorhizon on lipopolysaccharide - induced inflammatory response in RAW 264.7 cells원문보기
Objective : Lithospermum Erythrorhizon (LE) has been used as an anti-bacterial and anti-inflammatory agent. However, it is unclear that LE aqueous extract could show the anti-inflammatory effects in RAW 264.7cells. The purpose of this study was to investigate the anti-inflammatory effect of aqueous ...
Objective : Lithospermum Erythrorhizon (LE) has been used as an anti-bacterial and anti-inflammatory agent. However, it is unclear that LE aqueous extract could show the anti-inflammatory effects in RAW 264.7cells. The purpose of this study was to investigate the anti-inflammatory effect of aqueous extract from LE on lipopolysaccharide (LPS) - induced inflammatory response. Methods : To measure out the cytotoxicity of LE, we performed the MTT assay. To evaluate the anti-inflammatory effects of LE, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), prostaglandin E2 ($PGE_2$) and pro-inflammatory cytokines (tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$, interleukin, (IL)-$1{\beta}$ and (IL)-6) on RAW 264.7 cells. We also examined molecular mechanisms such as mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor-B (NF-${\kappa}B$) activation by western blot. Results : Aqueous Extract from LE itself did not have any cytotoxic effect in RAW 264.7 cells. Aqueous extract from LE inhibited LPS-induced productions of inflammatory mediators such as NO, $PGE_2$, and pro-inflammatory cytokines including TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$ and IL-6 in RAW 264.7cells. In addition, LE inhibited the phosphorylation of p38 kinases (p38), c-Jun $NH_2$-terminal kinase (JNK), and NF-${\kappa}B$ activation in RAW 264.7 cells. Conclusion : LE down-regulated LPS-induced production of inflammatory mediators through the inhibition of p38, JNK and NF-${\kappa}B$ activation. Taken together, these results could provide the evidence for the anti-inflammatory effects of LE. Therefore, LE may be a novel target in the management of inflammation and help to support a potential strategy for prevention and therapy of inflammatory diseases.
Objective : Lithospermum Erythrorhizon (LE) has been used as an anti-bacterial and anti-inflammatory agent. However, it is unclear that LE aqueous extract could show the anti-inflammatory effects in RAW 264.7cells. The purpose of this study was to investigate the anti-inflammatory effect of aqueous extract from LE on lipopolysaccharide (LPS) - induced inflammatory response. Methods : To measure out the cytotoxicity of LE, we performed the MTT assay. To evaluate the anti-inflammatory effects of LE, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), prostaglandin E2 ($PGE_2$) and pro-inflammatory cytokines (tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$, interleukin, (IL)-$1{\beta}$ and (IL)-6) on RAW 264.7 cells. We also examined molecular mechanisms such as mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor-B (NF-${\kappa}B$) activation by western blot. Results : Aqueous Extract from LE itself did not have any cytotoxic effect in RAW 264.7 cells. Aqueous extract from LE inhibited LPS-induced productions of inflammatory mediators such as NO, $PGE_2$, and pro-inflammatory cytokines including TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$ and IL-6 in RAW 264.7cells. In addition, LE inhibited the phosphorylation of p38 kinases (p38), c-Jun $NH_2$-terminal kinase (JNK), and NF-${\kappa}B$ activation in RAW 264.7 cells. Conclusion : LE down-regulated LPS-induced production of inflammatory mediators through the inhibition of p38, JNK and NF-${\kappa}B$ activation. Taken together, these results could provide the evidence for the anti-inflammatory effects of LE. Therefore, LE may be a novel target in the management of inflammation and help to support a potential strategy for prevention and therapy of inflammatory diseases.
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문제 정의
紫草에 관한 문헌적, 약리학적으로 여러 연구들이 진행되었을 뿐만 아니라, 최근에는 紫草 메탄올 추출물의 항염증 효과에 대한 연구가 보고 되어졌다19). 그러나 紫草 물 추출물의 항염증 효과에 대해서는 아직 알려진 바가 없어 이에 본 연구에서는 紫草 물 추출물을 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 염증매개물질들의 생성증가에 미치는 영향을 조사하고, 그의 따른 기전을 밝혀냄으로써 자초의 항염증 효과를 살펴보고자 하였다.
이에 본 연구는 紫草의 RAW 264.7 cell에서 항염증작용 및 기전을 밝히고자 자초 물 추출물을 LPS로 유도하여 염증 매개물질인 NO, PGE2 , 전 염증성 cytokine의 발현을 실험하였고, 이에 따른 기전을 조사하기 위해 MAPKs과 NFκB의 활성화를 조사하여 염증반응의 억제에 대한 여부를 확인하였다.
