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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우리나라에서 가장 경제적으로 큰 손실을 입히고 있는 DNA 바이러스인 megalocytivirus, 그리고 RNA 바이러스인 VHSV에 대해 negatively charged mem-brane을 적용하여 환경수 중에 미량으로 존재하는 바이러스 검출을 위한 보다 편리한 바이러스 농축기법을 개발하고자 하였다. 그리고 농축법의 검출한계 분석 및 VHSV 발생 양식장의 유입수와 사육수에 대한 분석을 실시하여 현장 적용에도 접근하였다.
- 본 연구에서는 어류질병바이러스의 확산에 가장 큰 영향을 미치는 환경에 대한 정확한 이해와 분석을 통하여 그 위험성을 최소화하기 위해, 국내에서 만연하고 있는 megalocytivirus, VHSV을 대상으로 해수 중 바이러스 농축 방법의 최적화 작업 및 그 검출한계점과 바이러스 회수율에 대한 분석을 실시하였다. GF/C와 HA membrane을 사용한 해수 중 바이러스 농축법을 어류질병바이러스인 megalocytivirus와 VHSV를 대상으로 적용하였을 때 회수율이 28.
제안 방법
- 10×PCR buffer 2 μL, 200 μM의 각각의 dNTP, 1 μM의 sense primer와 1 μM 의 antisense primer (Table 1), Taq DNA polymerase (Taq DNA polymerase, Cosmo, Korea) 및 template 1 μL (DNA 및 cDNA)를 첨가한 후 distilled water로 최종액의 volume 이 20 μL가 되도록 했다.
- 2011년 2월에 VHSV에 감염된 제주도, 감포의 넙치 양식장에서 사육수 및 유입수를 채수하여 GF/C+HA membrane을 사용하여 해수를 농축하였으며 분리된 RNA를 대상으로 2-step PCR을 실시하였다. 사육수를 채취한 양식장은 VHSV에 감염된 넙치(10 cm)가 수온 15±0.
- 2011년 2월에 VHSV에 감염된 제주도, 감포의 넙치 양식장에서 사육수 및 유입수를 채수하여 GF/C+HA membrane을 사용하여 해수를 농축하였으며, 분리된 RNA를 대상으로 2-step PCR을 실시하였다. 사육수를 채취한 양식장은 VHSV에 감염된 넙치(10 cm)가 수온 15±0.
- GF와 CHSE-214 cell에서 배양된 megalocytivirus IVS-1 strain과 VHSV의 바이러스 상등액을 바이러스가 존재하지 않는 해수 1 L에 1.00E+01 viral particles/mL 이 되도록 접종하였다. 바이러스를 접종한 해수 1 L를 glass microfiber filters (GF/C, 1.
- Megalocytivirus에 감염된 돌돔으로부터 분리된 IVS-1 isolate의 genomic DNA를, 그리고 VHSV에 감염된 넙치로부터 분리된 VHSV IVa subtype의 cDNA를 각각 template로 하여 1-step PCR (30 cycle)을 각각의 바이러스에 대한 특이적인 primer set와 함께 실시하였다(Table 1). 생성된 PCR product (megalocytivirus의 경우 163 bp, VHSV의 경우 157 bp)를 GeneAllⓇExpin Gel SV kit (GeneAll Biotechnology, Korea)를 사용하여, agarose gel로부터 각각 분리 및 정제하였다.
- PCR 후 증폭 산물은 0.5 μg/μL EtBr (Ethidium Bromide)이 첨가된 2% agarose gel을 이용하고, 1×TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)를 전기영동을 위한 완충액으로 하여 전기영동을 실시하였다.
- coli DH5α 균주에 transformation 시켰다. Plasmid DNA는 GeneAllⓇPlasmid SV Mini kit (GeneAll Biotechnol-ogy, Korea)를 이용하여 plasmid를 분리하여 qPCR을 위한 standard로서 사용하였다.
