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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 폴리페놀을 다량 함유하고 있는 유색미를 대상으로 가열처리 온도를 다르게 하여 총 폴리페놀, 총 플라보노이드의 함량 및 항산화 활성에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.
- 본 연구는 일반벼에 비하여 폴리페놀 함량이 뛰어나고 항산화력이 우수한 품종인 홍진주벼와 흑광벼의 총 폴리페놀 함량 및 항산화력 향상을 위한 열처리법 개발을 위하여 수행 되었으며, 우수한 생리활성을 가지고 있는 큰눈벼와 대조품종인 화성벼를 함께 비교 분석하였다. 분석 결과 홍진주벼의 총 폴리페놀 함량은 60°C의 열처리 조건에서 6.
제안 방법
- (+)-catechin hydrate를 표준물질로 사용하여 검량선을 작성하였으며, 추출물의 총 플라보노이드 함량은 시료 100 g 중의 μg (+)-catechin hydrate equivalent(CAE, dry basis)로 나타내었다.
- 각 추출액 100 μL에 2%(w/v) Na2CO3 용액 2 mL를 첨가한 후 3분간 방치시키고 50%(w/v) Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가하였다.
- 각 추출액 250 μL에 증류수 1.25 μL와 5% NaNO2 용액 75 μL를 가하였다.
- 네 가지 품종의 정조를 동일한 조건으로 제현기(Model SY88-TH, Ssangyong Ltd., Incheon, Korea)를 이용하여 현미를 만들었으며, 열처리를 하지 않은 대조군을 제외한 볶음시료는 각 품종별 현미 200 g을 교반기가 장착된 전기 자동 볶음기(JIS-E04, Bangatgan, Seoul, Korea)에 넣고 40, 60, 90, 120, 150 및 180°C로 15분간 볶음처리하여 사용하였다.
- 이 방법은 hydrogen-donating antioxidants와 chain breaking antioxidants 모두를 측정할 수 있고 aqueous phase와 organic phase 모두에 적용이 가능하며 표준물질의 사용으로 추출물간의 상대비교가 가능하다는 장점을 가지고 있다(30). 본 실험에서는 수용성 물질인 ascorbic acid를 사용하여 항산화력을 측정하여 Fig. 3에서와 같이 AEAC 값(mg ascorbic acid/g, dry basis)으로 산출하였다. 큰눈벼와 홍진주벼의 경우에는 DPPH radical을 이용한 방법보다 ABTS radical을 이용한 분석법에서 처리온도 간 차이를 더 잘 보여주었으며, 두 품종 모두 60°C 열처리군에서 유의적으로 높은 ABTS 활성을 나타내었다.
- 본 연구에서는 유색미인 홍진주벼와 흑광벼, 거대배아미인 큰눈벼, 그리고 대조품종으로 사용된 화성벼 등 4품종에 대하여 70% 에탄올을 용매로 추출하였다. 70% 에탄올은 지용성 및 수용성 페놀 물질 모두를 효과적으로 추출할 수 있는 것으로 알려져 있고, 항산화성 물질의 분리 및 항산화 활성의 검색에 주로 사용되고 있으므로 본 실험에서 열처리를 통하여 변화가 예상되는 총 페놀 화합물의 함량 측정에 적합할 것으로 예상되어 선택되었다.
- 열처리 온도에 따라 변화를 보인 항산화 물질이 항산화 활성에 변화를 주는지 확인하기 위하여 원리와 민감도가 다른 다양한 방법으로 항산화력을 분석하였다. 시료의 전자공 여능 측정을 통하여 항산화력을 나타내는 DPPH 라디칼 측정 결과를 Fig.
- 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위하여 Zhishen 등(12)의 방법을 약간 변형시켜 사용하였다. 각 추출액 250 μL에 증류수 1.
- 희석된 ABTS·+용액 1 mL에 추출액 50 μL를 가하여 60분 후에 흡광도의 변화를 측정하였으며, 표준물질로인 L-ascorbic acid를 사용하여 표준곡선을 작성하였다. 총 항산화력은 AEAC(Lascorbic acid-equivalent antioxidant capacity, mg AAE/g dry basis)로 표시하여 시료의 항산화력을 나타내었다.
