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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 마우스 대식 세포주인 RAW 264.7 세포에서 해죽순 물 추출물을 이용하여 항염증 효과 및 항염증 기전을 연구하고자 한다. RAW264.
- 랫트에서 고혈당 억제 및 인지 개선 효과가 탁월함을 보고한 논문에 따르면13, 14), 해죽순 물 추출물 및 메탄올 추출물에서 모두 효과가 뛰어남을 볼 수 있었다. 항산화 성분이 다량 함유되어 있고, 항염증 효능이 좋은 약물을 연구하던 중, 해 죽순을 접하게 되었고 본 연구에서는 국내에 수입된 해 죽순을 이용하여 항염증 연구를 진행해 보았다. 연구를 진행한 결과, 해 죽순은 대식세포 염증 시 발생하는 다량의 염증성 매개 물질을 억제하였고, 또한 염증성 매개 물질 조절하는 주요 기전인 NF-κB를 억제하는 것을 발견할 수 있었다.
제안 방법
- 7 cell을 24시간 동안 LPS로 자극하여 및Ⅱ.-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현을 정량적 중합 효소 반응 방법으로 측정하였다. 그 결과 해죽순 물 추출물을 전 처리한 군에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었다 (Fig.
- 4% paraformaldehyde로 세포를 고정한 후, 0.1% Triton-100으로 permeabilization을 하고, 1% FBS로 2 시간 blocking 하였다. NF-κB p65 항체를 overnight 반응 후, Alexa 488 goat anti-mouse 항체를 2시간 반응시켰다.
- ELISA는 BD pharmingen (CA, USA)에서 Mouse ELISA kit for IL-1β, IL-6, TNF-α를 구입하여 시행하였다.
- 동일한 양의 단백질을 샘플링 버퍼 (4X) 를 같이 넣어 섞은 다음 샘플을 전기영동 한 후 membrane에 옮기고 나서 5% skim milk로 2시간 Iblocking 하였다. Iκ-Bα와 β-actine ECL detection 용액 (Amersham) 으로 확인하였다.
- LPS로 유도한 대식세포에서 염증 발생 시, 해 죽순이 전 염증성 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 ELISA 방법을 이용해 전 염증성 사이토카인의 단백질 수준을 측정하였다. 해죽순 물 추출물을 1시간 전 처리한 후 RAW 264.
- RAW 264.7 대식세포를 LPS로 염증 반응을 일으켰을 때, 해죽순 물 추출물의 항염증 효과와 항염증 기전을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 7 세포에서 해죽순 물 추출물을 이용하여 항염증 효과 및 항염증 기전을 연구하고자 한다. RAW264.7 세포에 LPS로 염증을 유도하여 염증 매개 물질인 nitrite 및 전 염증성 사이토카인의발현을 조사하였고, 항염증 기전을 조사하기 위하여 NF-κB 의 활성화를 조사하였다.
- mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1 µl, Real time PCR master mix 4 µl (ABI), primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응 시켰다.
- 세포의 핵은 DAPI (Sigma, MO, USA) (5 mg/ml) 사용하여 5분간 염색하고, prolong gold anti-fading mount solution (invitrogen, CA, USA)를 이용하여 mounting 하였다. 그 후 Flourscence microscopy (Olympus X 70, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- NF-κB p65 항체를 overnight 반응 후, Alexa 488 goat anti-mouse 항체를 2시간 반응시켰다. 세포의 핵은 DAPI (Sigma, MO, USA) (5 mg/ml) 사용하여 5분간 염색하고, prolong gold anti-fading mount solution (invitrogen, CA, USA)를 이용하여 mounting 하였다. 그 후 Flourscence microscopy (Olympus X 70, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- 해죽순 물 추출물을 1시간 전 처리한 후 RAW 264.7 cell을 24시간 동안 LPS로 자극하였다. 그 후 전 염증성사이토카인의 발현을 측정한 결과, 해죽순 처리군에서 Ⅱ.
- 7 세포가 LPS에 의하여 염증이 일어나게 되면 다양한 신호 전달 기전에 의하여 염증성 매개물질들을 분비하게 되는데, 대표적인 경로로 NF-κB가 있다. 해죽순 물 추출물을 전 처리한 후 LPS로 대식세포를 30분간 자극하였다. 이를 분석한 결과 해죽순 물 추출물은 LPS에 의하여 염증이 활성화된 RAW 264.