- 5 μg/μL EtBr (Ethidium Bromide)이 첨가된 2% agarose gel을 이용하고, 1×TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA)를 전기영동을 위한 완충액으로 하여 전기영동을 실시하였다. UV 검출기에서 나타나는 band를 관찰하여 그 증폭여부를 확인하였다.
- cDNA 합성을 위하여 M-MLV reverse transcriptase 1 μL (Promega), 5×buffer 2 μL, dNTP 2 μL, Random hexamer primers 1 μL (Promega), RNasinⓇRibonuclease inhibitor (Promega) 1 μL, extracted total RNA 1 μL을 넣고 total vol-ume이 10 μL이 되게 Nuclease-free water을 첨가한 후, 42℃에서 60분, 99℃에서 5분간 반응시켰다.
- qPCR을 실시하기 위한 조건은 10×buffer 2 μL, 200 μM의 각각의 dNTP, 1 μM의 각각의 primer, Hot start Taq (HS prime Taq DNA polymerase, Genet Bio, Korea) 및 template (시료로부터 추출한 DNA, 준비한 cDNA, 10-fold 씩 희석된 plasmid standard)를 0.2 mL의 tube에 넣은 후 최종적으로 EvaGreen (Biotium, Korea) 1 μL를 첨가하였다.
- 각각 제조사의 pro-tocol에 따라서 DNA와 RNA를 분리하여 50 μL의 TE buffer에 현탁하였다.
- 따라서 본 연구에서는 우리나라에서 가장 경제적으로 큰 손실을 입히고 있는 DNA 바이러스인 megalocytivirus, 그리고 RNA 바이러스인 VHSV에 대해 negatively charged mem-brane을 적용하여 환경수 중에 미량으로 존재하는 바이러스 검출을 위한 보다 편리한 바이러스 농축기법을 개발하고자 하였다. 그리고 농축법의 검출한계 분석 및 VHSV 발생 양식장의 유입수와 사육수에 대한 분석을 실시하여 현장 적용에도 접근하였다.
- 00E+01 viral particles/mL 이 되도록 접종하였다. 그리고 바이러스 농축을 수행하였으며, 농축된 시료로부터 2-step PCR을 사용하여 바이러스 검출을 확인함으로써 negatively charged membrane에 따른 효율을 비교하였다.
- 20E+02 viral particles/mL seawater의 농도로 인위 오염시켰다. 농도별로 바이러스가 오염된 해수 시료를 가장 검출률이 좋았던 GF/C+HA membrane을 사용하여 이중여과 및 농축하였으며, 농축시료 1 mL에 존재하는 viral particles을 qPCR로 정량하여 바이러스 회수율을 산출하였다.
- 농축한 해수 시료 1 mL 중 200 μL을 사용하여 DNA와 RNA 를 각각 분리하였다.
- 농축한 해수 시료에 오염된 megalocytivirus와 VHSV의 정량적분석을 위해 qPCR (Rotor-GeneTM 6000, Corbett Research, AUS)을 실시하였다. qPCR을 실시하기 위한 조건은 10×buffer 2 μL, 200 μM의 각각의 dNTP, 1 μM의 각각의 primer, Hot start Taq (HS prime Taq DNA polymerase, Genet Bio, Korea) 및 template (시료로부터 추출한 DNA, 준비한 cDNA, 10-fold 씩 희석된 plasmid standard)를 0.
- 1B). 따라서 GF/C+CA+HA 또는 GF/C+HA membrane을 사용하였을 때 검출이 가장 잘되는 것을 확인할 수 있었으며, 이후의 실험에서는 GF/C+HA membrane을 사용하여 실험을 실시하였다.
- 바이러스가 존재하지 않는 것으로 확인된 해수 1 L에 배양된 megalocytivirus IVS-1 strain과 VHSV IVa를 각각 1.20E-01 viral particles/mL seawater부터 1.20E+02 viral particles/mL seawater의 농도로 인위 오염시켰다. 농도별로 바이러스가 오염된 해수 시료를 가장 검출률이 좋았던 GF/C+HA membrane을 사용하여 이중여과 및 농축하였으며, 농축시료 1 mL에 존재하는 viral particles을 qPCR로 정량하여 바이러스 회수율을 산출하였다.