- 추출물 250 μL에 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6)와 1% potassium ferricyanide를 각각 혼합하여 50°C에서 20분 동안 반응시킨 후 1% trichloroacetic acid(TCA, w/v)를 가하였다.
- 환원력은 활성산소종이나 유리기에 전자를 공여하는 능력을 측정함으로써 항산화 활성을 평가하는 방법(32)인데 본 연구에서는 ABTS 라디칼 소거능에서와 같이 ascorbic acid를 표준물질로 하여 환원력에 대한 AEAC 값(mg ascorbic acid/g, dry basis)을 산출하였다. 환원력의 측정 결과는 Fig.
- 희석된 ABTS·+용액 1 mL에 추출액 50 μL를 가하여 60분 후에 흡광도의 변화를 측정하였으며, 표준물질로인 L-ascorbic acid를 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 시료는 2010년에 농촌진흥청 국립식량과학원에서 생산된 화성벼(Hwaseongbyeo), 큰눈벼(Keunnunbyeo), 홍진주벼(Hongjinjubyeo) 및 흑광벼(Heugkwangbyeo)를 사용하였으며 4°C 저온 저장고에 저장하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계분석은 SPSS(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였고, 분산분석을 실시한 후 Student's t-test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였으며, Pearson correlation analysis(p<0.01)를 이용 하여 변수들 간의 상관관계를 분석하였다.
이론/모형
- 시료의 DPPH 라디칼 소거능은 Tepe 등(13)의 방법에 따라 전자공여능(electorn donating ability, EDA)을 측정하였다. 시료 200 μL에 0.
- 시료의 총 폴리페놀 함량은 Velioglu 등(11)의 방법에 따라 Folin-Ciocalteu reagent가 추출물의 폴리페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 정도를 측정하였다. 각 추출액 100 μL에 2%(w/v) Na2CO3 용액 2 mL를 첨가한 후 3분간 방치시키고 50%(w/v) Folin-Ciocalteu reagent 100 μL를 가하였다.
- 총 항산화력의 측정은 Re 등(14)의 방법에 따라 실시하였다. 7.
- 항산화 활성을 측정하는 데에 있어 DPPH 라디칼 소거능 측정법이 간편하고 빠른 방법이기는 하나 DPPH 라디칼이 빛, 온도 및 pH에 민감한 단점을 가지고 있으므로 비교적 안정한 라디칼을 이용하는 방법인 ABTS cation decolorization assay 방법을 이용하여 항산화 활성을 검색하였다. ABTS cation decolorization assay 법은 총 항산화력을 측정하는 방법으로 potassium persulfate와 반응하여 형성된 짙은 청록색의 ABTS cation 라디칼이 시료의 항산화물질에 의하여 소거되어 탈색되는 정도를 측정하는 방법이다.
- 환원력은 Mau 등(15)의 방법에 따라 측정하였다. 추출물 250 μL에 0.
성능/효과
- 본 연구에서는 유색미인 홍진주벼와 흑광벼, 거대배아미인 큰눈벼, 그리고 대조품종으로 사용된 화성벼 등 4품종에 대하여 70% 에탄올을 용매로 추출하였다. 70% 에탄올은 지용성 및 수용성 페놀 물질 모두를 효과적으로 추출할 수 있는 것으로 알려져 있고, 항산화성 물질의 분리 및 항산화 활성의 검색에 주로 사용되고 있으므로 본 실험에서 열처리를 통하여 변화가 예상되는 총 페놀 화합물의 함량 측정에 적합할 것으로 예상되어 선택되었다. 각 품종별(화성벼, 큰눈벼, 홍진주벼, 흑광벼) 현미에 대하여 70% 에탄올 추출 후 동결 건조 한 시료에 대하여 추출수율을 Table 1에 나타내었는데, 무처리군과 열처리군 모두에서 큰눈벼의 추출수율이 가장 높았고(3.