동일한 양의 단백질을 샘플링 버퍼 (4X)를 같이 넣어 섞은 다음 샘플을 10 % SDS-PAGE에 전기영동 한 후 맴브레인에 옮기고 나서 5 % skim milk로 2 시간 blocking 하였다. ERK, p38, JNK의 phosphorylation과 NF-kB를 ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다.
LE 추출물이 세포 생존율에 영향을 주는지를 검사하기 위해서 RAW 264.7 세포에 LE 추출물을 처리하여 MTT 방법으로 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 LE는 0.
LE물 추출물이 RAW 264.7 세포에서 전 염증성 cytokine들을 단백질 수준에서 억제하였음에 착안하여 (Fig. 3), mRNA 수준에서도 전 염증성 cytokine의 활성을 억제하는지 알아보기 위해 LE를 전처리한 후 LPS로 자극 하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA를 정량적 중합 효소 반응 방법으로 측정을 하였다.
LPS (500 ng/㎖)로 RAW 264.7 세포에 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 알아보기 위하여, LPS를 자극하기 전 LE 추출물을 1시간동안 전처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질은 세포 상층액에서 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)법으로 정량하였다.
PCR반응이 끝난 후 1X 샘플링 buffer를 섞은 뒤 1.5% agarose gel에 10 µl씩을 넣고 전기영동 한 후 자외선을 이용하여 반응을 확인하였다.
RAW 264.7 cell을 60 mm culture dish에 5 x 106 cells/dish로 세포를 배양하고 serum free media (RPMI 1640)로 12시간 starvation 시킨 후 LE (1 mg/ml)를 전처리 하고 LPS (500 ng/ml)로 자극하여 0, 15, 30, 60 분 뒤에 cold PBS로 3회 세척한 후 cell을 획득하여 원심분리 (5,000 rpm, 5 min)하여 그 상층액을 버리고 cell pellet을 수거하였다. RIPA lysis buffer (RIPA buffer 1 ml + phosphotase inhibitor 10 µl + protase inhibitor 10 µl)를 넣어 단백질을 lysis 시켜서 원심분리 (15,000 rpm, 20 min)하여 찌꺼기를 가라앉히고 단백질 정량하였다.
7 세포에서 염증반응의 지표인 iNOS 및 COX-2 생성에 미치는 영향을 알아보고자 RT-PCR의 방법으로 분석하였다. RAW 264.7 세포에 LE 추출물을 다양한 농도별로 1시간 동안 전 처리한 후 LPS를 자극하였다. LE 추출물을 전 처리한 군에서는 iNOS발현을 mRNA 수준에서 억제하였으며(Fig.
RAW 264.7 세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)용액을 이용하여 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 × 105 /ml의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 LE를 처리하였다.
iNOS에 의한 NO의 과도한 생성과 COX-2에 의한 PGE2의 생성은 염증반응의 특징으로서, LPS로 유도한 LE 추출물이 RAW 264.7 세포에서 염증반응의 지표인 iNOS 및 COX-2 생성에 미치는 영향을 알아보고자 RT-PCR의 방법으로 분석하였다. RAW 264.
mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1 µl, Real time PCR master mix 4 µl (Roche), primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응 시켰다.
간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 × 105 /ml의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 LE를 처리하였다.
세포들은 RPMI-1640배지에서 2 × 105의 밀도로 현탁 하였고, 여러 가지 농도로 SC를 처리하였다.
PCR 조건은 92℃에서 30초, 60℃에서 45초, 그 후에 72℃에서 30초를 40 cycle로 하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 forward(f)와 reverse(r) primer 및 TaqMan probe는 Roche (Basel, Switzerland)에서 합성 하였다. 사용한 primer는 다음과 같다.
대상 데이터
Fetal bovine serum (FBS), RPMI Medium 1640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL(Grand Island, USA)사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 시약 중 Chloroform, TRI-zol, Sodium dodesylsulfate (SDS), Acrylamide, Tris-HCL, LPS 등은 SIGMA (St. Louis, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 항체인 anti-phospho-ERK1/2, anti-phospho-p38, anti-phospho-JNK는 Cell Signaling (MA, USA)사에서 구입하였고, Anti-Iκ-Bα는 Santa Cruz (CA, USA)사에서 구입하였다.
마우스의 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양받았다. 세포배양을 위해 10% Fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillinstreptomycin을 첨가한 RPMI-1640 배지를 사용하였다.