- 바이러스를 접종한 해수 1 L를 glass microfiber filters (GF/C, 1.2 μm pore) 와 Negatively charged membrane으로 여과하여 바이러스가 여과막에 흡착되도록 하였다.
- 각각 제조사의 pro-tocol에 따라서 DNA와 RNA를 분리하여 50 μL의 TE buffer에 현탁하였다. 분리된 nucleic acids는 분광 광도계 (BioPho-tometer, Eppendorf)를 사용하여 흡광도 측정으로 A260/A280 nm값을 구하여 DNA와 RNA의 양을 측정하였으며, 실험 전까지 -20℃에서 보관하였다.
- 사육수를 채취한 양식장은 VHSV에 감염된 넙치(10 cm)가 수온 15±0.5℃, 사육수 순환은 16-18 회/day 회전하여 환수하고 있는 10 m×10 m×1 m의 수조에서 양식되고 있었으며, VHSV에 감염되어 누적 폐사율이 50% (입식 후 15일 후) 정도일 때 채수를 실시하였다.
- 사육수를 채취한 양식장은 VHSV에 감염된 넙치(10 cm)가 수온 15±0.5℃, 사육수 순환은 16-18 회/day 회전하여 환수하고 있는 10 m×10 m×1 m의 수조에서 양식되고 있었으며, VHSV에 감염되어 누적 폐사율이 50%(입식 후 15일 후) 정도일 때 채수를 실시하였다.
- Megalocytivirus에 감염된 돌돔으로부터 분리된 IVS-1 isolate의 genomic DNA를, 그리고 VHSV에 감염된 넙치로부터 분리된 VHSV IVa subtype의 cDNA를 각각 template로 하여 1-step PCR (30 cycle)을 각각의 바이러스에 대한 특이적인 primer set와 함께 실시하였다(Table 1). 생성된 PCR product (megalocytivirus의 경우 163 bp, VHSV의 경우 157 bp)를 GeneAllⓇExpin Gel SV kit (GeneAll Biotechnology, Korea)를 사용하여, agarose gel로부터 각각 분리 및 정제하였다. 정제된 DNA를 pGEM-T Easyvecotor (Promega, USA)에 ligation 후 E.
- 정제된 DNA를 pGEM-T Easyvecotor (Promega, USA)에 ligation 후 E. coli DH5α 균주에 transformation 시켰다.
- 준비된 standard DNA를 Quant-iTTMPicoGreenⓇdsDNA Reagent and Kits (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 무게를 측정하고, 이로부터 plasmid copy 값을 결정한 후 DNA virus인 megalocytivirus의 경우 2.00E+05-2.00E+01 copy, 그리고 RNA virus인 VHSV의 경우 5.00E+04-5.00E+00copy로 각각 10-fold 씩 단계 희석하여 표준 검량 곡선을 작성하는데 사용하였다.
- 최적화된 방법의 모색을 위해 GF와 CHSE-214 cell에서 배양된 megalocytivirus IVS-1 strain과 VHSV의 바이러스 상등액을 바이러스가 존재하지 않는 해수 1 L에 1.00E+01 viral particles/mL 이 되도록 접종하였다. 그리고 바이러스 농축을 수행하였으며, 농축된 시료로부터 2-step PCR을 사용하여 바이러스 검출을 확인함으로써 negatively charged membrane에 따른 효율을 비교하였다.
- 해수 농축 방법으로는 Katayama 등(2002) 이 제시한 nega-tively charged membrane (0.45 μm pore)을 사용한 방법을 변형하여 해수 내에 존재하는 바이러스를 농축하고자 하였다.
대상 데이터
- DNA virus인 megalocytivirus와 RNA virus인 VHSV를 각각 grunt fin (GF)와 chinook salmon embryo-214 (CHSE-214) cell line에서 배양하였다. DNA virus인 megalocytivirus의 경우, 본 go연구실에서 2000년 9월에 남해안에서 샘플링한 양식돌돔비장에서 분리한 IVS-1 strain (Jeong et al.