- 해죽순 물 추출물이 RAW 264.7 cell에서 전 염증성 사이토카인들을 단백질 수준에서 억제하였음을 착안하여 mRNA 수준에서도 전 염증성 cytokine의 활성을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 해죽순 물 추출물을 1시간 전 처리 한 후 RAW 264.7 cell을 24시간 동안 LPS로 자극하여 및Ⅱ.-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현을 정량적 중합 효소 반응 방법으로 측정하였다.
- 해죽순 물 추출물이 세포의 생존율을 억제하여 연구 결과에 영향을 주는지를 조사하기 위해서 RAW 264.7 세포에 해 죽순 물 추출물을 처리하여 MTT 방법을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과 해죽순는 200 ㎍/ml 농도까지는 유의성 있는 세포 독성을 보이지 않았고, 500 ㎍/ml 농도부터는 큰 독성을 보였다.
- 해죽순 물 추출물이 염증에서의 nitrite의 생성에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위하여, 해 죽순을 대식세포에 1시간 전 처리한 후, LPS로 염증을 유도하였다. Griess 반응을 통한 nitrite 생성을 측정한 결과 해죽순 전 처리 군에서 LPS로 유도한 nitrite 생성을 억제하였다 (Fig.
대상 데이터
- Fetal bovine serum, RPMI 1640 media, antibiotics 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, USA) 사에서 구입하였으며, chloroform, sodium dodesyl sulfate, sodium chloride, acrylamide, Tris-HCL, LPS, acetic acid 등은 SIGMA (St.Louis, USA) 사에서 구입하였다. 실험에 사용된 항체인 Iκ-Bα, NF-κB p65, β-actine Santa Cruz (CA, USA) 사에서 구입하였다.
- Louis, USA) 사에서 구입하였다. 실험에 사용된 항체인 Iκ-Bα, NF-κB p65, β-actine Santa Cruz (CA, USA) 사에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상을 사용하였다.
- PCR 조건은 92℃에서 30초, 58℃에서 45초, 그 후에 72℃에서 30초를 35 cycle로 하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 custom taqman probe (Cat.#4331182) 및 TaqMan master mix는 ABI (CA, USA)에서 구입하였다.
- 해 죽순은 토디팜코리아(서울, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다. 해죽순은 미얀마에서 수입되어 건조된 것을 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 정선한 후 사용하였다.
- 해죽순은 미얀마에서 수입되어 건조된 것을 원광대학교 한의과대학 본초학 교실에서 정선한 후 사용하였다. 해 죽순 물 추출물을 얻기 위하여 증류수 1ℓ에 해죽순 100 g을넣고 150분 동안 전탕한 액을 여과한 후, 여과액을 동결 건조하여 3차 증류수에 녹여서 필터한 후 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean ± S.E. 로 나타내었다. 실험 결과에 대한 통계처리는 SPSS 분석프로그램의 one way ANOVA에 준하였고, p-value 가 0.
- 로 나타내었다. 실험 결과에 대한 통계처리는 SPSS 분석프로그램의 one way ANOVA에 준하였고, p-value 가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 전염증성 사이토카인의 염증 매개 물질은 세포 상층액에서 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)법으로 정량하였다. ELISA는 BD pharmingen (CA, USA)에서 Mouse ELISA kit for IL-1β, IL-6, TNF-α를 구입하여 시행하였다.
성능/효과
- 이는 NF-κB활성을 해 죽순이 억제하였고, 이를 통하여 염증성 매개 물질을 억제하였음을 보여준다. (Fig. 5) 이상의 결과를 종합하면, 해 죽순은 NF-κB의 활성 억제를 통해 nitrite와 전염증성 사이토카인의 생성을 억제하였다. 많은 염증 질환의 치료 약 개발이 더딘 지금, 저비용 고효율의 천연물 소재인 해 죽순을 이용하여 항염증 효과를 처음 보고한 것은 큰 의의가 있다고 생각된다.
- 1. 해죽순 추출물은 대식세포에서 200 ㎍/㎖이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다.
- 2. 해죽순 추출물은 대식세포에서 농도 의존적으로 nitrite 의 생성을 억제하였다.