본 실험에 사용한 紫草는 옴니허브(영천, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 紫草 추출물을 얻기 위하여 물 1ℓ에 紫草 100 g을 넣고 2시간 30분 동안 전탕한 액을 여과한 후 동결 건조하여 3차 증류수에 녹여서 필터한 후 사용하였다.
7은 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양받았다. 세포배양을 위해 10% Fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillinstreptomycin을 첨가한 RPMI-1640 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
실험에 사용된 항체인 anti-phospho-ERK1/2, anti-phospho-p38, anti-phospho-JNK는 Cell Signaling (MA, USA)사에서 구입하였고, Anti-Iκ-Bα는 Santa Cruz (CA, USA)사에서 구입하였다.
이미 여러 연구에서 紫草의 효능이 소염, 항암 등 촉진효과가 보고되어 있다17,18). 이상의 선행연구를 살펴본 바 紫草가 염증성 면역 반응에서도 유효한 효과를 나타낼 것으로 사료되어 본 실험의 약물로 선택하였다. 紫草에 관한 문헌적, 약리학적으로 여러 연구들이 진행되었을 뿐만 아니라, 최근에는 紫草 메탄올 추출물의 항염증 효과에 대한 연구가 보고 되어졌다19).
데이터처리
모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean ± S.D.로 나타내었다.
로 나타내었다. 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 분석프로그램의 one way ANOVA에 준하였고, p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
LPS로 유도한 전염증성 cytokine의 생성에 대한 LE 추출물의 효과를 조사하기 위해, ELISA를 이용하여 측정하였다. LE 추출물을 1시간 전처리 한 후 LPS로 자극하였다.
7 세포에 LE 추출물을 다양한 농도별로 1시간 동안 전 처리한 후 LPS를 자극하였다. LE 추출물을 전 처리한 군에서는 iNOS발현을 mRNA 수준에서 억제하였으며(Fig. 2A), Griess 반응을 통한 세포 상층액의 NO 생성을 측정한 결과, iNOS 측정 결과와 일치하게 LE 전 처리군에서 LPS로 유도한 NO 생성을 억제하였다(Fig. 2B). 또한, LE 전처리군에서 염증 매개물질인 COX-2의 발현과 PGE2의 생성을 억제하였다 (Fig.
紫草 물 추출물은 본 연구에서 LPS로 유도된 p38, JNK의 인산화와 Iκ-Bα의 분해를 억제 하였다.
紫草 물 추출물을 전처리한 후 LPS를 처리한 군에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 단백질 단계 및 mRNA 수준에서 유의성 있게 억제하는 효과를 보였다.
그 결과 LE 추출물을 전 처리한 군에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현이 억제되었다 (Fig. 4).
7 세포에 LE 추출물을 처리하여 MTT 방법으로 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 LE는 0.1-1 mg/ml농도에서 80%이상의 생존율을 보이며, 세포 독성에 유의성 있는 영향을 미치지 않았다. 이에 0.
그러나 TNF-α의 경우 물 추출물에서 보다 억제함을 보여주었고, IL-1β 및 IL-6의 경우에는 메탄올 추출물에서 사이토카인 생성을 보다 억제함을 확인하였다.
그리고 NF-κB의 활성화 지표인 Iκ-Bα의 분해를 조사한 결과, LE 추출물이 LPS에 의한 Iĸ-Bα의 분해를 억제할 수 있었다 (Fig. 5).
2B). 또한, LE 전처리군에서 염증 매개물질인 COX-2의 발현과 PGE2의 생성을 억제하였다 (Fig. 2C and D).
이상의 결과를 종합하여 볼 때, 紫草는 p38, JNK의 인산화를 억제하고 NF-κB의 활성 억제를 통해 NO와 전염 증성 cytokine의 생산을 억제함을 확인 할 수 있었다. 또한, 紫草의 추출 용매에 따라 이전 연구와 그 효능을 비교한 바, 모두 항염증 효과를 보여주었다. 최근에는 실험 연구에서 메탄올 추출법으로 유효성분을 많이 추출하여 항염증, 항암 등의 연구로 많이 사용되고 있으나, 본 연구에서는 물 추출물에서도 항염증의 효과를 보였다.
또한 COX-2에 의해 형성된 PGE2는 염증 반응에 중요한 역할을 하며, 혈관생성을 유도하여 종양생성에 기여한다23). 이러한 염증매개인자들은 다양한 염증 질환들을 포함하는 병리학적 상태에 관여하는데 이상의 결과들은 紫草 물 추출물이 iNOS발현을 억제함으로써 NO생성을 억제한다는 것을 설명한다. 또한 紫草 메탄올 추출물19) 결과에서도 iNOS발현을 100 µg/ml에서 유의성 있게 억제하였으나, 물 추출물에서 메탄올 추출물 보다 고농도인 1 mg/kg에서 유의성 있게 억제함을 보여주고 있다.