- DNA virus인 megalocytivirus와 RNA virus인 VHSV를 각각 grunt fin (GF)와 chinook salmon embryo-214 (CHSE-214) cell line에서 배양하였다. DNA virus인 megalocytivirus의 경우, 본 go연구실에서 2000년 9월에 남해안에서 샘플링한 양식돌돔비장에서 분리한 IVS-1 strain (Jeong et al., 2003; GenBank accession numbers for ATPase gene : AF487899)을 GF cell에 접종하여 배양하였다. VHSV의 경우 2008년 2월에 감포에서 샘플링한 양식 넙치의 신장조직을 CHSE-214 cell에 접종하여 20℃에서 배양하였다.
- 농축한 해수 시료 1 mL 중 200 μL을 사용하여 DNA와 RNA 를 각각 분리하였다. Viral DNA를 분리하기 위해 AccuPrepⓇGenomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Lorea)을 사용하였으며, Viral RNA를 분리하기 위해서는 RNeasyⓇPlus Mini Kit (QiagenHiden, Germany)를 사용하였다. 각각 제조사의 pro-tocol에 따라서 DNA와 RNA를 분리하여 50 μL의 TE buffer에 현탁하였다.
- VHSV의 경우 2008년 2월에 감포에서 샘플링한 양식 넙치의 신장조직을 CHSE-214 cell에 접종하여 20℃에서 배양하였다. 사용된 VHSV는 G protein gene 분석으로 type IVa로 확인하였다(data not shown).
성능/효과
- 본 연구에서는 어류질병바이러스의 확산에 가장 큰 영향을 미치는 환경에 대한 정확한 이해와 분석을 통하여 그 위험성을 최소화하기 위해, 국내에서 만연하고 있는 megalocytivirus, VHSV을 대상으로 해수 중 바이러스 농축 방법의 최적화 작업 및 그 검출한계점과 바이러스 회수율에 대한 분석을 실시하였다. GF/C와 HA membrane을 사용한 해수 중 바이러스 농축법을 어류질병바이러스인 megalocytivirus와 VHSV를 대상으로 적용하였을 때 회수율이 28.11%, 23.00%로 각각 나타나 KHV에 비하여 우수한 결과를 보여주어 해수 중의 여러 어류 질병바이러스의 검출에도 본 방법을 적용할 수 있음을 입증하였다고 할 수 있다.
- VHSV의 검출한계 농도(1.22E+01 viral particles/mL sea-water)와 IVS-1의 검출한계 농도(1.20E+00 viral particles/mL seawater)를 비교해볼 때 IVS-1의 검출한계 농도에 있어서 IVS-1이 VHSV에 비해 약 10배 높은 민감성을 보였다.
- 20E+01 viral particles/mL seawater이상으로 오염되어 있을 경우 1-step PCR만으로도 전기영동 상에서 IVS-1에 특이적인 band를 확인할 수 있었다. 그리고 1.20E+00~1.20E+02 viral particles/mL seawater의 농도로 IVS-1이 오염된 1 L의 해수를 1 mL 로 농축할 경우, 농축 시료 mL당 각각 3.07E+02, 3.29E+03, 3.76E+04 viral particles의 바이러스가 회수되었으며, 이를 통하여 회수율을 산출하였을 때 25.58%, 27.42%, 31.33%로 나타났다. 즉 1 L의 해수를 사용할 경우 IVS-1에 대한 회수율은 평균적으로 28.
- 2A, Table 2). 그리고 1.22E+01 viral particles/mL이상의 농도로 1 L의 해수에 오염되어 있는 시료를 1 mL로 농축하였을 때 2-step PCR에서 검출이 가능하였으며, 이때 농축시료 1 mL당 3.28E+04, 2.38E+03 viral particles로 나타났다. 이를 통하여 1 L의 해수에 농도별로 접종한 VHSV의 회수율을 산출하였을 때 26.