- 각 품종별(화성벼, 큰눈벼, 홍진주벼, 흑광벼) 현미에 대하여 70% 에탄올 추출 후 동결 건조 한 시료에 대하여 추출수율을 Table 1에 나타내었는데, 무처리군과 열처리군 모두에서 큰눈벼의 추출수율이 가장 높았고(3.21∼4.39%), 그 다음 흑광벼(3.32∼3.67%), 홍진주 벼(2.79∼3.11%)의 순이었으며 대조품종인 화성벼의 경우 가장 낮은 수율(1.92∼2.22%)을 보였다.
- 페놀성 화합물은 항산화 효과를 나타내는 대표적인 화합물로 열처리에 따른 페놀성 화합물의 증가로 인하여 전체적인 항산화 활성이 증가한 것으로 생각되며, 항산화력 측정에 사용되었던 세 가지 항산화력 측정법에서 결과가 조금씩 다른 경향을 보이는 것은 각각의 분석법에 사용된 기질의 특성이 다르고 기질이 추출물에 존재하는 항산화 물질과 반응하는 결합정도가 달라 라디칼 제거능력에 차이를 보이기 때문으로 생각된다. 그러나 세 가지 방법 간의 상관관계 분석 결과에서 볼 수 있듯이 ABTS 분석 결과는 DPPH 분석 결과와 R2=0.972,환원력과는 R2=0.925의 높은 상관성을 보였고 DPPH법과 환원력 측정값도 앞의 두 가지 방법에는 미치지 못하지만 R2=0.893의 유의적인 상관성을 나타내었다.
- 89 mg GAE/g의 총 폴리페놀 함량을 나타내어 안토시아닌 및 탄닌 계열 색소를 다량 함유하고 있는 유색미가 일반미에 비하여 3∼5배 정도 높은 총 폴리페놀 함량을 보인다는 기존의 연구 결과(16)와 유사하였다. 대조품종인 화성벼에서는 온도처리에 대한 총 폴리페놀 함량의 변화가 적은 반면, 화성벼를 제외한 모든 품종의 시료에서는 열처리를 통하여 총 폴리페놀 함량의 변화를 나타내었는데, 흑광벼와 홍진주벼의 경우 열처리를 통하여 증가된 총 폴리페놀 함량값이 항산화력이 우수한 식품으로 알려져 있는 블루베리(5.60 mg GAE/g), 블랙베리(4.9 mg GAE/g)의 총 폴리페놀 함량(17)보다 더 높았다. 특히 홍진주벼의 경우 150°C를 제외한 모든 열처리 온도에서 무처리군에 비하여 높은 총 폴리페놀 함량을 보였으며 대부분 통계적 유의성이 있었다(p<0.
- 89 mg GAE/g(대조군의 약 20%)의 높은 총 폴리페놀의 함량을 나타내었다. 또한 열처리를 실시한 시료에 대한 총 플라보노이드 함량 및 항산화 활성의 변화는 상관관계 분석에 있어서도 총 폴리페놀 함량 분석 결과와 상당히 높은 상관관계를 가지는 것을 확인하였다. 지금까지의 많은 연구결과에 따르면 열처리에 따른 반응은 식물의 종류 및 열처리 방법에 따라 상당히 큰 차이를 나타내므로 본 실험에서 사용한 열처리 방법을 통하여 홍진주벼 및 흑광벼의 항산화력이 상당히 증가되었던 연구 결과는 매우 의미 있는 것으로 생각된다.
- 또한 흑광벼는 모든 열처리군에서 무처리군에 비해 높은 플라보노이드 함량의 증가를 보였고, 홍진주벼에서와 마찬가지로 40°C의 열처리 온도에서 약 35%의 상당한 플라보노이드 함량의 증가를 보였다가 40°C 이상의 온도에서는 함량이 다소 감소하는 경향을 보였다.