LE 추출물 1 mg/ml의 농도로 전 처리한 후 LPS를 시간대별로 자극하였다. 이를 분석한 결과 LE 추출물은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 p38, JNK가 인산화 되었고, ERK1/2는 인산화를 억제하지 못하였다. 그리고 NF-κB의 활성화 지표인 Iκ-Bα의 분해를 조사한 결과, LE 추출물이 LPS에 의한 Iĸ-Bα의 분해를 억제할 수 있었다 (Fig.
이상의 결과는 紫草 물 추출물이 RAW 264.7 세포에 작용하여 NO 및 PGE2의 생성, TNF-α, IL-1β, IL-6의 생산을 억제하였으며, MAPKs 중 p38, JNK의 인산화와 Iκ -Bα의 분해를 억제하였다.
이상의 결과를 종합하여 볼 때, 紫草는 p38, JNK의 인산화를 억제하고 NF-κB의 활성 억제를 통해 NO와 전염 증성 cytokine의 생산을 억제함을 확인 할 수 있었다.
또한, 紫草의 추출 용매에 따라 이전 연구와 그 효능을 비교한 바, 모두 항염증 효과를 보여주었다. 최근에는 실험 연구에서 메탄올 추출법으로 유효성분을 많이 추출하여 항염증, 항암 등의 연구로 많이 사용되고 있으나, 본 연구에서는 물 추출물에서도 항염증의 효과를 보였다. 지금까지도 거의 대부분의 한약재는 물로 전탕한 액을 복용을 하였으므로 한의학적으로 물 추출물에 대한 연구는 의의가 있다고 사료된다.
후속연구
지금까지도 거의 대부분의 한약재는 물로 전탕한 액을 복용을 하였으므로 한의학적으로 물 추출물에 대한 연구는 의의가 있다고 사료된다. 결론적으로, 紫草의 항염증효과는 염증성 질환의 예방과 치료에 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 앞으로 紫草의 in vivo 실험 및 추출 방법에 따른 성분 분석에 대하여 추가적인 실험들도 함께 이루어져 항염증 작용에 이해를 도울 수 있을 것으로 생각된다.
또한 MAPKs이나 NF-κB의 활성 조절이 될 경우 급, 만성 염증질환의 치료에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 생각된다.
결론적으로, 紫草의 항염증효과는 염증성 질환의 예방과 치료에 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 앞으로 紫草의 in vivo 실험 및 추출 방법에 따른 성분 분석에 대하여 추가적인 실험들도 함께 이루어져 항염증 작용에 이해를 도울 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증이란?
염증은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응으로 하나로 작용할 뿐만 아니라, 많은 병리 생리학적인 조건에서 중요한 역할을 한다. 염증이 진행되는 동안 대식세포의 활성화가 과도하게 일어나게 되면 염증매개물질 분비를 통해 염증반응을 유도함으로써, 류마티스 관절염, 죽상 동맥경화 증, 패혈증과 같은 질환을 일으키기도 한다1,2).
lipopolysaccharide의 특징은?
그람 음성균의 외막성분인 lipopolysaccharide (LPS)는 대식세포의 감염초기에 반응하고 숙주 방어에 중추적인 역할을 하나, 과도한 LPS 자극은 대식세포에서 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β 및 IL-6와 같은 전 염증성 매개물질을 분비시키며, nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2)등의 염증매개물질을 분비시킨다3,4). NO는 대식세포가 활성화되면 inducible NO synthase (iNOS)로부터 생산되며 박테리아를 죽이거나 종양을 제거하는 역할도 하지만, 과도한 생성은 염증을 유발 시켜 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경손상을 일으키는 것으로 알려져 있다 5) .
RAW 264.7 세포를 LPS로 자극하였을 때 紫草 물 추출물의 항염증 효과를 조사하여 얻은 결론은?
1. 紫草 추출물은 세포독성을 거의 나타내지 않았다.
2. 紫草 추출물은 농도 의존적으로 NO 및 PGE2 생성을 억제하였다.
3. 紫草 추출물은 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증성 cytokine의 생성을 단백질 수준과 mRNA 수준에서 억제하였다.
4. 紫草 추출물은 p38, JNK의 인산화를 억제하였고, 또한 Iκ-Bα의 분해를 억제하였다.
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