- 20E+00 viral particles/mL seawater의 시료에서는 2-step PCR에서 검출이 가능하였다. 또한 1 L의 해수 중에 IVS-1이 1.20E+01 viral particles/mL seawater이상으로 오염되어 있을 경우 1-step PCR만으로도 전기영동 상에서 IVS-1에 특이적인 band를 확인할 수 있었다. 그리고 1.
- VHSV에 감염된 넙치사육수 1 L시료를 GF/C+HA membrane을 사용하여 농축할 경우 VHSV를 검출할 수 있었던 반면, GF/C+CA mem-brane을 사용할 경우 검출할 수 없었다. 또한 양식장의 유입수를 대상으로 GF/C+CA membrane과 GF/C+HA membrane을 사용하여 농축 후 바이러스의 오염정도를 분석한 결과 배출수와는 달리 유입수에서는 바이러스를 검출할 수 없었다(Fig. 3).
- 본 연구에 있어 VHSV를 인위적으로 해수에 첨가한 후 GF/C+HA membrane으로 농축하여 결정한 viral particle값에 있어서, nucleic acid 분리 과정 중 RNA의 안정성 및 cDNA합성 수율 문제에 의하여 소실량이 DNA virus에 비하여 높을 수 있으므로 실질적인 VHSV의 양은 본 연구에서 분석된 양보다 높을 가능성이 있다. 또한, 실제로 VHSV에 감염된 넙치양식장의 유입수와 사육수를 대상으로 GF/C+HA membrane을 사용하여 농축 후 바이러스의 오염 정도를 분석한 결과, 유입수에서는 바이러스를 검출할 수 없었으나 사육수에서는 VHSV의 검출이 가능하였다. 그러나 넙치의 VHSV발병 시 감염방법 및 어체의 크기에 따라 누적 폐사율이 일정치 않으며 (Kim et al.
- 본 연구에 있어 VHSV를 인위적으로 해수에 첨가한 후 GF/C+HA membrane으로 농축하여 결정한 viral particle값에 있어서, nucleic acid 분리 과정 중 RNA의 안정성 및 cDNA합성 수율 문제에 의하여 소실량이 DNA virus에 비하여 높을 수 있으므로 실질적인 VHSV의 양은 본 연구에서 분석된 양보다 높을 가능성이 있다. 또한, 실제로 VHSV에 감염된 넙치양식장의 유입수와 사육수를 대상으로 GF/C+HA membrane을 사용하여 농축 후 바이러스의 오염 정도를 분석한 결과, 유입수에서는 바이러스를 검출할 수 없었으나 사육수에서는 VHSV의 검출이 가능하였다.
- 38E+03 viral particles로 나타났다. 이를 통하여 1 L의 해수에 농도별로 접종한 VHSV의 회수율을 산출하였을 때 26.89%, 19.10%로 나타났다. 즉, 본 방법에 의한 평균 VHSV 회수율은 23.
- 10%로 나타났다. 즉, 본 방법에 의한 평균 VHSV 회수율은 23.00% 였으며, 해수 1 L에 존재하는 VHSV의 검출한계는 1.22E+01 viral particles/mL (1 mL로 농축 시 2.38E+03 viral particles) 이었다.
후속연구
- 또한, 실제로 VHSV에 감염된 넙치양식장의 유입수와 사육수를 대상으로 GF/C+HA membrane을 사용하여 농축 후 바이러스의 오염 정도를 분석한 결과, 유입수에서는 바이러스를 검출할 수 없었으나 사육수에서는 VHSV의 검출이 가능하였다. 그러나 넙치의 VHSV발병 시 감염방법 및 어체의 크기에 따라 누적 폐사율이 일정치 않으며 (Kim et al., 2009; Isshiki et al., 2001), 일반적으로 바이러스 감염 시질병의 회복기에는 바이러스의 수중 유출이 매우 감소하므로 (Grant et al., 2011; Totland et al., 1996) 배출구 위치에 대비한 유입구의 위치, VHSV 질병의 진행정도 등을 고려한 보다 정밀한 분석이 필요할 것이며, megalocytivirus 감염 양어장 또한 비교 분석할 필요가 있을 것이다.
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