- 본 연구에 사용된 홍진주벼와 흑광벼 무처리군 또한 87.7%, 83.4%의 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 보여주었고 이 값은 180°C로 열처리 하였을 때 각각 89%, 85.5%로 유의성 있게 증가하였다(p<0.05).
- 분석 결과 홍진주벼의 총 폴리페놀 함량은 60°C의 열처리 조건에서 6.50±0.32 mg GAE/g(대조군의 약 23%)으로 가장 높았고, 흑광벼는 40°C와 180°C의 열처리 조건에서 각각 6.57 mg GAE/g(대조군의 약 14%)과 6.89 mg GAE/g(대조군의 약 20%)의 높은 총 폴리페놀의 함량을 나타내었다.
- 쌀 관련 소재에 대한 열처리 연구에는 Lee 등(31)과 Lee 등(19)의 연구가 있는데, Lee 등(31)의 연구에서는 볶음 조건 및 침출 시간을 달리하여 제조한 발아벼차에서 볶음 온도와 시간이 증가할수록 발아벼 침출 차에서의 총 항산화력이 증가하였다고 하였고, Lee 등(19)의 연구에서는 쌀의 왕겨를 far-infrared radiation(FIR) 처리하여 메탄올로 추출하였을 때 일반 오븐을 이용하여 열처리 하였을 때보다 높은 항산화력을 가지는 것은 물론 다양한 페놀릭 구성 성분을 나타냈다고 하였다. 이러한 연구 결과와 본 연구 결과를 종합하여 볼 때 식품에 존재하는 결합형의 페놀 화합물을 효과적으로 유리시켜 높은 항산화력을 얻기 위해서는 효율적인 열처리 방법을 이용하고 식품 형태 및 성분에 적합한 열처리 온도와 시간 등 조건에 대한 사전조사가 중요하다는 것을 알 수 있다.
- 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량에 있어 모든 열처리군에서 높은 값을 나타내었던 흑광벼는 환원력 측정 결과에서는 180°C로 고열처리 한 경우에서만 유의성 있는 결과를 보였고 다른 온도에서는 온도차에 따른 소폭의 변화만 나타내었다.
- 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량과 환원력 과의 상관관계 분석에 있어서는 각각 R 2=0.924, R 2=0.916(α =0.01)의 비교적 높은 상관관계를 나타내었으나 환원력 측정법이 DPPH나 ABTS 라디칼 소거능 측정법에 비해 그 상관성이 다소 떨어지는 결과를 보였다.
- 추출물들의 총 플라보노이드 함량은 유색미인 홍진주벼(134.35∼187.08 mg CAE/100 g), 흑광벼(141.75∼190.79 mg CAE/100 g)에서 화성벼(22.17∼36.51 mg CAE/100 g)보다 최대 8배 이상의 높은 함량을 보였다.
- 큰눈벼와 홍진주벼의 경우에는 DPPH radical을 이용한 방법보다 ABTS radical을 이용한 분석법에서 처리온도 간 차이를 더 잘 보여주었으며, 두 품종 모두 60°C 열처리군에서 유의적으로 높은 ABTS 활성을 나타내었다.
- Browning reaction으로 알려진 Maillard 반응은 고온의 조건에서 환원 당과 단백질 성분이 결합하여 진행되는데, Maillard 반응의 중간 산물들은 색과 냄새뿐 아니라 총 폴리페놀 물질의 생성을 촉진하는 것으로 보고되어 있다(8,20). 큰눈벼와 화성벼는 모든 열처리 온도에서 무처리군보다 낮은 환원력을 나타내었는데, 특히 큰눈벼는 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 분석 결과에서 대조품종인 화성벼에 비하여 높은 함량을 나타내었으나 항산화력의 측정 결과에서는 화성벼보다 낮은 활성을 보였다. 이것은 큰눈벼의 배아에 다량 함유되어 있는 비타민이나 아미노산 등의 성분이 총 폴리페놀 측정에 사용되었던 Folin-Ciocalteu 시약과 반응하여 실제 존재하는 총 폴리페놀 함량보다 높게 측정되었을 가능성이 있어(27) 정확한 원인 규명을 위해서는 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정을 위한 다른 시험법을 함께 시행하여 비교해 보아야 할 것으로 생각된다.