- 3. 해죽순 추출물은 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α 와 같은 염증성 cytokine의 생성을 억제하였다.
- 4. 해죽순 추출물은 대식세포에서 Iκ-Bα의 분해 및 NF-κB의 핵 전이를 억제하였다.
- 후, LPS로 염증을 유도하였다. Griess 반응을 통한 nitrite 생성을 측정한 결과 해죽순 전 처리 군에서 LPS로 유도한 nitrite 생성을 억제하였다 (Fig. 2).
- -1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현을 정량적 중합 효소 반응 방법으로 측정하였다. 그 결과 해죽순 물 추출물을 전 처리한 군에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었다 (Fig. 4).
- 7 세포에 해 죽순 물 추출물을 처리하여 MTT 방법을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과 해죽순는 200 ㎍/ml 농도까지는 유의성 있는 세포 독성을 보이지 않았고, 500 ㎍/ml 농도부터는 큰 독성을 보였다. 이에 본 연구에서는 200 ㎍/ml 이하의 농도 사용하였다 (Fig.
- 7 세포에서 Iκ-Bα의 분해를 억제하였다. 또한 NF-κB의 활성화 지표인 NF-κB의 핵 내로의 이동을 해 죽순 물 추출물이 억제하였다 (Fig. 5).
- NF-κB는 일반적으로 염증 반응이 없을 시, inhibitory kappaB (Iκ-B) 단백질과 결합 되어있는데, LPS 에 의하여 염증이 발생하여 NF-κB가 활성화되면, I κ-Bα가분해되고, NF-κB는 핵 내로 이동하여 여러 염증성 매개물질의 생성을 유도하게 된다18). 본 연구에서는 해죽순 물 추출물이 Iκ-Bα 분해를 억제하였고, NF-κB의 핵 내로의 이동을 억제하였다. 이는 NF-κB활성을 해 죽순이 억제하였고, 이를 통하여 염증성 매개 물질을 억제하였음을 보여준다.
- 항산화 성분이 다량 함유되어 있고, 항염증 효능이 좋은 약물을 연구하던 중, 해 죽순을 접하게 되었고 본 연구에서는 국내에 수입된 해 죽순을 이용하여 항염증 연구를 진행해 보았다. 연구를 진행한 결과, 해 죽순은 대식세포 염증 시 발생하는 다량의 염증성 매개 물질을 억제하였고, 또한 염증성 매개 물질 조절하는 주요 기전인 NF-κB를 억제하는 것을 발견할 수 있었다.
- 해죽순 물 추출물을 전 처리한 후 LPS로 대식세포를 30분간 자극하였다. 이를 분석한 결과 해죽순 물 추출물은 LPS에 의하여 염증이 활성화된 RAW 264.7 세포에서 Iκ-Bα의 분해를 억제하였다. 또한 NF-κB의 활성화 지표인 NF-κB의 핵 내로의 이동을 해 죽순 물 추출물이 억제하였다 (Fig.
- 따라서, 초기 염증 반응 시, 전염증성 사이토카인 및 염증성 매개물질의 조절 및 억제는 염증 반응 및 염증 질환에서 중요하다. 해죽순 물 추출물을 전 처리한 후 LPS로 대식세포를 자극하였을 때, 전염증성 사이토카인 및 염증성 매개 물질이 농도의존적으로 개선되었으며, 이는 해 죽순이 염증 반응 억제에 유효한 반응을 보였음을 보여준다 (Fig. 2-4).
후속연구
- 많은 염증 질환의 치료 약 개발이 더딘 지금, 저비용 고효율의 천연물 소재인 해 죽순을 이용하여 항염증 효과를 처음 보고한 것은 큰 의의가 있다고 생각된다. 추후, 해죽순의 항염증 효과는 염증성 질환 치료 및 예방에 있어서 응용 가치가 높을 것으로 사료되며, 앞으로 동물실험 및 기타 염증 모델에 응용하여 해 죽순의 잠재력을 추가적으로 연구할 가치가 있다고 사료된다.
- -6, TNF-α의 생성을 억제하였음을 보여준다. 해 죽순은 추후 다양한 염증 질환에 응용하여 항염증 질환 및 질병 치료에 응용될 수 있다고 사료된다.
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