- 큰눈벼의 경우 60°C로 열처리를 하였을 때 18%, 흑광벼와 화성벼는 40°C로 열처리를 하였을 때에 각 품종의 무처리군에 비하여 약 11%와 6%의 추출수율의 향상을 보였으며, 홍진주벼의 경우에는 온도변화에 따른 추출수율의 증가폭이 매우 작았다.
- 항산화 성분과 항산화 활성과의 상관성 분석에 있어서는 ABTS 라디칼 소거능을 이용한 분석 값이 총 폴리페놀(R2=0.994, α=0.01) 및 총 플라보노이드 함량(R2=0.984, α=0.01)과 가장 높은 상관관계를 가지고 있었고, DPPH 라디칼 소거능을 이용한 항산화력 역시 총 폴리페놀(R2=0.963, α=0.01) 및 총 플라보노이드(R2=0.944, α=0.01)와 밀접한 상관관계에 있었다(Table 2).
- 환원력의 측정 결과는 Fig. 4에서와 같이 홍진주벼의 활성이 가장 높았는데, 특히 90°C로 열처리 하였을 때에 환원력이 가장 많이 증가하였으며 90°C보다 더 높은 온도로 가열하였을 때에는 환원력이 급격히 감소하여 열처리를 하지 않은 무처리군보다 낮은 항산화력을 나타내었다.
- 흑광벼의 경우에도 모든 열처리 온도 조건에서 무처리군에 비하여 총 폴리페놀의 함량이 증가되는 것으로 관찰되었으나, 특히 40°C와 180°C의 열처리군에서 무처리군 대비 15%, 20%의 유의적인 증가율을 보였다.
후속연구
- 지금까지의 많은 연구결과에 따르면 열처리에 따른 반응은 식물의 종류 및 열처리 방법에 따라 상당히 큰 차이를 나타내므로 본 실험에서 사용한 열처리 방법을 통하여 홍진주벼 및 흑광벼의 항산화력이 상당히 증가되었던 연구 결과는 매우 의미 있는 것으로 생각된다. 따라서 향후 본 실험에서 확인된 열처리 효과를 바탕으로 다양한 열처리 방식, 온도 및 열처리 시간에 대한 연구를 추가적으로 진행한다면 더욱 효율적으로 유리형의 폴리페놀 함량을 높일 수 있을 것으로 생각되며, 이러한 결과를 통해 유색미를 식품산업에 이용할 수 있는 다양한 방안을 마련할 수 있을 것으로 생각된다.
- 한편 Grape seed flour에 대한 열처리 효과를 보고한 Ross 등(21)의 연구결과에 따르면 catechin 및 epicatechin이 120°C까지의 열처리에서는 비교적 안정적이었으나 150°C 이상에서는 온도에 비례하여 감소하였고, gallic acid 함량은 오히려 가열온도에 비례적으로 증가함을 보였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 열처리에 의한 총 폴리페놀 함량의 변화는 그 식품을 구성하고 있는 구성 페놀산의 열반응성에 따라 달라지는 것으로 예측할 수 있으며, 따라서 본 연구에서 쌀을 열처리 하였을 때 나타난 폴리페놀 함량의 변화를 정확히 규명하기 위해서는 각각의 열처리 된 시료들로부터 결합형, 유리형 페놀화합물을 추출하여 각 페놀산의 구성비를 비교해 보아야 할 것으로 생각된다. 또한 유색미인 홍진주벼와 흑광벼가 열처리 온도에 따라 총 폴리 페놀 함량의 변화율에 있어 서로 다른 값을 보이는 것은 탄닌 성분을 주요 색소성분으로 하는 홍진주벼와 다양한 안토시아닌 색소로 이루어진 흑광벼의 품종간 변이에 따라 열처리 조건에 대한 품종간의 반응이 다르기 때문인 것으로 생각된다.
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